Summary
Vi præsenterer en protokol, der kan bruges til at udføre terapeutisk lægemiddeltest med patientafledte organoider for kræft i æggestokkene.
Abstract
Kræft i æggestokkene er en dødelig gynækologisk kræft og den femte førende årsag til kræftdød blandt kvinder i USA. Udvikling af nye lægemiddelbehandlinger er afgørende for at fremme sundhedsplejen og forbedre patientresultaterne. Organoider er in vitro tredimensionelle multicellulære miniatureorganer. Patientafledte organoidmodeller (BOB) af kræft i æggestokkene kan være optimale til lægemiddelscreening, fordi de mere præcist rekapitulerer væv af interesse end todimensionelle cellekulturmodeller og er billige sammenlignet med patientafledte xenotransplantater. Derudover efterligner ovariecancer BDO'er det variable tumormikromiljø og genetiske baggrund, der typisk observeres i kræft i æggestokkene. Her beskrives en metode, der kan bruges til at teste konventionelle og nye lægemidler på BDO'er afledt af ovariecancervæv og ascites. En luminescensbaseret adenosintrifosfat (ATP) assay bruges til at måle levedygtighed, væksthastighed, og lægemiddelfølsomhed. Lægemiddelskærme i BDO'er kan afsluttes på 7-10 dage afhængigt af hastigheden af organoiddannelse og lægemiddelbehandlinger.
Introduction
Selvom det er sjældent, er kræft i æggestokkene en af de mest dødelige gynækologiske kræftformer 1,2. En udfordring ved udvikling af nye behandlinger er, at kræft i æggestokkene er heterogen, og tumormikromiljøet varierer meget blandt patienterne. Derudover udvikler mange ovariecancer resistens over for platinbaseret kemoterapi og poly (ADP-ribose) polymerasehæmmere, hvilket fremhæver behovet for større terapeutiske muligheder 3,4,5.
En tilgang, der kan være nyttig til at identificere nye behandlinger, er at bruge patientafledte organoider (BDO'er). Organoider er tredimensionelle klynger af flere celletyper, der selvorganiserer og danner in vitro "miniorganer"6,7,8,9,10. Organoider kan rekapitulere vigtige vævsmorfologi og genekspressionsprofiler11,12. Nogle af de første organoider blev afledt af tarm-, mave- og tyktarmskræftceller fra både mus og mennesker 8,9,13. Langlivede organoidkulturer er blevet etableret fra en bred vifte af godartede og ondartede væv, herunder blære, tyktarm, mave, bugspytkirtel, hjerne, nethinden og leveren 14,15,16. Vi har tidligere demonstreret metoder til at etablere BDO'er fra ovariecancertumorer og ascitesprøver17. BDO'er kan bruges til at studere molekylære egenskaber, cellulære mekanismer og nye lægemiddelbehandlinger 18,19,20. BDO'er har flere fordele i forhold til traditionelle todimensionelle primære cellekulturer til lægemiddelscreening. Selvom primære todimensionelle kulturer er en billig metode til lægemiddelskærme, er primære cellekulturer enkeltcelletyper og mangler den tredimensionelle arkitektur af tumorer 21,22,23. Ikke desto mindre er BDO'er en værdifuld ressource, og omkostningseffektive protokoller er nødvendige for at optimere deres anvendelse i terapeutisk lægemiddelscreening.
Denne artikel beskriver en in vitro metode til at bruge ovariecancer BDO'er til at teste virkningerne af kendte eller kandidatlægemidler. Mens nuværende lægemiddelskærme med medium og høj kapacitet ved hjælp af BDO'er kræver dyre automatiserede dispenseringsinstrumenter 24,25,26, bruger denne omkostningseffektive metode let tilgængelige basale laboratorieforsyninger og et ATP-baseret cellelevedygtighedsassay i et standard 96-brønds pladeformat (figur 1A). Denne metode vil lette indledende test af nye lægemidler mod kræft i æggestokkene, inden den skaleres op til større skærme 27,28. Selvom ovariecancer BDO'er anvendes her, kan denne metode anvendes på andre kræftorganoidmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Samlingen af humane prøver til denne forskning blev godkendt af Washington University School of Medicine Institutional Review Board. Alle egnede patienter over 18 år havde en diagnose eller formodet diagnose af højgradig serøs ovariecancer og var villige og i stand til at give informeret samtykke. Tumorvævet fra enten primære eller metastatiske steder ud over ascites og pleurvæske blev opnået fra samtykkede patienter på behandlingstidspunktet.
