Summary
Vi presenterer en protokoll som kan brukes til å utføre terapeutisk legemiddeltesting med pasientavledede eggstokkreftorganoider.
Abstract
Eggstokkreft er en dødelig gynekologisk kreft og den femte ledende årsaken til kreftdød blant kvinner i USA. Utvikling av nye medikamentelle behandlinger er avgjørende for å fremme helsetjenester og forbedre pasientens utfall. Organoider er in vitro tredimensjonale flercellede miniatyrorganer. Pasientavledede organoide (PUD) modeller av eggstokkreft kan være optimale for medikamentscreening fordi de mer nøyaktig rekapitulerer vev av interesse enn todimensjonale cellekulturmodeller og er billige sammenlignet med pasientavledede xenotransplantater. I tillegg etterligner eggstokkreft PUD det variable tumormikromiljøet og genetisk bakgrunn som vanligvis observeres i eggstokkreft. Her beskrives en metode som kan brukes til å teste konvensjonelle og nye legemidler på PUD avledet fra eggstokkreftvev og ascites. En luminescensbasert adenosintrifosfat (ATP) analyse brukes til å måle levedyktighet, veksthastighet og legemiddelfølsomhet. Narkotika skjermer i PUD kan fullføres i 7-10 dager, avhengig av graden av organoid dannelse og medikamentelle behandlinger.
Introduction
Selv om det er sjeldent, er eggstokkreft en av de mest dødelige gynekologiske kreftene 1,2. En utfordring ved utvikling av nye behandlinger er at eggstokkreft er heterogent, og tumormikromiljøet er svært forskjellig blant pasientene. I tillegg utvikler mange eggstokkreft motstand mot platinabasert kjemoterapi og poly (ADP-ribose) polymerasehemmere, noe som understreker behovet for større terapeutiske alternativer 3,4,5.
En tilnærming som kan være nyttig for å identifisere nye terapier, bruker pasientavledede organoider (PUD). Organoider er tredimensjonale klynger av flere celletyper som selvorganiserer og danner in vitro "miniorganer"6,7,8,9,10. Organoider kan rekapitulere viktige vevsmorfologi- og genuttrykksprofiler11,12. Noen av de første organoider ble avledet fra tarm-, mage- og tykktarmskreftceller fra både mus og mennesker 8,9,13. Langlivede organoidkulturer er etablert fra et bredt spekter av godartede og ondartede vev, inkludert blære, tykktarm, mage, bukspyttkjertel, hjerne, netthinne og lever 14,15,16. Vi har tidligere demonstrert metoder for å etablere PUD fra eggstokkreftsvulster og ascitesprøver17. PUD kan brukes til å studere molekylære egenskaper, cellulære mekanismer og nye medikamentelle behandlinger 18,19,20. PUD har flere fordeler i forhold til tradisjonelle todimensjonale primærcellekulturer for medikamentell screening. Selv om primære todimensjonale kulturer er en billig metode for legemiddelskjermer, er primære cellekulturer encelletyper og mangler den tredimensjonale arkitekturen til svulster 21,22,23. Likevel er PUD en verdifull ressurs, og kostnadseffektive protokoller er nødvendig for å optimalisere bruken i terapeutisk legemiddelscreening.
Denne artikkelen beskriver en in vitro-metode for å bruke PUD for eggstokkreft for å teste effekten av kjente legemidler eller kandidatlegemidler. Mens nåværende middels og høy gjennomstrømningsmedisinskjermer ved bruk av PUD krever dyre automatiserte dispenseringsinstrumenter 24,25,26, bruker denne kostnadseffektive metoden lett tilgjengelige grunnleggende laboratorieforsyninger og en ATP-basert cellelevedyktighetsanalyse i et standard 96-brønns plateformat (figur 1A). Denne metoden vil lette foreløpige tester av nye eggstokkreftmedisiner før oppskalering til større skjermer 27,28. Selv om PUD for eggstokkreft brukes her, kan denne metoden brukes på andre kreftorganoidmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Samlingen av menneskelige prøver for denne undersøkelsen ble godkjent av Washington University School of Medicine Institutional Review Board. Alle kvalifiserte pasienter over 18 år hadde en diagnose eller antatt diagnose av høygradig serøs eggstokkreft og var villige og i stand til å gi informert samtykke. Tumorvev fra enten primære eller metastaserende lokalisasjoner, i tillegg til ascites og pleuravæske, ble innhentet fra samtykkede pasienter på behandlingstidspunktet.
