Summary
Apresentamos um protocolo que pode ser usado para realizar testes terapêuticos com organoides de câncer de ovário derivados de pacientes.
Abstract
O câncer de ovário é um câncer ginecológico fatal e a quinta principal causa de morte por câncer entre as mulheres nos Estados Unidos. O desenvolvimento de novos tratamentos medicamentosos é crucial para o avanço dos cuidados de saúde e para a melhoria dos resultados dos pacientes. Os organoides são órgãos em miniatura tridimensionais multicelulares in vitro. Modelos organoides derivados de pacientes (DOP) de câncer de ovário podem ser ideais para rastreamento de drogas porque recapitulam com mais precisão os tecidos de interesse do que modelos de cultura de células bidimensionais e são baratos em comparação com xenoenxertos derivados de pacientes. Além disso, as DOPs do câncer de ovário imitam o microambiente tumoral variável e o fundo genético tipicamente observados no câncer de ovário. Aqui, descreve-se um método que pode ser usado para testar drogas convencionais e novas em DOPs derivadas do tecido do câncer de ovário e ascite. Um ensaio de trifosfato de adenosina (ATP) baseado em luminescência é usado para medir a viabilidade, a taxa de crescimento e a sensibilidade a drogas. As triagens de drogas em DOPs podem ser concluídas em 7-10 dias, dependendo da taxa de formação de organoides e tratamentos medicamentosos.
Introduction
Apesar de raro, o câncer de ovário é um dos cânceres ginecológicos mais letais 1,2. Um desafio no desenvolvimento de novos tratamentos é que o câncer de ovário é heterogêneo, e o microambiente tumoral difere muito entre as pacientes. Além disso, muitos cânceres de ovário desenvolvem resistência à quimioterapia à base de platina e aos inibidores da polipolimerase (ADP-ribose), evidenciando a necessidade de maiores opções terapêuticas 3,4,5.
Uma abordagem que pode ser útil na identificação de novas terapêuticas é o uso de organoides derivados do paciente (PDOs). Os organoides são aglomerados tridimensionais de múltiplos tipos celulares que se auto-organizam e formam "mini-órgãos" in vitro6,7,8,9,10. Os organoides podem recapitular importantes morfologias teciduais e perfis de expressão gênica11,12. Alguns dos primeiros organoides foram derivados de células cancerosas intestinais, gástricas e de cólon de camundongos e humanos 8,9,13. Culturas organoides de vida longa foram estabelecidas a partir de uma ampla gama de tecidos benignos e malignos, incluindo bexiga, cólon, estômago, pâncreas, cérebro, retina e fígado 14,15,16. Demonstramos previamente métodos para estabelecer DOPs a partir de tumores de câncer de ovário e amostras deascite17. As DOPs podem ser usadas para estudar características moleculares, mecanismos celulares e novos tratamentos medicamentosos 18,19,20. As DOPs têm várias vantagens sobre as culturas de células primárias bidimensionais tradicionais para triagem de drogas. Embora as culturas primárias bidimensionais sejam um método de baixo custo para triagem de drogas, as culturas de células primárias são do tipo unicelular e carecem da arquitetura tridimensional dos tumores 21,22,23. No entanto, as DOPs são um recurso precioso, e protocolos custo-efetivos são necessários para otimizar seu uso na triagem terapêutica de medicamentos.
Este artigo descreve um método in vitro para usar PDOs de câncer de ovário para testar os efeitos de drogas conhecidas ou candidatas. Enquanto as atuais telas de medicamentos de médio e alto rendimento usando DOPs requerem instrumentos de dispensação automatizados caros 24,25,26, esse método custo-efetivo usa suprimentos laboratoriais básicos prontamente disponíveis e um ensaio de viabilidade celular baseado em ATP em um formato padrão de placa de 96 poços (Figura 1A). Este método facilitará testes preliminares de novas drogas contra o câncer de ovário antes da expansão para telas maiores27,28. Embora as DOPs de câncer de ovário sejam usadas aqui, este método pode ser aplicado a outros modelos organoides de câncer.
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Protocol
A coleta de espécimes humanos para esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Revisão Institucional da Escola de Medicina da Universidade de Washington. Todas as pacientes elegíveis com idade superior a 18 anos tinham diagnóstico ou presunção de câncer seroso de ovário de alto grau e estavam dispostas e capazes de fornecer consentimento informado. O tecido tumoral de sítio primário ou metastático, além de ascite e líquido pleural, foi obtido dos pacientes consentidos no momento do atendimento.