1. Udvælgelse af etablerede BOB'er til rentabilitetsanalyse
BEMÆRK: Disse organoider er typisk inden for de første fem passager. Som tidligere beskrevet dannes ovariecancer BDO'er ved resuspendering af primær cellesuspension i kældermembranekstrakt (BME) såsom Cultrex eller Matrigel17 (se materialetabel).
- BOB'er bør have en opfattet fordoblingstid på 24-72 timer for at opnå den bedste effektivitet af analysen. Anslå den opfattede fordoblingstid ved visuelt at bestemme antallet af dage, det tager for organoider at danne sig efter passering / plettering.
BEMÆRK: Efter vores erfaring kan organoider, der tager længere tid end tre dage at danne, ikke bruges til denne væksthæmningsanalyse. - Identificer lægemidler og vælg en række koncentrationer, der skal testes (f.eks. Carboplatin, 0-50 μM, se materialetabel).
- Bestem pladeopsætningen. Dette assay vil blive udført i tre eksemplarer, hvilket begrænser antallet af lægemidler og koncentrationer, der kan testes på en plade.
BEMÆRK: Udvalgte BOB-linjer skal overholdes nøje, før analysen udføres. Etablerede ovariecancer BDO'er danner multicellulære faste og hule kugler med tumorlignende spirende former (figur 1B). BOB-morfologi, genomisk profil osv. skal sammenlignes med patientprøvens (når det er muligt), før analysen29-33 udføres. Ovariecancer BDO'er kan genereres fra primære og metastatiske tumorprøver og ascites17.
2. Reagensforberedelse til levedygtighedsanalysen
- Basismedier: For at avancere DMEM/F12 tilsættes 1 % (v/v) penicillin-streptomycin, 1x glutamax og 1 % (v/v) HEPES17 (se materialetabel).
- Forbered Advance Organoid Media for ovariecancer organoider efter tidligere offentliggjort rapport17.
3. Plating af organoider (~ Dag -2)
BEMÆRK: Dette trin skal udføres 1-3 dage før tilsætning af lægemidlerne. Før begyndelse opvarmes alle reagenser (basismedier, avancerede organoidmedier og organoiddissociationsreagens; se materialetabel) til 37 °C i vandbad. Optø BME i et isvandbad.
- Brug et brightfield-mikroskop til at bekræfte, om organoider af interesse er 70% -90% sammenflydende.
BEMÆRK: Det anbefales at gemme billeder af organoiderne til fremtidig reference. - Tilsæt 1-2 ml opvarmede basemedier til brønden, der indeholder organoider, og pipette op og ned for mekanisk at adskille de BME-holdige organoider. Overfør hele opløsningen til et 15 ml konisk rør17.
BEMÆRK: Typisk er 1-2 ml medier nok til korrekt fortynding af BME. Organoider af samme patient og passage kan kombineres. - Vortex i 5-10 s for yderligere at dissociere cellerne og centrifugere ved 1107 x g i 5 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Supernatanten fjernes med en enkeltkanalpipette og kasseres. Resuspender organoider i 1 ml organoid dissociationsreagens (se materialetabel) og overfør til et 1,5 ml mikrocentrifugeglas. Der inkuberes i 7 minutter ved 37 °C.
- Hvis pelleten stadig er gelatinøs på grund af den resterende BME, tilsættes yderligere 1 ml basismedier, hvirvel i 5-10 s, og gentagen centrifugering.
- Der centrifugeres ved 1107 x g i 5 minutter ved RT. Supernatanten fjernes og kasseres, og cellepelletsen resuspenderes i 1 ml basismedie.
- Antallet af celler i hver BOB-kultur tælles ved hjælp af en automatisk celletæller (se materialetabellen) eller et hæmocytometer.
- Resuspender celler ved 20.000 celler pr. 10 μL af 25 % basemedier og 75 % BME. Gør dette ved at resuspendere organoiderne i medierne og blande med BME.
- Plade en 3 μL dråber resuspenderede BME + BOB-celler i en brønd i en sort uigennemsigtig 96-brøndplade (se materialetabel). Placer dråberne i midten af hver brønd. Plade hver lægemiddelkoncentration i tre eksemplarer.
BEMÆRK: Da cellelevedygtighedsanalysen er luminescensbaseret, er det bedst at bruge sorte uigennemsigtige plader for at undgå baggrund. Gennemsigtige plader kan bruges til at visualisere organoider under analysen, men bunden af pladerne skal dækkes med uigennemsigtig tape inden måling af luminescens. - Inkubationspladen i en cellekulturkuvøse ved 37 °C i 15 min.
