Summary
Presentamos un protocolo que se puede utilizar para realizar pruebas terapéuticas de fármacos con organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes.
Abstract
El cáncer de ovario es un cáncer ginecológico mortal y la quinta causa principal de muerte por cáncer entre las mujeres en los Estados Unidos. El desarrollo de nuevos tratamientos farmacológicos es crucial para avanzar en la atención sanitaria y mejorar los resultados de los pacientes. Los organoides son órganos multicelulares tridimensionales en miniatura in vitro. Los modelos de organoides derivados de pacientes (PDO) de cáncer de ovario pueden ser óptimos para la detección de fármacos, ya que recapitulan con mayor precisión los tejidos de interés que los modelos de cultivos celulares bidimensionales y son económicos en comparación con los xenoinjertos derivados de pacientes. Además, las DOP del cáncer de ovario imitan el microambiente tumoral variable y los antecedentes genéticos que se observan típicamente en el cáncer de ovario. Aquí, se describe un método que se puede utilizar para probar fármacos convencionales y novedosos en PDOs derivadas del tejido del cáncer de ovario y la ascitis. Se utiliza un ensayo de trifosfato de adenosina (ATP) basado en luminiscencia para medir la viabilidad, la tasa de crecimiento y la sensibilidad a los fármacos. Las pruebas de detección de drogas en las DOP se pueden completar en 7-10 días, dependiendo de la tasa de formación de organoides y de los tratamientos farmacológicos.
Introduction
Aunque es poco frecuente, el cáncer de ovario es uno de los cánceres ginecológicos más letales 1,2. Un desafío en el desarrollo de nuevos tratamientos es que el cáncer de ovario es heterogéneo y el microambiente tumoral difiere mucho entre los pacientes. Además, muchos cánceres de ovario desarrollan resistencia a la quimioterapia basada en platino y a los inhibidores de la poli(ADP-ribosa) polimerasa, lo que pone de manifiesto la necesidad de mayores opciones terapéuticas 3,4,5.
Un enfoque que puede ser útil para identificar nuevas terapias es el uso de organoides derivados del paciente (PDO). Los organoides son grupos tridimensionales de múltiples tipos celulares que se autoorganizan y forman "mini-órganos" in vitro6,7,8,9,10. Los organoides pueden recapitular importantes perfiles de morfología tisular y expresión génica11,12. Algunos de los primeros organoides se derivaron de células de cáncer intestinal, gástrico y de colon tanto de ratones como de humanos 8,9,13. Se han establecido cultivos de organoides de larga vida a partir de una amplia gama de tejidos benignos y malignos, incluyendo la vejiga, el colon, el estómago, el páncreas, el cerebro, la retina y el hígado 14,15,16. Previamente demostramos métodos para establecer PDOs a partir de tumores de cáncer de ovario y muestras de ascitis17. Las PDO se pueden utilizar para estudiar características moleculares, mecanismos celulares y nuevos tratamientos farmacológicos 18,19,20. Las PDO tienen varias ventajas sobre los cultivos celulares primarios bidimensionales tradicionales para el cribado de fármacos. A pesar de que los cultivos primarios bidimensionales son un método de bajo costo para el cribado de fármacos, los cultivos celulares primarios son de tipo unicelular y carecen de la arquitectura tridimensional de los tumores 21,22,23. Sin embargo, las DOP son un recurso precioso y se necesitan protocolos rentables para optimizar su uso en el cribado terapéutico de fármacos.
En este artículo se describe un método in vitro para utilizar las PDO del cáncer de ovario con el fin de probar los efectos de fármacos conocidos o candidatos. Mientras que los cribados actuales de fármacos de mediano y alto rendimiento que utilizan PDO requieren costosos instrumentos de dispensación automatizada 24,25,26, este método rentable utiliza suministros básicos de laboratorio fácilmente disponibles y un ensayo de viabilidad celular basado en ATP en un formato de placa estándar de 96 pocillos (Figura 1A). Este método facilitará las pruebas preliminares de nuevos fármacos contra el cáncer de ovario antes de ampliarlos a cribados más grandes27,28. Aunque aquí se utilizan PDO para el cáncer de ovario, este método se puede aplicar a otros modelos de organoides cancerosos.