1. Seleção de DOP estabelecidas para ensaio de viabilidade
NOTA: Normalmente, esses organoides estão dentro das cinco primeiras passagens. Como descrito anteriormente, as DOPs de câncer de ovário são formadas pela ressuspensão da suspensão de células primárias em extrato de membrana basal (BME), como Cultrex ou Matrigel17 (ver Tabela de Materiais).
- As DOPs devem ter um tempo de duplicação percebido de 24-72 h para a melhor eficiência do ensaio. Estime o tempo de duplicação percebido determinando visualmente o número de dias necessários para que os organoides se formem após a passagem/plaqueamento.
NOTA: Em nossa experiência, organoides que levam mais de três dias para se formar não podem ser usados para este ensaio de inibição do crescimento. - Identifique drogas e selecione uma faixa de concentrações a serem testadas (por exemplo, Carboplatina, 0-50 μM, consulte Tabela de Materiais).
- Determine a configuração da placa. Este ensaio será realizado em triplicata, limitando o número de fármacos e concentrações que podem ser testados em uma placa.
NOTA: As linhas PDO selecionadas devem ser cuidadosamente observadas antes de realizar o ensaio. As DOPs estabelecidas do câncer de ovário formam esferas sólidas e ocas multicelulares com formas de brotamento semelhantes a tumores (Figura 1B). A morfologia da DOP, o perfil genômico, etc., devem ser comparados com o da amostra de pacientes (quando possível) antes da realização do ensaio29-33. As DOPs de câncer de ovário podem ser geradas a partir de amostras de tumores primários, metastáticos eascite17.
2. Preparação do reagente para o ensaio de viabilidade
- Meios Base: Para DMEM/F12 avançado, adicionar 1% (v/v) penicilina-estreptomicina, 1x glutamax e 1% (v/v)HEPES17 (ver Tabela de Materiais).
- Prepare Advance Organoid Media para organoides de câncer de ovário após relatório publicado anteriormente17.
3. Chapeamento de organoides (~Dia -2)
NOTA: Esta etapa deve ser realizada 1-3 dias antes da adição dos medicamentos. Antes de começar, aqueça todos os reagentes (Base Media, Advance Organoid Media e reagente de dissociação organoide; ver Tabela de Materiais) a 37 °C em banho-maria. Descongele o BME em um banho de água gelada.
- Use um microscópio de campo claro para confirmar se os organoides de interesse são 70%-90% confluentes.
NOTA: Recomenda-se salvar imagens dos organoides para referência futura. - Adicionar 1-2 mL de meio base aquecido ao poço contendo organoides e pipetar para cima e para baixo para dissociar mecanicamente os organoides contendo EMB. Transferir toda a solução para um tubo cônico de 15 mL17.
NOTA: Normalmente, 1-2 mL de mídia é suficiente para diluir corretamente a BME. Organoides do mesmo paciente e passagem podem ser combinados. - Vórtice por 5-10 s para dissociar ainda mais as células e centrifugar a 1107 x g por 5 min à temperatura ambiente (TR).
- Retire o sobrenadante com uma pipeta de canal único e descarte. Ressuspender organoides em 1 mL de reagente de dissociação organoide (ver Tabela de Materiais) e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Incubar durante 7 min a 37 °C.
- Se o pellet ainda for gelatinoso por causa da EMB restante, adicione mais 1 mL de Meio Base, vórtice por 5-10 s e repita a centrifugação.
- Centrifugar a 1107 x g por 5 min em RT. Retire e descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet de células em 1 mL de Meio Base.
- Conte o número de células em cada cultura de DOP usando um contador automático de células (ver Tabela de Materiais) ou um hemocitômetro.
- Ressuspender células a 20.000 células por 10 μL de 25% de Meio Base e 75% de EMB. Faça isso ressuspendendo os organoides na mídia e misturando com BME.
- Colocar uma gotícula de 3 μL de BME ressuspendida + células DOP em um poço de uma placa preta opaca de 96 poços (ver Tabela de Materiais). Coloque as gotículas no centro de cada poço. Placa cada concentração de droga em triplicata.
NOTA: Como o ensaio de viabilidade celular é baseado em luminescência, é melhor usar placas opacas pretas para evitar o plano de fundo. Placas transparentes podem ser usadas para visualizar organoides durante o ensaio, mas o fundo das placas deve ser coberto com fita opaca antes de medir a luminescência. - Incubar a placa em estufa de cultura celular a 37 °C durante 15 min.
- Adicione 100 μL de Advance Organoid Media a cada poço. Incubar a placa por 24-72 h (determinar de acordo com o tempo de duplicação da DOP percebido). Adicione 100 μL de Advance Organoid Media a um poço vazio para uso em branco.