- Der tilsættes 100 μL Advance Organoid Media til hvert hul. Inkuber pladen i 24-72 timer (bestem i henhold til opfattet BOB-fordoblingstid). Der tilsættes 100 μL Advance Organoid Media til et tomt hul til brug som tomme.
BEMÆRK: Målet er at tillade organoider at danne. - Valgfrit: Til analyse af væksthastighed skal du plade yderligere tredobbelte BOB'er i en separat plade. Dette vil blive brugt til at tælle celler på Time = 0 og skal analyseres på dag 0 ved hjælp af levedygtighedsanalysen beskrevet i afsnit 5.
4. Tilsætning af lægemidler til levedygtighedsanalysen på dag 0
BEMÆRK: Dag 0 refererer til den dag, stofferne tilsættes til de fuldt dannede organoider.
- Fortynd udvalgte lægemidler i Advance Organoid Media til ønskede koncentrationer. Fortyndinger kan foretages i 1,5 ml rør eller i en forudindstillet 96-brønds plade, hvilket ville gøre det muligt at bruge en flerkanalpipette til at dispensere mediet.
BEMÆRK: Lægemidler skal resuspenderes i opløsningsmidlet foreslået af producenten, såsom dimethylsulfoxid. Til denne undersøgelse blev følgende fortyndinger af carboplatin i Advance Organoid Media lavet: 1, 5, 10, 25, 50 og 75 μM. - Fjern medier fra hvert hul med en enkelt- eller flerkanalpipette, og pas på ikke at røre ved eller forstyrre BOB/BME-dråben.
- Tilsæt 100 μL Advance Organoid Media og ønsket lægemiddel (er) til hver brønd. Sørg for at tilføje friske medier til de tre kontrolhuller.
BEMÆRK: Lægemiddelkoncentrationer vil variere og afhænge af det videnskabelige spørgsmål og lægemiddelvirkningsmekanismen. Når vi beslutter, hvilke koncentrationer der skal bruges, begynder vi med tidligere etablerede lægemiddelkoncentrationer i sammenlignelige 2D-cellelinjer (f.eks. Udødeliggjorte ovariecancercellelinjer). Det kan være nødvendigt at øge koncentrationerne, hvis der ikke er observeret nogen effekt på organoider. - Opdater medier og lægemidler efter behov (gentag trin 4.1-4.3). Hvorvidt medierne skal opdateres, afhænger af analyselængden, lægemidlets biologiske aktivitet og lægemidlets halveringstid. For analyser over en uge skal medierne opdateres mindst én gang.
5. Afslutning af levedygtighedsanalysen til aflæsning (~ dag 7)
BEMÆRK: Dette trin kan udføres på dag 7-10. Analyselængden skal bestemmes i henhold til halveringstiden og farmakodynamikken for de lægemidler, der testes.
- Lad levedygtighedsassayreagenserne opnå stuetemperatur i mørke. Opbevar reagenserne ved 4 °C natten over (i mørke) for at reducere optøningstiden.
- Fjern analysepladen fra cellekulturinkubatoren, og lad den akklimatisere sig til stuetemperatur i 30 minutter. Pladen behøver ikke at akklimatisere sig i mørket.
- Der tilsættes 100 μL levedygtighedsassayreagens (se materialetabellen) til hvert hul (for et samlet volumen på 200 μL), og anbringes på en pladeryster i 5 minutter (80 omdr./min.). Tag pladen ud af rysteren og inkuber i yderligere 25 minutter ved stuetemperatur. Sørg for, at pladen altid er beskyttet mod lys ved at dække den med folie eller en uigennemsigtig kasse.
- Tænd for bioluminescenspladelæseren, og åbn i-control-softwaren (se materialetabel).
- Under Opret forbindelse til: Instrumentnavn skal du vælge uendelig 200Pro.
- Vælg Luminescens og Standardscript.
- Fra rullemenuen skal du vælge pladetype [BD96fb_Falcon-BD] Falcon 96 Flat Black.
- Bestem, hvilke brønde der skal læses, og fremhæv de tilsvarende brønde under Del af plade.
- Under Målinger i venstre side af skærmen skal du trække og slippe luminescens under pladens del.
- Vælg luminescensparametrene: Dæmpning: INGEN; Integrationstid: 1000 ms; Afregningstid: 0 ms.