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Protocol
La colección de especímenes humanos para esta investigación fue aprobada por la Junta de Revisión Institucional de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington. Todas las pacientes elegibles mayores de 18 años tenían un diagnóstico o un presunto diagnóstico de cáncer de ovario seroso de alto grado y estaban dispuestas y eran capaces de dar su consentimiento informado. El tejido tumoral de sitios primarios o metastásicos, además de ascitis y líquido pleural, se obtuvo de pacientes que dieron su consentimiento en el momento de la atención.
1. Selección de las DOP establecidas para el ensayo de viabilidad
NOTA: Por lo general, estos organoides se encuentran dentro de los primeros cinco pasajes. Como se describió anteriormente, las PDOs de cáncer de ovario se forman mediante la resuspensión de la suspensión celular primaria en el extracto de membrana basal (BME) como Cultrex o Matrigel17 (ver Tabla de Materiales).
- Los PDO deben tener un tiempo de duplicación percibido de 24-72 h para obtener la mejor eficiencia del ensayo. Estime el tiempo de duplicación percibido determinando visualmente el número de días que tardan los organoides en formarse después del paso/siembra.
NOTA: En nuestra experiencia, los organoides que tardan más de tres días en formarse no se pueden utilizar para este ensayo de inhibición del crecimiento. - Identifique los medicamentos y seleccione un rango de concentraciones para probar (p. ej., carboplatino, 0-50 μM, consulte la Tabla de materiales).
- Determine la configuración de la placa. Este ensayo se realizará por triplicado, lo que limita el número de fármacos y las concentraciones que se pueden probar en una placa.
NOTA: Las líneas de PDO seleccionadas deben observarse cuidadosamente antes de realizar el ensayo. Las PDO establecidas para el cáncer de ovario forman esferas multicelulares sólidas y huecas con formas de brotes similares a las de un tumor (Figura 1B). La morfología de la PDO, el perfil genómico, etc., deben compararse con el de la muestra del paciente (cuando sea posible) antes de realizar el ensayo29-33. Las PDOs de cáncer de ovario pueden generarse a partir de muestras de tumores primarios y metastásicos y de ascitis17.
2. Preparación del reactivo para el ensayo de viabilidad
- Medios base: Al DMEM/F12 avanzado, agregue 1% (v/v) de penicilina-estreptomicina, 1x glutamax y 1% (v/v)HEPES17 (ver Tabla de materiales).
- Prepare medios de organoides avanzados para organoides de cáncer de ovario siguiendo el informe publicado anteriormente17.
3. Siembra de organoides (~Día -2)
NOTA: Este paso debe realizarse de 1 a 3 días antes de agregar los medicamentos. Antes de comenzar, caliente todos los reactivos (medios base, medios organoides avanzados y reactivo de disociación de organoides; consulte la tabla de materiales) a 37 °C en un baño de agua. Descongelar BME en un baño de agua helada.
- Utilice un microscopio de campo claro para confirmar si los organoides de interés son confluentes en un 70%-90%.
NOTA: Se recomienda guardar imágenes de los organoides para futuras consultas. - Agregue 1-2 ml de medio base calentado al pocillo que contiene organoides y pipetee hacia arriba y hacia abajo para disociar mecánicamente los organoides que contienen BME. Transfiera toda la solución a un tubo cónico de 15 ml17.
NOTA: Por lo general, 1-2 ml de medio es suficiente para diluir adecuadamente el BME. Se pueden combinar organoides del mismo paciente y pasaje. - Vórtice durante 5-10 s para disociar aún más las células, y centrifugar a 1107 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT).