1. Valg av etablerte PUDer for levedyktighetsanalyse
MERK: Vanligvis er disse organoidene innenfor de fem første passasjene. Som beskrevet tidligere dannes PUD for eggstokkreft ved å resuspendere primærcellesuspensjon i kjellermembranekstrakt (BME) som Cultrex eller Matrigel17 (se materialtabell).
- PUD bør ha en opplevd doblingstid på 24-72 timer for best mulig effektivitet av analysen. Beregn den oppfattede doblingstiden ved visuelt å bestemme antall dager det tar for organoider å danne etter passering / plating.
MERK: Etter vår erfaring kan organoider som tar lengre tid enn tre dager å danne, ikke brukes til denne veksthemmingsanalysen. - Identifiser legemidler og velg en rekke konsentrasjoner som skal testes (f.eks. Karboplatin, 0-50 μM, se Materialtabell).
- Bestem plateoppsettet. Denne analysen vil bli utført i tre eksemplarer, og begrense antall medikamenter og konsentrasjoner som kan testes på en plate.
MERK: Utvalgte PUD-linjer må overholdes nøye før analysen utføres. Etablerte PUD for eggstokkreft danner flercellede faste og hule kuler med tumorlignende spirende former (figur 1B). PUD-morfologi, genomisk profil, etc., må sammenlignes med pasientprøven (når det er mulig) før analysen 29-33 utføres. Eggstokkreft PUD kan genereres fra primære og metastatiske tumorprøver og ascites17.
2. Reagensforberedelse for levedyktighetsanalysen
- Basismedier: For avansert DMEM/F12 tilsettes 1 % (v/v) penicillin-streptomycin, 1x glutamax og 1 % (v/v)HEPES17 (se materialfortegnelse).
- Forbered Advance Organoid Media for eggstokkreftorganoider etter tidligere publisert rapport17.
3. Plating av organoider (~ Dag -2)
MERK: Dette trinnet må utføres 1-3 dager før du legger til stoffene. Før du begynner, varm alle reagenser (Base Media, Advance Organoid Media og organoid dissosiasjonsreagens; se materialtabell) til 37 ° C i et vannbad. Tine BME i et isvannsbad.
- Bruk et lysfeltmikroskop for å bekrefte om organoider av interesse er 70% -90% sammenflytende.
MERK: Det anbefales å lagre bilder av organoider for fremtidig referanse. - Tilsett 1-2 ml oppvarmet basemedia til brønnholdige organoider og pipette opp og ned for mekanisk å dissosiere de BME-holdige organoider. Overfør hele oppløsningen til et 15 ml konisk rør17.
MERK: Vanligvis er 1-2 ml media nok til å fortynne BME riktig. Organoider av samme pasient og passasje kan kombineres. - Vortex i 5-10 s for ytterligere å dissosiere cellene, og sentrifuge ved 1107 x g i 5 minutter ved romtemperatur (RT).
- Fjern supernatanten med en enkanals pipette og kast. Resuspendere organoider i 1 ml organoid dissosiasjonsreagens (se materialfortegnelse) og overføres til et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Inkuber i 7 minutter ved 37 °C.
- Hvis pelleten fortsatt er gelatinøs på grunn av gjenværende BME, tilsett ytterligere 1 ml basemedier, virvel i 5-10 s og gjenta sentrifugeringen.
- Sentrifuge ved 1107 x g i 5 minutter ved RT. Fjern og kast supernatanten og resuspender cellepelleten i 1 ml basemedier.
- Telle antall celler i hver PUD-kultur ved hjelp av en automatisk celleteller (se materialliste) eller et hemocytometer.
- Resuspendere celler ved 20 000 celler per 10 μL av 25% Base Media og 75% BME. Gjør dette ved å resuspendere organoider i media og blande med BME.
- Plate en 3 μL dråper av resuspenderte BME + PUD-celler i en brønn av en svart ugjennomsiktig 96-brønnplate (se materialfortegnelse). Plasser dråpene i midten av hver brønn. Plate hver legemiddelkonsentrasjon i tre eksemplarer.
MERK: Siden cellelevedyktighetsanalysen er luminescensbasert, er det best å bruke svarte ugjennomsiktige plater for å unngå bakgrunn. Transparente plater kan brukes til å visualisere organoider under analysen, men bunnen av platene skal dekkes med ugjennomsiktig tape før måling av luminescens. - Inkuber platen i en cellekulturinkubator ved 37 °C i 15 minutter.