- Fjern dækslet fra pladen, og læg det i pladelæseren. Tryk på Start for at begynde.
- Efter færdiggørelsen skal du eksportere data og gemme.
6. Analyse af data
- Beregn procentdelen af cellelevedygtighed.
- Træk "Blank" fra hver brønd for de tomme korrigerede aflæsninger. Beregn derefter kontrolgennemsnittet ved at beregne gennemsnittet af de tre kontrolhuller.
- Brug følgende ligning til at beregne procentdelen af levedygtige celler i hver brønd: (Eksperimentel brønd / Kontrolgennemsnit) x 100
- Graf de resulterende data i analysesoftwaren (se materialetabel).
- Undersøg målinger af vækstrate (GR).
- Beregn GR-metrikkerne manuelt i henhold til den offentliggjorte rapport34.
- Alternativt kan du bruge online GR-lommeregneren (se materialetabellen) til at generere metrics35. Brug dag 0-målingerne som "cell_count_time0", som afspejler væksthastigheden for de ubehandlede BOB'er.
- Eksporter data og graf.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Disse resultater illustrerer to BDO'ers respons på kemoterapilægemidlet carboplatin, som bruges til behandling af kræft i æggestokkene. Organoider blev afledt af tumorbiopsi (BOB # 1) og fra ascites (BOB # 2). Disse organoider blev udvalgt ud fra deres opfattede fordoblingstid (1-2 dage) og morfologiske udseende (dannelse af mange store organoider). Både BOB #1 og BOB #2 blev belagt på dag -2, ved passage to, og carboplatin blev tilføjet på dag 0. Vi testede følgende carboplatinkoncentrationer fortyndet i Advance Organoid Media: 1, 5, 10, 25, 50 og 75 μM. Ved afslutningen af eksperimentet på dag 7 blev levedygtighedsassayreagenset tilsat til pladen, og resultaterne blev analyseret. Figur 2A viser procentdelen af levende celler efter carboplatinbehandling.
Dernæst blev online GR-regnemaskinen brugt til at analysere dataene. I mangel af celletællingsdata blev luminescensværdierne målt i levedygtighedsanalysen anvendt. Efter eksport af GR-målingerne blev GR-værdierne afbildet, hvilket er forholdet mellem opfattede vækstrater i behandlede og ubehandlede tilstande normaliseret til en enkelt celledeling34. Disse værdier blev derefter plottet mod carboplatinkoncentrationerne (figur 2B). Tabel 1 opsummerer GR-målingerne, herunder de respektive kontrol- og behandlede cellefordoblingstider og GR-området over kurven (GRAOC), som integrerer dosis-responskurven over en række testede carboplatinkoncentrationer34. Følsomhed over for et bestemt lægemiddel kan bestemmes ved at fortolke GR50-værdien svarende til den koncentration, hvor lægemidlet har en halv maksimal virkning. For eksempel er GR50-værdien for BOB #1 meget højere end for BOB #2 (4,85 μMvs. 0,97 μM), hvilket indikerer, at BOB #1 er mere modstandsdygtig over for platinkemoterapi end BOB #2.
Figur 1: Patientafledte organoider før lægemiddelscreening. (A) Eksperimentel skitse til screening af BOB-lægemidler. I betragtning af fordoblingstiden for BOB-linjen og lægemiddeleksponeringstiden kan det være nødvendigt at justere forsøgsplanen. (B) Repræsentative brightfield-billeder (40x) af to BOB-linjer for kræft i æggestokkene (#1 og #2). Skalabjælke = 50 μm. Forkortelser: BOB = patientafledte organoider. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative resultater af BOB for ovariecancer efter carboplatinbehandling. (A) To BOB-linjer blev behandlet med stigende koncentrationer af carboplatin i syv dage. X-aksen viser carboplatinkoncentration; Y-aksen viser % af levende celler normaliseret for at kontrollere organoider (ingen carboplatin). Assays blev afsluttet i tre eksemplarer med to biologiske replikater. Fejlbjælkerne angiver standardafvigelsen. (B) Gr-værdigraf, der repræsenterer den logaritmiske carboplatinkoncentration (x-aksen) og GR-værdien (Y-aksen). Disse værdier blev genereret i online GR-regnemaskinen. Fejlbjælkerne angiver standardafvigelsen. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Behandling | Kontrolcellefordobling af tid | Behandlet cellefordoblingstid | GR50 | GR_AOC | |
| BOB #1 | Carboplatin | 0.744 | 0.112 | 4.85 | 1.28 |
| BOB #2 | Carboplatin | 0.972 | 0.0532 | 0.97 | 1.51 |
Tabel 1: Tabel, der viser kontrolcellens fordoblingstid, behandlet cellefordoblingstid, GR50 og GR_AOC værdier, der genereres i GR-lommeregneren. Forkortelser: BOB = patientafledte organoider, GR = væksthastighed, GR_AOC = væksthastighedsareal over kurven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikel beskriver en metode, der kan bruges til at vurdere de terapeutiske virkninger af konventionelle eller nye lægemidler på ovariecancer BOB'er. Forskere skal overveje flere spørgsmål, før de udfører levedygtighedsanalysen i BOB-modellen.