- Retire el sobrenadante con una pipeta monocanal y deséchelo. Vuelva a suspender los organoides en un reactivo de disociación de organoides de 1 ml (consulte la tabla de materiales) y transfiéralos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Incubar durante 7 min a 37 °C.
- Si el gránulo aún está gelatinoso debido al BME restante, agregue 1 ml adicional de medio base, vórtice durante 5-10 s y repita la centrifugación.
- Centrifugar a 1107 x g durante 5 min a RT. Retirar y desechar el sobrenadante y volver a suspender el gránulo celular en 1 mL de medio base.
- Cuente el número de células en cada cultivo de PDO utilizando un contador automático de células (ver Tabla de materiales) o un hemocitómetro.
- Resuspender las células a 20.000 células por cada 10 μl de 25 % de medios base y 75 % de BME. Para ello, vuelva a suspender los organoides en el medio y mezcle con BME.
- Coloque una gota de 3 μL de células BME + PDO resuspendidas en un pocillo de una placa negra opaca de 96 pocillos (consulte la Tabla de materiales). Coloque las gotas en el centro de cada pocillo. Coloque cada concentración de fármaco por triplicado.
NOTA: Dado que el ensayo de viabilidad celular se basa en la luminiscencia, es mejor utilizar placas opacas negras para evitar el fondo. Se pueden usar placas transparentes para visualizar organoides durante el ensayo, pero la parte inferior de las placas debe cubrirse con cinta opaca antes de medir la luminiscencia. - Incubar la placa en una incubadora de cultivo celular a 37 °C durante 15 min.
- Agregue 100 μL de Advance Organoid Media a cada pocillo. Incubar la placa durante 24-72 h (determinar según el tiempo de duplicación de PDO percibido). Agregue 100 μL de Advance Organoid Media a un pocillo vacío para usarlo como pieza en blanco.
NOTA: El objetivo es permitir que se formen organoides. - Opcional: Para el análisis de la tasa de crecimiento, coloque PDO triplicadas adicionales en una placa separada. Esto se utilizará para contar las células en el tiempo = 0 y debe analizarse en el día 0 utilizando el ensayo de viabilidad descrito en la sección 5.
4. Adición de fármacos para el ensayo de viabilidad en el día 0
NOTA: El día 0 se refiere al día en que se agregan los medicamentos a los organoides completamente formados.
- Diluya los medicamentos seleccionados en medios organoides avanzados a las concentraciones deseadas. Las diluciones se pueden realizar en tubos de 1,5 ml o en una placa de 96 pocillos preconfigurada, lo que permitiría el uso de una pipeta multicanal para dispensar el medio.
NOTA: Los medicamentos deben resuspenderse en el solvente sugerido por el fabricante, como el dimetilsulfóxido. Para este estudio, se realizaron las siguientes diluciones de carboplatino en medios organoides avanzados: 1, 5, 10, 25, 50 y 75 μM. - Retire el medio de cada pocillo con una pipeta monocanal o multicanal, teniendo cuidado de no tocar ni alterar la gota de PDO/BME.
- Agregue 100 μL de Advance Organoid Media y los medicamentos deseados a cada pocillo. Asegúrese de agregar medios nuevos a los tres pocillos de control.
NOTA: Las concentraciones del fármaco variarán y dependerán de la cuestión científica y del mecanismo de acción del fármaco. A la hora de decidir qué concentraciones utilizar, comenzamos con las concentraciones de fármacos previamente establecidas en líneas celulares 2D comparables (por ejemplo, líneas celulares de cáncer de ovario inmortalizadas). Es posible que sea necesario aumentar las concentraciones si no se observa ningún efecto sobre los organoides. - Actualice los medios y los medicamentos según sea necesario (repita los pasos 4.1 a 4.3). La necesidad de refrescar el medio depende de la duración del ensayo, de la actividad biológica del fármaco y de la vida media del fármaco. Para ensayos de más de una semana, los medios deberán actualizarse al menos una vez.