- Tilsett 100 μL Advance Organoid Media til hver brønn. Inkubasjonsplate i 24-72 timer (bestem i henhold til oppfattet PUD-doblingstid). Tilsett 100 μL Advance Organoid Media til en tom brønn for bruk som tom.
MERK: Målet er å tillate organoider å danne. - Valgfritt: For analyse av veksthastighet, plate ytterligere triplikate PUDer i en egen plate. Dette vil bli brukt til å telle celler ved tid = 0 og bør analyseres på dag 0 ved hjelp av levedyktighetsanalysen beskrevet i avsnitt 5.
4. Tilsetning av medisiner for levedyktighetsanalysen på dag 0
MERK: Dag 0 refererer til dagen stoffene legges til de fullt dannede organoider.
- Fortynn utvalgte legemidler i Advance Organoid Media til ønskede konsentrasjoner. Fortynninger kan gjøres i 1,5 ml rør eller i en forhåndsinnstilt 96-brønnsplate, noe som vil tillate bruk av en flerkanalspipett for å dispensere mediet.
MERK: Legemidler må resuspenderes i løsningsmidlet foreslått av produsenten, for eksempel dimetylsulfoksid. For denne studien ble følgende fortynninger av karboplatin i Advance Organoid Media gjort: 1, 5, 10, 25, 50 og 75 μM. - Fjern medier fra hver brønn med en enkelt- eller flerkanalspipette, og pass på at du ikke berører eller forstyrrer PUD/BME-dråpen.
- Tilsett 100 μL Advance Organoid Media og ønsket legemiddel (er) til hver brønn. Sørg for å legge til nye medier til de tre kontrollbrønnene.
MERK: Legemiddelkonsentrasjonene vil variere og avhenge av det vitenskapelige spørsmålet og virkningsmekanismen. Når vi bestemmer hvilke konsentrasjoner som skal brukes, begynner vi med tidligere etablerte legemiddelkonsentrasjoner i sammenlignbare 2D-cellelinjer (f.eks. Udødeliggjorte eggstokkreftcellelinjer). Det kan være nødvendig å øke konsentrasjonene hvis det ikke er observert effekt på organoider. - Oppdater medier og legemidler etter behov (gjenta trinn 4.1–4.3). Hvorvidt mediet må oppdateres, avhenger av analyselengden, stoffets biologiske aktivitet og stoffets halveringstid. For analyser over en uke må mediene oppdateres minst én gang.
5. Avslutte levedyktighetsanalysen for avlesning (~ Dag 7)
MERK: Dette trinnet kan utføres på dag 7-10. Analyselengden må bestemmes i henhold til halveringstiden og farmakodynamikken til legemidlene som testes.
- La levedyktighetsanalysereagensene nå romtemperatur i mørket. Oppbevar reagensene ved 4 °C over natten (i mørket) for å redusere tinetiden.
- Fjern analyseplaten fra cellekulturinkubatoren og la den akklimatisere seg til romtemperatur i 30 minutter. Tallerkenen trenger ikke å akklimatisere seg i mørket.
- Tilsett 100 μL levedyktighetsanalysereagens (se materialtabell) til hver brønn (for et totalt volum på 200 μL), og legg på en plate-shaker i 5 minutter (80 o / min). Fjern platen fra shakeren og inkuber i ytterligere 25 minutter ved romtemperatur. Forsikre deg om at platen alltid er beskyttet mot lys ved å dekke den med folie eller en ugjennomsiktig boks.
- Slå på bioluminescensplateleseren og åpne i-kontrollprogramvaren (se Materialfortegnelse).
- Under Koble til: Instrumentnavn velger du infinite 200Pro.
- Velg Luminescens og standardskript.
- Velg platetype [BD96fb_Falcon-BD] fra rullegardinmenyen Falcon 96 Flat Black.
- Bestem hvilke brønner som skal leses og uthev de tilsvarende brønnene under Part of Plate.
- Under Målinger på venstre side av skjermen drar og slipper du Luminescens under Platedel .
- Velg luminescensparametrene: Dempning: INGEN; Integrasjonstid: 1000 ms; Fast tid: 0 ms.
- Fjern dekselet fra platen og legg det inn i plateleseren. Trykk Start for å begynne.