For det første, når man vælger en BOB, der skal bruges i levedygtighedsanalysen, skal man bestemme den ideelle organoidtype (tumor vs. ascites) og passagenummer til deres behov. Det er vores erfaring, at ascites-afledte BDO'er vokser hurtigere og er lettere at generere end tumorafledte BDO'er. Fordi dette assay afhænger af vækstraten, kan det være vanskeligt at bruge organoider, der tager lang tid at danne / vokse. Vi har kun med succes brugt BOB-linjer med fordoblingstider på mindre end 4 dage.
For det andet blev uigennemsigtige sorte 96-brøndsplader brugt i denne undersøgelse. Da ATP-levedygtighedsanalysen er luminescensbaseret, vil gennemsigtige brønde reducere signalintensiteten og generere signalforurening. Uigennemsigtigvæggede, gennemsigtige bundplader muliggør visualisering af organoider under analysen og kan hjælpe med at overvåge behandlingsinducerede ændringer i cellemorfologi. Selvom det er en styrke relateret til omkostninger, er en begrænsning af dette assay at bruge en 96-brøndplade, hvilket begrænser antallet af prøver og lægemidler, der kan evalueres samtidigt.
For det tredje skal antallet af udgyldte celler nøje overvejes og optimeres til levedygtighedsanalyser. Dette gælder især på grund af den variable væksthastighed for BOB-linjer; For få celler vil ikke danne organoider, og for mange celler vil føre til organoid overvækst. For at sikre en ensartet fordeling af celler blev der anvendt en automatisk celletæller, som opretholdt det samme BME-til-medie-forhold (75:25). Denne høje procentdel af BME sikrer, at dråberne forbliver størknede under hele analysen. Her blev 3 μL dråber BME placeret i midten af brønden. Selvom dråbens størrelse kan øges, advarer vi mod at belægge hele brønden. Belægning af hele brønden vil få organoiderne til at slå sig ned i kanterne af brønden, hvilket både vil hæmme deres samlede vækst og påvirke levedygtighedsanalyseresultaterne. Off-center placering af dråben er fint, så længe det ikke rører kanterne af brønden.
For det fjerde introducerer selvpipettering menneskelige fejl, men dette kan overvindes ved opmærksomhed på detaljer og inkludering af yderligere kontrolbrønde.
Endelig skal assayets længde vælges omhyggeligt. Langvarig eksponering for lægemidler vil påvirke BOB'ernes levedygtighed, uafhængigt af lægemidlets virkningsmekanisme. Af denne grund er det vigtigt at teste en række lægemiddelkoncentrationer over mindst fem dage. Det er vigtigt at afgøre, om medierne skal ændres i længere perioder, fordi reducerede niveauer af vækstfaktorer vil hæmme virkningerne af lægemidlerne36. For at undersøge, om mediet skal ændres under analysen, skal man sammenligne resultaterne fra dag 0 og dag 7 kontroller. Ubehandlede BOB-kontroller bør fortsætte med at vokse kontinuerligt under hele assayet.