5. Finalización del ensayo de viabilidad para la lectura (~Día 7)
NOTA: Este paso se puede realizar en los días 7-10. La duración del ensayo debe determinarse de acuerdo con la vida media y la farmacodinámica de los medicamentos que se están probando.
- Deje que los reactivos del ensayo de viabilidad alcancen la temperatura ambiente en la oscuridad. Almacene los reactivos a 4 °C durante la noche (en la oscuridad) para reducir el tiempo de descongelación.
- Retire la placa de ensayo de la incubadora de cultivos celulares y deje que se aclimate a temperatura ambiente durante 30 minutos. La placa no tiene que aclimatarse en la oscuridad.
- Agregue 100 μL de reactivo para el ensayo de viabilidad (ver Tabla de Materiales) a cada pocillo (para un volumen total de 200 μL) y colóquelo en un agitador de placas durante 5 min (80 rpm). Retire la placa de la coctelera e incube durante 25 minutos más a temperatura ambiente. Asegúrese de que la placa esté siempre protegida de la luz cubriéndola con papel de aluminio o una caja opaca.
- Encienda el lector de placas de bioluminiscencia y abra el software i-control (consulte la tabla de materiales).
- En Conectar a: Nombre del instrumento, seleccione infinite 200Pro.
- Seleccione Luminiscencia y Script predeterminado.
- En el menú desplegable, elija el tipo de placa [BD96fb_Falcon-BD] Falcon 96 Flat Black.
- Determine qué pozos leer y resalte los pozos correspondientes en Parte de la placa.
- En Medidas en el lado izquierdo de la pantalla, arrastre y suelte Luminiscencia debajo de la Parte de la placa.
- Seleccione los parámetros de luminiscencia: Atenuación: NINGUNO; Tiempo de integración: 1000 ms; Tiempo de asentamiento: 0 ms.
- Retire la tapa de la placa y cárguela en el lector de placas. Presione Iniciar para comenzar.
- Al finalizar, exporte los datos y guárdelos.
6. Análisis de datos
- Calcule el porcentaje de viabilidad de la celda.
- Reste el "espacio en blanco" de cada pocillo para las lecturas corregidas en blanco. A continuación, calcule el promedio de control promediando los tres pozos de control.
- Utilice la siguiente ecuación para calcular el porcentaje de células viables en cada pocillo: (Pozo experimental / Promedio de control) x 100
- Grafique los datos resultantes en el software de análisis (consulte Tabla de materiales).
- Examine las métricas de la tasa de crecimiento (GR).
- Calcule manualmente las métricas de GR de acuerdo con el informe publicado34.
- Alternativamente, utilice la calculadora de GR en línea (ver Tabla de Materiales) para generar las métricas35. Utilice las mediciones del día 0 como "cell_count_time0", que reflejan la tasa de crecimiento de las PDO no tratadas.
- Exportar datos y gráficos.
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Representative Results
Estos resultados ilustran la respuesta de dos PDO al fármaco quimioterapéutico carboplatino, que se utiliza para tratar el cáncer de ovario. Los organoides se derivaron de la biopsia tumoral (PDO #1) y de la ascitis (PDO #2). Estos organoides se seleccionaron en función de su tiempo de duplicación percibido (1-2 días) y su aspecto morfológico (formación de muchos organoides grandes). Tanto la DOP #1 como la DOP #2 se sembraron en el día -2, en el pasaje dos, y el carboplatino se añadió en el día 0. Probamos las siguientes concentraciones de carboplatino diluidas en medios organoides avanzados: 1, 5, 10, 25, 50 y 75 μM. Al final del experimento en el día 7, se agregó el reactivo del ensayo de viabilidad a la placa y se analizaron los resultados. La Figura 2A muestra el porcentaje de células vivas después del tratamiento con carboplatino.