- Når du er ferdig, eksporterer du data og lagrer.
6. Dataanalyse
- Beregn prosentvis cellelevedyktighet.
- Trekk "Blank" fra hver brønn for Blank Corrected-avlesningene. Deretter beregner du Control Average ved å beregne gjennomsnittet av de tre kontrollbrønnene.
- Bruk følgende ligning til å beregne prosentandelen levedyktige celler i hver brønn: (Eksperimentell brønn / Kontrollgjennomsnitt) x 100
- Graf de resulterende dataene i analyseprogrammet (se Materialfortegnelse).
- Undersøk vekstrate (GR) beregninger.
- Beregn GR-beregningene manuelt i henhold til den publiserte rapporten34.
- Alternativt kan du bruke den elektroniske GR-kalkulatoren (se Materialfortegnelse) for å generere beregningene35. Bruk målingene for dag 0 som "cell_count_time0", som gjenspeiler vekstraten til de ubehandlede PUD-ene.
- Eksporter data og graf.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Disse resultatene illustrerer responsen fra to PUDer til kjemoterapimedisinen karboplatin, som brukes til å behandle eggstokkreft. Organoider ble avledet fra tumorbiopsi (PUD #1) og fra ascites (PUD #2). Disse organoidene ble valgt ut fra opplevd doblingstid (1-2 dager) og morfologisk utseende (dannelse av mange store organoider). Både PUD #1 og PUD #2 ble belagt på dag -2, ved passasje to, og karboplatin ble tilsatt på dag 0. Vi testet følgende karboplatinkonsentrasjoner fortynnet i Advance Organoid Media: 1, 5, 10, 25, 50 og 75 μM. Ved avslutningen av forsøket på dag 7 ble levedyktighetsanalysereagenset tilsatt platen, og resultatene ble analysert. Figur 2A viser prosentandelen levende celler etter karboplatinbehandling.
Deretter ble den elektroniske GR-kalkulatoren brukt til å analysere dataene. I mangel av celletellingsdata ble luminescensverdiene målt i levedyktighetsanalysen brukt. Etter eksport av GR-beregningene ble GR-verdiene grafet, som er forholdet mellom oppfattede vekstrater i behandlede og ubehandlede tilstander normalisert til en enkelt celledeling34. Disse verdiene ble deretter plottet mot karboplatinkonsentrasjonene (figur 2B). Tabell 1 oppsummerer GR-beregningene, inkludert de respektive doblingstidene for kontroll- og behandlede celler og GR-området over kurven (GRAOC), som integrerer dose-responskurven over en rekke karboplatinkonsentrasjoner som ble testet34. Følsomhet for et bestemt legemiddel kan bestemmes ved å tolke GR50-verdien , tilsvarende konsentrasjonen der stoffet har en halv maksimal effekt. For eksempel er GR50-verdien for PUD #1 mye høyere enn for PUD #2 (4,85 μMvs. 0,97 μM), noe som indikerer at PUD #1 er mer motstandsdyktig mot platinakjemoterapi enn PUD #2.
Figur 1 Pasientderiverte organoider før legemiddelscreening. (A) Eksperimentell skisse for screening av PUD-legemidler. Gitt doblingstiden til PUD-linjen og eksponeringstiden for legemidler, kan det være nødvendig å justere forsøksplanen. (B) Representative brightfield-bilder (40x) av to PUD-linjer for eggstokkreft (#1 og #2). Skala bar = 50 μm. Forkortelser: PUD = pasientavledede organoider. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Representative resultater av eggstokkreft PUD etter karboplatinbehandling. (A) To PUD-linjer ble behandlet med økende konsentrasjoner av karboplatin i syv dager. X-aksen viser karboplatinkonsentrasjon; Y-aksen viser% av levende celler normalisert for å kontrollere organoider (ingen karboplatin). Analysene ble gjennomført i triplikat med to biologiske replikater. Feilfeltene angir standardavviket. (B) GR-verdi graf som representerer den logaritmiske karboplatinkonsentrasjonen (x-aksen) og GR-verdien (Y-aksen). Disse verdiene ble generert i den elektroniske GR-kalkulatoren. Feilfeltene angir standardavviket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Behandling | Doblingstid for kontrollcelle | Doblingstid for behandlede celler | GR50 | GR_AOC | |
| PUD #1 | Karboplatin | 0.744 | 0.112 | 4.85 | 1.28 |
| PUD #2 | Karboplatin | 0.972 | 0.0532 | 0.97 | 1.51 |
Tabell 1: Tabell som viser kontrollcellens doblingstid, behandlede celledoblingstid, GR50 og GR_AOC verdier generert i GR-kalkulatoren. Forkortelser: PUD = pasientavledede organoider, GR = veksthastighet, GR_AOC = vekstrate areal over kurven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikkelen beskriver en metode som kan brukes til å vurdere terapeutisk effekt av konvensjonelle eller nye legemidler på PUD for eggstokkreft. Forskeren må vurdere flere problemstillinger før levedyktighetsanalysen i PUD-modellen gjennomføres.