Da BOB'erne fortsætter med at udvikle sig i kompleksitet og bedre rekapitulere deres oprindelsesvæv, bør deres anvendelse forbedre lægemiddelopdagelsen. BOB'er vil dog sandsynligvis forblive en værdifuld ressource og kræve omkostningseffektive metoder til at bevare og optimere deres anvendelse. I modsætning til mellem- og højkapacitetsteknikker kan denne protokol bruges til at teste kendte og nye forbindelser til lavere omkostninger med let tilgængelige materialer og udstyr. Endelig kan denne metode let tilpasses forskellige kræftorganoidmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Cancer Institute of National Institutes of Health under Award Number R01CA243511. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health. Forfatterne takker Deborah Frank for hendes redaktionelle kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Plastic Tubes | |||
| 15 mL Plastic Tubes | |||
| 96 well Flat Black Plates | MidSci | 781968 | |
| Advance Organoid Media | see Graham et al 2022 (Jove) | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher | 12634028 | |
| Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | |
| Brightfield Microscope | |||
| Carboplatin | Teva Pharmaceuticals USA | NDC 00703-4246-01 | |
| CellTiter-Glo 3D Viability | Promega | G9681 | |
| Cultrex | R & D Systems | 3533-010-02 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| GR Calculator | http://www.grcalculator.org | Online calculator | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. | ||
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Plate Rocker | |||
| Sterile P10, P200, and P1000 Barrier Sterile Pipette Tips | |||
| Sterile P10, P200, and P1000 Pipettes | |||
| Tecan Infinte 200Pro Plate Reader; i-Control Software | Tecan | ||
| TrypLE | Thermo Fisher | 12605010 | Organoid dissociation reagent |
References
- Matulonis, U. A., Sood, A. K., Fallowfield, L., Howitt, B. E., Sehouli, J. m, Karlan, B. Y.
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Christie, E. L., Bowtell, D. D. L. Acquired chemotherapy resistance in ovarian cancer. Annals of Oncology. 28 (suppl_8), viii13-viii15 (2017).
- Wang, L., Wang, Q., Xu, Y., Cui, M., Han, L. Advances in the treatment of ovarian cancer using PARP inhibitors and the underlying mechanism of resistance. Current Drug Targets. 21 (2), 167-178 (2020).
- Wang, Q., Peng, H., Qi, X., Wu, M., Zhao, X. Targeted therapies in gynecological cancers: a comprehensive review of clinical evidence. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 137 (2020).
- Hofer, M., Lutolf, M. P.
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
- Schutgens, F., Clevers, H. Human organoids: Tools for understanding biology and treating diseases. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 211-234 (2020).
- Zhao, Z., et al.
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. W.
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Graham, O., et al. Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids. Journal of Visualized Experiments. 191, e64878 (2023).
- Liu, C., Qin, T., Huang, Y., Li, Y., Chen, G., Sun, C. Drug screening model meets cancer organoid technology. Translational Oncology. 13 (11), 100840 (2020).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
- Zhou, Z., Cong, L., Cong, X. Patient-derived organoids in precision medicine: drug screening, organoid-on-a-chip and living organoid biobank. Frontiers in Oncology. 11, 762184 (2021).
- Costa, E. C., Moreira, A. F., de Melo-Diogo, D., Gaspar, V. M., Carvalho, M. P., Correia, I. J. 3D tumor spheroids: an overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).
- Foo, M. A., et al. Clinical translation of patient-derived tumour organoids- bottlenecks and strategies. Biomarker Research. 10 (1), 10 (2022).
- Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Bergdorf, K., et al. High-throughput drug screening of fine-needle aspiration-derived cancer organoids. STAR Protocols. 1 (3), 100212 (2020).
- Phan, N., et al. A simple high-throughput approach identifies actionable drug sensitivities in patient-derived tumor organoids. Communications Biology. 2 (1), 78 (2019).
- Putker, M., et al. Medium-throughput drug- and radiotherapy screening assay using patient-derived organoids. Journal of Visualized Experiments. 170, e62495 (2021).
- Dahlin, J. L., Inglese, J., Walters, M. A. Mitigating risk in academic preclinical drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 279-294 (2015).
- Honkala, A., Malhotra, S. V., Kummar, S., Junttila, M. R. Harnessing the predictive power of preclinical models for oncology drug development. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (2), 99-114 (2022).
- de Witte, C. J., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids mimic clinical response and exhibit heterogeneous inter- and intrapatient drug responses. Cell Reports. 31 (11), 107762 (2020).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
- Maenhoudt, N., Vankelecom, H. Protocol for establishing organoids from human ovarian cancer biopsies. STAR Protocols. 2 (2), 100429 (2021).
- Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Scientific Reports. 10 (1), 12581 (2020).
- Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs. Nat Methods. 13 (6), 521-527 (2016).
- Clark, N. A., et al. GRcalculator: an online tool for calculating and mining dose-response data. BMC Cancer. 17 (1), 698 (2017).
- Senkowski, W., et al. A platform for efficient establishment and drug-response profiling of high-grade serous ovarian cancer organoids. Developmental Cell. 58 (12), 1106.e7-1121.e7 (2023).