A continuación, se utilizó la calculadora de recursos genéticos en línea para analizar los datos. En ausencia de datos de recuento de células, se utilizaron los valores de luminiscencia medidos en el ensayo de viabilidad. Después de exportar las métricas de GR, se graficaron los valores de GR, que son las relaciones entre las tasas de crecimiento percibidas en condiciones tratadas y no tratadas normalizadas a una sola división celular34. Estos valores se graficaron con respecto a las concentraciones de carboplatino (Figura 2B). En la Tabla 1 se resumen las métricas de GR, incluidos los respectivos tiempos de duplicación de las células de control y tratadas y el área de GR sobre la curva (GR AOC), que integra la curva dosis-respuesta en un rango de concentraciones de carboplatino analizadas34. La sensibilidad a un fármaco en particular puede determinarse interpretando el valor de GR50 , correspondiente a la concentración a la que el fármaco tiene un efecto medio máximo. Por ejemplo, el valor de GR50 para la PDO #1 es mucho más alto que el de la PDO #2 (4,85 μMfrente a 0,97 μM), lo que indica que la PDO #1 es más resistente a la quimioterapia con platino que la PDO #2.
Figura 1: Organoides derivados del paciente antes del cribado de fármacos. (A) Esquema experimental para el cribado de drogas PDO. Dado el tiempo de duplicación de la línea de PDO y el tiempo de exposición al fármaco, es posible que sea necesario ajustar el plan experimental. (B) Imágenes representativas de campo claro (40x) de dos líneas PDO de cáncer de ovario (#1 y #2). Barra de escala = 50 μm. Abreviaturas: PDO = organoides derivados del paciente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resultados representativos del cáncer de ovario con PDO después del tratamiento con carboplatino. (A) Dos líneas de PDO fueron tratadas con concentraciones crecientes de carboplatino durante siete días. El eje X muestra la concentración de carboplatino; el eje Y muestra el % de células vivas normalizadas para controlar organoides (sin carboplatino). Los ensayos se completaron por triplicado con dos réplicas biológicas. Las barras de error denotan la desviación estándar. (B) Gráfico de valores GR que representa la concentración logarítmica de carboplatino (eje x) y el valor GR (eje Y). Estos valores se generaron en la calculadora de GR en línea. Las barras de error indican la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tratamiento | Tiempo de duplicación de la célula de control | Tiempo de duplicación de las células tratadas | GR50 | GR_AOC | |
| DOP #1 | Carboplatino | 0.744 | 0.112 | 4.85 | 1.28 |
| DOP #2 | Carboplatino | 0.972 | 0.0532 | 0.97 | 1.51 |
Tabla 1: Tabla que muestra el tiempo de duplicación de la célula de control, el tiempo de duplicación de la célula tratada, el GR50 y los valores de GR_AOC generados en la calculadora de GR. Abreviaturas: PDO = organoides derivados del paciente, GR = tasa de crecimiento, GR_AOC = área de la tasa de crecimiento sobre la curva.
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Discussion
En este artículo se describe un método que se puede utilizar para evaluar los efectos terapéuticos de fármacos convencionales o novedosos en las PDO del cáncer de ovario. Los investigadores deben tener en cuenta varias cuestiones antes de realizar el ensayo de viabilidad en el modelo PDO.
En primer lugar, al seleccionar una PDO para utilizar en el ensayo de viabilidad, se debe determinar el tipo de organoide ideal (tumor vs. ascitis) y el número de paso para sus necesidades. En nuestra experiencia, las PDO derivadas de la ascitis crecen más rápidamente y son más fáciles de generar que las PDO derivadas de tumores. Debido a que este ensayo depende de la tasa de crecimiento, puede ser difícil usar organoides que tardan mucho tiempo en formarse/crecer. Solo hemos utilizado con éxito líneas DOP con tiempos de duplicación de menos de 4 días.