Først, når man velger en PUD som skal brukes i levedyktighetsanalysen, må man bestemme den ideelle organoidtypen (tumor vs. ascites) og passasjenummer for deres behov. Vår erfaring er at ascites-avledede PUD-er vokser raskere og er lettere å generere enn tumoravledede PUD-er. Fordi denne analysen avhenger av vekstraten, kan det være vanskelig å bruke organoider som tar lang tid å danne / vokse. Vi har kun benyttet PUD-linjer med doblingstid under 4 døgn.
For det andre ble ugjennomsiktige svarte 96-brønnsplater brukt i denne studien. Siden ATP-levedyktighetsanalysen er luminescensbasert, vil gjennomsiktige brønner redusere signalintensiteten og generere signalforurensning. Ugjennomsiktige vegger, gjennomsiktige bunnplater tillater visualisering av organoider under analysen og kan bidra til å overvåke behandlingsinduserte endringer i cellemorfologi. Selv om det er en styrke relatert til kostnad, er en begrensning av denne analysen å bruke en 96-brønnsplate, som begrenser antall prøver og legemidler som kan evalueres samtidig.
For det tredje må antall celler som er belagt, vurderes nøye og optimaliseres for levedyktighetsanalyser. Dette gjelder spesielt på grunn av den variable vekstraten til PUD-linjer; For få celler vil ikke danne organoider, og for mange celler vil føre til organoid gjengroing. For å sikre jevn fordeling av celler ble en automatisk celleteller brukt og opprettholdt det samme BME-til-media-forholdet (75:25). Denne høye prosentandelen av BME sikrer at dråpene forblir størknet for hele analysen. Her ble 3 μL dråper BME plassert i midten av brønnen. Selv om størrelsen på dråpen kan økes, advarer vi mot å belegge hele brønnen. Belegg av hele brønnen vil føre til at organoidene legger seg i kantene av brønnen, noe som både vil hindre deres generelle vekst og påvirke levedyktighetsanalyseresultatene. Off-center plassering av dråpen er greit så lenge den ikke berører kantene på brønnen.
For det fjerde introduserer selvpipettering menneskelig feil, men dette kan overvinnes ved oppmerksomhet på detaljer og inkludering av ekstra kontrollbrønner.
Til slutt må lengden på analysen velges nøye. Langvarig eksponering for legemidler vil påvirke PUDs levedyktighet, uavhengig av medikamentvirkningsmekanismen. Av denne grunn er det viktig å teste en rekke legemiddelkonsentrasjoner over minst fem dager. Det er viktig å ta stilling til om mediene må endres i lengre perioder fordi reduserte nivåer av vekstfaktorer vil hemme effekten av legemidlene36. For å undersøke om mediene må endres under analysen, må man sammenligne resultatene fra kontrollene på dag 0 og dag 7. Ubehandlede PUD-kontroller bør fortsette å vokse kontinuerlig gjennom hele analysen.