NOTA: O objetivo é permitir a formação de organoides. - Opcional: Para análise da taxa de crescimento, placa adicional triplicar DOPs em uma placa separada. Este será utilizado para contar células no Tempo = 0 e deverá ser ensaiado no Dia 0 utilizando o ensaio de viabilidade descrito na secção 5.
4. Adição de fármacos para o ensaio de viabilidade no Dia 0
NOTA: Dia 0 refere-se ao dia em que as drogas são adicionadas aos organoides totalmente formados.
- Diluir os fármacos selecionados em Meio Organoide Avançado para as concentrações desejadas. As diluições podem ser feitas em tubos de 1,5 mL ou em uma placa pré-configurada de 96 poços, o que permitiria o uso de uma pipeta multicanal para dispensar o meio.
OBS: Os medicamentos devem ser ressuspensos no solvente sugerido pelo fabricante, como o dimetilsulfóxido. Para este estudo, foram feitas as seguintes diluições de carboplatina em Meio Organoide Avançado: 1, 5, 10, 25, 50 e 75 μM. - Retire o meio de cada poço com uma pipeta de canal único ou multicanal, tomando cuidado para não tocar ou perturbar a gota DOP/BME.
- Adicione 100 μL de Advance Organoid Media e a(s) droga(s) desejada(s) a cada poço. Certifique-se de adicionar mídia fresca aos três poços de controle.
NOTA: As concentrações dos fármacos variam e dependem da questão científica e do mecanismo de ação do fármaco. Ao decidir quais concentrações usar, começamos com concentrações de drogas previamente estabelecidas em linhagens celulares 2D comparáveis (por exemplo, linhagens de células de câncer de ovário imortalizadas). As concentrações podem precisar ser aumentadas se não houver nenhum efeito observado sobre os organoides. - Atualize os meios e os medicamentos conforme necessário (repita os passos 4.1-4.3). Se a mídia precisará ser atualizada depende da duração do ensaio, da atividade biológica da droga e da meia-vida da droga. Para ensaios ao longo de uma semana, a mídia precisará ser atualizada pelo menos uma vez.
5. Finalizando o ensaio de viabilidade para leitura (~Dia 7)
NOTA: Esta etapa pode ser executada nos dias 7-10. A duração do ensaio deve ser determinada de acordo com a meia-vida e a farmacodinâmica dos fármacos a serem testados.
- Permitir que os reagentes do ensaio de viabilidade atinjam a temperatura ambiente no escuro. Conservar os reagentes a 4 °C durante a noite (no escuro) para reduzir o tempo de descongelamento.
- Retire a placa de ensaio da incubadora de cultura celular e deixe-a aclimatar-se à temperatura ambiente por 30 min. A placa não precisa se aclimatar no escuro.
- Adicionar 100 μL de reagente de ensaio de viabilidade (ver Tabela de Materiais) a cada poço (para um volume total de 200 μL) e colocar num agitador de placas durante 5 minutos (80 rpm). Retire a placa do agitador e incube por mais 25 minutos à temperatura ambiente. Certifique-se de que a placa está sempre protegida da luz, cobrindo-a com papel alumínio ou uma caixa opaca.
- Ligue o leitor de placas de bioluminescência e abra o software i-control (consulte Tabela de Materiais).
- Em Conectar a: Nome do Instrumento, selecione infinito 200Pro.
- Selecione Luminescência e Script padrão.
- No menu suspenso, escolha o tipo de placa [BD96fb_Falcon-BD] Falcon 96 Flat Black.
- Determine quais poços ler e destaque os poços correspondentes sob Parte da Placa.
- Em Medidas no lado esquerdo da tela, arraste e solte Luminescência sob a Parte da placa.
- Selecione os parâmetros de luminescência: Atenuação: NENHUM; Tempo de integração: 1000 ms; Tempo de liquidação: 0 ms.
- Retire a tampa da placa e carregue-a no leitor de placas. Pressione Iniciar para começar.
- Ao concluir, exporte dados e salve.
6. Análise dos dados
- Calcule a porcentagem de viabilidade celular.
- Subtraia o "Branco" de cada poço para as leituras em Branco Corrigido. Em seguida, calcule a média de controle pela média dos três poços de controle.
- Use a seguinte equação para calcular a porcentagem de células viáveis em cada poço: (Poço experimental / Média de controle) x 100
- Representar graficamente os dados resultantes no software de análise (ver Tabela de Materiais).
- Examine as métricas da Taxa de Crescimento (GR).