En segundo lugar, en este estudio se utilizaron placas negras opacas de 96 pocillos. Dado que el ensayo de viabilidad de ATP se basa en la luminiscencia, los pocillos transparentes reducirán la intensidad de la señal y generarán contaminación de la señal. Las placas inferiores transparentes de paredes opacas permiten la visualización de organoides durante el ensayo y pueden ayudar a controlar los cambios inducidos por el tratamiento en la morfología celular. Aunque es una fortaleza relacionada con el costo, una limitación de este ensayo es el uso de una placa de 96 pocillos, que limita el número de muestras y medicamentos que se pueden evaluar simultáneamente.
En tercer lugar, el número de células sembradas debe considerarse cuidadosamente y optimizarse para los ensayos de viabilidad. Esto es especialmente cierto debido a la tasa de crecimiento variable de las líneas DOP; Muy pocas células no formarán organoides, y demasiadas células conducirán a un crecimiento excesivo de organoides. Para garantizar la distribución uniforme de las células, se utilizó un contador automático de células que mantuvo la misma relación BME-medio (75:25). Este alto porcentaje de BME garantiza que las gotas permanezcan solidificadas durante todo el ensayo. Aquí, se colocaron 3 μL de gotas de BME en el centro del pocillo. Aunque se puede aumentar el tamaño de la gota, advertimos que no se debe cubrir todo el pozo. El recubrimiento de todo el pocillo hará que los organoides se asienten en los bordes del pocillo, lo que impedirá su crecimiento general y afectará los resultados del ensayo de viabilidad. La colocación descentrada de la gota está bien siempre que no toque los bordes del pocillo.
En cuarto lugar, el autopipeteo introduce errores humanos, pero esto puede superarse prestando atención a los detalles y mediante la inclusión de pozos de control adicionales.
Por último, la longitud del ensayo debe seleccionarse cuidadosamente. La exposición prolongada a los fármacos afectará a la viabilidad de las DOP, independientemente del mecanismo de acción del fármaco. Por esta razón, es importante analizar un rango de concentraciones de drogas durante un mínimo de cinco días. Es importante decidir si será necesario cambiar los medios durante períodos más largos, ya que los niveles reducidos de factores de crecimiento impedirán los efectos de los medicamentos36. Para examinar si será necesario cambiar los medios durante el ensayo, es necesario comparar los resultados de los controles del día 0 y del día 7. Los controles de PDO no tratados deben seguir creciendo a lo largo del ensayo de forma continua.
A medida que las DOP continúen avanzando en complejidad y recapitulando mejor sus tejidos de origen, su uso debería mejorar el descubrimiento de fármacos. Sin embargo, es probable que las DOP sigan siendo un recurso precioso y requieran métodos rentables para preservar y optimizar su uso. A diferencia de las técnicas de rendimiento medio y alto, este protocolo se puede utilizar para probar compuestos conocidos y novedosos a un costo menor con materiales y equipos fácilmente disponibles. Por último, este método se puede adaptar fácilmente a diferentes modelos de organoides cancerosos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Premio Número R01CA243511. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. Los autores agradecen a Deborah Frank por sus comentarios editoriales.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Plastic Tubes | |||
| 15 mL Plastic Tubes | |||
| 96 well Flat Black Plates | MidSci | 781968 | |
| Advance Organoid Media | see Graham et al 2022 (Jove) | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher | 12634028 | |
| Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | |
| Brightfield Microscope | |||
| Carboplatin | Teva Pharmaceuticals USA | NDC 00703-4246-01 | |
| CellTiter-Glo 3D Viability | Promega | G9681 | |
| Cultrex | R & D Systems | 3533-010-02 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| GR Calculator | http://www.grcalculator.org | Online calculator | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. | ||
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Plate Rocker | |||
| Sterile P10, P200, and P1000 Barrier Sterile Pipette Tips | |||
| Sterile P10, P200, and P1000 Pipettes | |||
| Tecan Infinte 200Pro Plate Reader; i-Control Software | Tecan | ||
| TrypLE | Thermo Fisher | 12605010 | Organoid dissociation reagent |
References
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