Etter hvert som PUD-er fortsetter å utvikle seg i kompleksitet og bedre rekapitulere opprinnelsesvevet, bør bruken av dem forbedre oppdagelsen av narkotika. PUD vil imidlertid sannsynligvis forbli en verdifull ressurs og kreve kostnadseffektive metoder for å bevare og optimalisere bruken. I motsetning til teknikker med middels og høy gjennomstrømning, kan denne protokollen brukes til å teste kjente og nye forbindelser til lavere pris med lett tilgjengelige materialer og utstyr. Endelig kan denne metoden lett tilpasses forskjellige kreftorganoidmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Cancer Institute of National Institutes of Health under Award Number R01CA243511. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health. Forfatterne takker Deborah Frank for hennes redaksjonelle kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Plastic Tubes | |||
| 15 mL Plastic Tubes | |||
| 96 well Flat Black Plates | MidSci | 781968 | |
| Advance Organoid Media | see Graham et al 2022 (Jove) | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher | 12634028 | |
| Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | |
| Brightfield Microscope | |||
| Carboplatin | Teva Pharmaceuticals USA | NDC 00703-4246-01 | |
| CellTiter-Glo 3D Viability | Promega | G9681 | |
| Cultrex | R & D Systems | 3533-010-02 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| GR Calculator | http://www.grcalculator.org | Online calculator | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. | ||
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Plate Rocker | |||
| Sterile P10, P200, and P1000 Barrier Sterile Pipette Tips | |||
| Sterile P10, P200, and P1000 Pipettes | |||
| Tecan Infinte 200Pro Plate Reader; i-Control Software | Tecan | ||
| TrypLE | Thermo Fisher | 12605010 | Organoid dissociation reagent |
References
- Matulonis, U. A., Sood, A. K., Fallowfield, L., Howitt, B. E., Sehouli, J. m, Karlan, B. Y.
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Christie, E. L., Bowtell, D. D. L. Acquired chemotherapy resistance in ovarian cancer. Annals of Oncology. 28 (suppl_8), viii13-viii15 (2017).
- Wang, L., Wang, Q., Xu, Y., Cui, M., Han, L. Advances in the treatment of ovarian cancer using PARP inhibitors and the underlying mechanism of resistance. Current Drug Targets. 21 (2), 167-178 (2020).
- Wang, Q., Peng, H., Qi, X., Wu, M., Zhao, X. Targeted therapies in gynecological cancers: a comprehensive review of clinical evidence. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 137 (2020).
- Hofer, M., Lutolf, M. P.
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
- Schutgens, F., Clevers, H. Human organoids: Tools for understanding biology and treating diseases. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 211-234 (2020).
- Zhao, Z., et al.
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. W.
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Graham, O., et al. Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids. Journal of Visualized Experiments. 191, e64878 (2023).
- Liu, C., Qin, T., Huang, Y., Li, Y., Chen, G., Sun, C. Drug screening model meets cancer organoid technology. Translational Oncology. 13 (11), 100840 (2020).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
- Zhou, Z., Cong, L., Cong, X. Patient-derived organoids in precision medicine: drug screening, organoid-on-a-chip and living organoid biobank. Frontiers in Oncology. 11, 762184 (2021).
- Costa, E. C., Moreira, A. F., de Melo-Diogo, D., Gaspar, V. M., Carvalho, M. P., Correia, I. J. 3D tumor spheroids: an overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).
- Foo, M. A., et al. Clinical translation of patient-derived tumour organoids- bottlenecks and strategies. Biomarker Research. 10 (1), 10 (2022).
- Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Bergdorf, K., et al. High-throughput drug screening of fine-needle aspiration-derived cancer organoids. STAR Protocols. 1 (3), 100212 (2020).
- Phan, N., et al. A simple high-throughput approach identifies actionable drug sensitivities in patient-derived tumor organoids. Communications Biology. 2 (1), 78 (2019).
- Putker, M., et al. Medium-throughput drug- and radiotherapy screening assay using patient-derived organoids. Journal of Visualized Experiments. 170, e62495 (2021).
- Dahlin, J. L., Inglese, J., Walters, M. A. Mitigating risk in academic preclinical drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 279-294 (2015).
- Honkala, A., Malhotra, S. V., Kummar, S., Junttila, M. R. Harnessing the predictive power of preclinical models for oncology drug development. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (2), 99-114 (2022).
- de Witte, C. J., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids mimic clinical response and exhibit heterogeneous inter- and intrapatient drug responses. Cell Reports. 31 (11), 107762 (2020).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
- Maenhoudt, N., Vankelecom, H. Protocol for establishing organoids from human ovarian cancer biopsies. STAR Protocols. 2 (2), 100429 (2021).
- Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Scientific Reports. 10 (1), 12581 (2020).
- Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs. Nat Methods. 13 (6), 521-527 (2016).
- Clark, N. A., et al. GRcalculator: an online tool for calculating and mining dose-response data. BMC Cancer. 17 (1), 698 (2017).
- Senkowski, W., et al. A platform for efficient establishment and drug-response profiling of high-grade serous ovarian cancer organoids. Developmental Cell. 58 (12), 1106.e7-1121.e7 (2023).