- Calcule manualmente as métricas de RG de acordo com o relatório publicado34.
- Como alternativa, use a calculadora de GR on-line (consulte Tabela de Materiais) para gerar as métricas35. Use as medições do Dia 0 como "cell_count_time0", que refletem a taxa de crescimento das DOPs não tratadas.
- Exportar dados e gráficos.
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Representative Results
Esses resultados ilustram a resposta de duas DOPs ao quimioterápico carboplatina, utilizado no tratamento do câncer de ovário. Os organoides foram derivados de biópsia tumoral (DOP #1) e de ascite (DOP #2). Esses organoides foram selecionados com base em seu tempo de duplicação percebido (1-2 dias) e aparência morfológica (formação de muitos organoides grandes). Tanto a DOP #1 quanto a DOP #2 foram plaqueadas no Dia -2, na passagem dois, e a carboplatina foi adicionada no Dia 0. Foram testadas as seguintes concentrações de carboplatina diluídas em meio organoide avançado: 1, 5, 10, 25, 50 e 75 μM. Ao final do experimento, no 7º dia, o reagente do ensaio de viabilidade foi adicionado à placa e os resultados foram analisados. A Figura 2A mostra a porcentagem de células vivas após o tratamento com carboplatina.
Em seguida, utilizou-se a Calculadora GR on-line para análise dos dados. Na ausência de dados de contagem celular, foram utilizados os valores de luminescência medidos no ensaio de viabilidade. Após a exportação das métricas de RG, foram grafados os valores de RG, que são as razões entre as taxas de crescimento percebidas em condições tratadas e não tratadas normalizadas para uma única divisão celular34. Esses valores foram então plotados contra as concentrações de carboplatina (Figura 2B). A Tabela 1 resume as métricas de RG, incluindo os respectivos tempos de duplicação celular controle e tratado e a Área ao Longo da Curva de RG (GRAOC), que integra a curva dose-resposta ao longo de uma faixa de concentrações de carboplatina testadas34. A sensibilidade a um determinado fármaco pode ser determinada interpretando-se o valor de GR50 , correspondente à concentração na qual o fármaco tem um efeito metade-máximo. Por exemplo, o valor de GR50 para a DOP #1 é muito maior do que para a DOP #2 (4,85 μMvs. 0,97 μM), indicando que a DOP #1 é mais resistente à quimioterapia com platina do que a DOP #2.
Figura 1: Organoides derivados do paciente antes da triagem medicamentosa. (A) Delineamento experimental para triagem de fármacos DOP. Dado o tempo de duplicação da linha DOP e o tempo de exposição ao medicamento, o plano experimental pode precisar ser ajustado. (B) Imagens representativas de campo claro (40x) de duas linhas de DOP de câncer de ovário (#1 e #2). Barra de escala = 50 μm. Abreviações: DOP = organoides derivados do paciente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Resultados representativos da DOP do câncer de ovário após o tratamento com carboplatina. (A) Duas linhagens de DOP foram tratadas com concentrações crescentes de carboplatina por sete dias. O eixo X mostra a concentração de carboplatina; o eixo Y exibe a % de células vivas normalizadas para controlar organoides (sem carboplatina). Os ensaios foram completados em triplicata com duas repetições biológicas. As barras de erro indicam o desvio padrão. (B) Gráfico do valor do RG representando a concentração logarítmica de carboplatina (Eixo x) e o valor do RG (Eixo Y). Esses valores foram gerados na calculadora online de GR. As barras de erro indicam o desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tratamento | Tempo de duplicação da célula de controle | Tempo de duplicação celular tratado | GR50 | GR_AOC | |
| DOP #1 | Carboplatina | 0.744 | 0.112 | 4.85 | 1.28 |
| DOP #2 | Carboplatina | 0.972 | 0.0532 | 0.97 | 1.51 |
Tabela 1: Tabela com os valores de tempo de duplicação da célula controle, tempo de duplicação da célula tratada, GR50 e GR_AOC gerados na calculadora de RG. Abreviações: DOP = organoides derivados do paciente, GR = taxa de crescimento GR_AOC = área da taxa de crescimento ao longo da curva.
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Discussion
Este artigo descreve um método que pode ser usado para avaliar os efeitos terapêuticos de drogas convencionais ou novas sobre as DOPs de câncer de ovário. Os pesquisadores devem considerar várias questões antes de conduzir o ensaio de viabilidade no modelo DOP.
Primeiro, ao selecionar uma DOP para uso no ensaio de viabilidade, deve-se determinar o tipo de organoide ideal (tumor vs. ascite) e o número de passagem para suas necessidades. Em nossa experiência, as DOPs derivadas da ascite crescem mais rapidamente e são mais fáceis de gerar do que as DOPs derivadas do tumor. Como este ensaio depende da taxa de crescimento, usar organoides que levam muito tempo para se formar/crescer pode ser difícil. Só usamos com sucesso linhas DOP com tempos de duplicação inferiores a 4 dias.
Em segundo lugar, placas pretas opacas de 96 poços foram usadas neste estudo. Como o ensaio de viabilidade de ATP é baseado em luminescência, poços transparentes reduzirão a intensidade do sinal e gerarão contaminação do sinal. Placas de fundo transparentes de paredes opacas permitem a visualização de organoides durante o ensaio e podem ajudar a monitorar as mudanças induzidas pelo tratamento na morfologia celular. Embora seja uma força relacionada ao custo, uma limitação deste ensaio é a utilização de uma placa de 96 poços, o que limita o número de amostras e fármacos que podem ser avaliados simultaneamente.
Terceiro, o número de células plaqueadas deve ser cuidadosamente considerado e otimizado para ensaios de viabilidade. Isto é especialmente verdadeiro devido à taxa de crescimento variável das linhas DOP; Poucas células não formarão organoides, e muitas células levarão ao crescimento excessivo de organoides. Para garantir a distribuição uniforme das células, um contador automático de células foi utilizado e manteve a mesma relação EMB/mídia (75:25). Essa alta porcentagem de EMB garante que as gotículas permaneçam solidificadas durante todo o ensaio. Aqui, gotículas de 3 μL de EMB foram colocadas no centro do poço. Embora o tamanho da gota possa ser aumentado, alertamos contra o revestimento de todo o poço. O revestimento de todo o poço fará com que os organoides se estabeleçam nas bordas do poço, o que impedirá seu crescimento geral e afetará os resultados do ensaio de viabilidade. A colocação fora do centro da gotícula é boa, desde que não toque nas bordas do poço.
Em quarto lugar, a autopipetagem introduz erro humano, mas isso pode ser superado pela atenção aos detalhes e pela inclusão de poços de controle adicionais.
Finalmente, a duração do ensaio deve ser cuidadosamente selecionada. A exposição prolongada a drogas afetará a viabilidade das DOP, independentemente do mecanismo de ação da droga. Por esta razão, é importante testar uma gama de concentrações do fármaco durante um mínimo de cinco dias. É importante decidir se os meios de comunicação precisarão ser trocados por períodos mais longos, pois níveis reduzidos de fatores de crescimento impedirão os efeitos das drogas36. Para examinar se a mídia precisará ser alterada durante o ensaio, é preciso comparar os resultados dos controles do Dia 0 e do Dia 7. Os controlos DOP não tratados devem continuar a crescer ao longo do ensaio continuamente.
À medida que as DOPs continuam a avançar em complexidade e a recapitular melhor seus tecidos de origem, seu uso deve melhorar a descoberta de drogas. No entanto, é provável que as DOPs continuem sendo um recurso precioso e exijam métodos econômicos para preservar e otimizar seu uso. Ao contrário das técnicas de médio e alto rendimento, este protocolo pode ser usado para testar compostos conhecidos e novos a um custo mais baixo com materiais e equipamentos prontamente disponíveis. Finalmente, este método pode ser facilmente adaptado a diferentes modelos organoides de câncer.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional do Câncer dos Institutos Nacionais de Saúde sob o Prêmio Número R01CA243511. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do National Institutes of Health. Os autores agradecem a Deborah Frank por seus comentários editoriais.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Plastic Tubes | |||
| 15 mL Plastic Tubes | |||
| 96 well Flat Black Plates | MidSci | 781968 | |
| Advance Organoid Media | see Graham et al 2022 (Jove) | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher | 12634028 | |
| Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | |
| Brightfield Microscope | |||
| Carboplatin | Teva Pharmaceuticals USA | NDC 00703-4246-01 | |
| CellTiter-Glo 3D Viability | Promega | G9681 | |
| Cultrex | R & D Systems | 3533-010-02 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| GR Calculator | http://www.grcalculator.org | Online calculator | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. | ||
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Plate Rocker | |||
| Sterile P10, P200, and P1000 Barrier Sterile Pipette Tips | |||
| Sterile P10, P200, and P1000 Pipettes | |||
| Tecan Infinte 200Pro Plate Reader; i-Control Software | Tecan | ||
| TrypLE | Thermo Fisher | 12605010 | Organoid dissociation reagent |
References
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