Summary
我们提出了一种方案，可用于对患者来源的卵巢癌类器官进行治疗性药物测试。
Abstract
卵巢癌是一种致命的妇科癌症，也是美国女性癌症死亡的第五大原因。开发新的药物治疗对于推进医疗保健和改善患者预后至关重要。类器官是体外三维多细胞微型器官。卵巢癌的患者来源类器官 （PDO） 模型可能是药物筛选的最佳选择，因为它们比二维细胞培养模型更准确地概括感兴趣的组织，并且与患者来源的异种移植物相比价格低廉。此外，卵巢癌PDO模拟了卵巢癌中通常观察到的可变肿瘤微环境和遗传背景。在这里，描述了一种可用于测试源自卵巢癌组织和腹水的PDO的常规和新型药物的方法。基于发光的三磷酸腺苷 （ATP） 测定用于测量活力、生长速率和药物敏感性。PDO 中的药物筛选可以在 7-10 天内完成，具体取决于类器官形成和药物治疗的速度。
Introduction
卵巢癌虽然罕见，但是最致命的妇科癌症之一 1,2.开发新疗法的一个挑战是卵巢癌是异质性的，并且患者之间的肿瘤微环境差异很大。此外，许多卵巢癌对铂类化疗和聚（ADP-核糖）聚合酶抑制剂产生耐药性，这凸显了对更多治疗选择的需求3,4,5。
一种可能有助于识别新疗法的方法是使用患者来源的类器官 （PDO）。类器官是多种细胞类型的三维簇，它们在体外自组织并形成“微型器官”6,7,8,9,10。类器官可以概括重要的组织形态和基因表达谱11,12。一些最早的类器官来源于小鼠和人类的肠道、胃癌和结肠癌细胞 8,9,13。长寿命类器官培养物已从多种良性和恶性组织中建立，包括膀胱、结肠、胃、胰腺、脑、视网膜和肝脏 14,15,16。我们之前演示了从卵巢癌肿瘤和腹水样本中建立 PDO 的方法17。PDO 可用于研究分子特征、细胞机制和新型药物治疗 18,19,20。与传统的二维原代细胞培养相比，PDO 具有用于药物筛选的几个优势。虽然原代二维培养是一种低成本的药物筛选方法，但原代细胞培养是单细胞类型，缺乏肿瘤的三维结构 21,22,23。然而，PDO 是一种宝贵的资源，需要具有成本效益的方案来优化其在治疗药物筛选中的使用。
本文描述了一种使用卵巢癌 PDO 来测试已知或候选药物效果的体外方法。目前使用 PDO 的中高通量药物筛选需要昂贵的自动分液仪器 24,25,26，而这种具有成本效益的方法使用现成的基本实验室用品和基于 ATP 的细胞活力测定，采用标准 96 孔板格式（图 1A）。这种方法将有助于在扩大到更大的屏幕之前对新型卵巢癌药物进行初步测试27,28。虽然这里使用了卵巢癌PDO，但这种方法可以应用于其他癌症类器官模型。
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Protocol
本研究的人体标本收集得到了华盛顿大学医学院机构审查委员会的批准。所有 18 岁以上符合条件的患者均被诊断或推定为高级别浆液性卵巢癌，并且愿意并能够提供知情同意。除腹水和胸腔积液外，原发部位或转移部位的肿瘤组织均在护理时从同意的患者处获得。
1. 选择已建立的PDO进行活力测定
注意：通常，这些类器官位于前五个通道内。如前所述，卵巢癌PDO是通过将原代细胞悬浮在基底膜提取物（BME）中（如Cultrex或Matrigel17 ）而形成的（见 材料表）。
- PDO 的感知倍增时间应为 24-72 小时，以获得最佳测定效率。通过直观地确定传代/电镀后类器官形成所需的天数来估计感知的倍增时间。
注意：根据我们的经验，需要超过三天才能形成的类器官不能用于这种生长抑制测定。 - 确定药物并选择一系列浓度进行测试（例如，卡铂，0-50μM，参见 材料表）。
- 确定板设置。该测定将一式三份进行，限制可以在一个板上测试的药物数量和浓度。
注意：在进行测定之前，必须仔细观察选定的PDO系。已建立的卵巢癌PDO形成多细胞实心和空心球体，具有肿瘤样出芽形状（图1B）。在进行测定29-33 之前，必须将 PDO 形态、基因组图谱等与患者样本的形态（如果可能）进行比较。卵巢癌 PDO 可由原发性和转移性肿瘤样本和腹水产生17。
2. 活力测定的试剂制备
- 基础培养基：对于高级 DMEM/F12，加入 1% （v/v） 青霉素-链霉素、1x 谷氨酸和 1% （v/v）HEPES17 （见 材料表）。
- 根据先前发表的报告17 为卵巢癌类器官准备高级类器官培养基。
3. 类器官的电镀（~第 -2 天）
注意：此步骤必须在添加药物前 1-3 天执行。在开始之前，将所有试剂（基础培养基，高级类器官培养基和类器官解离试剂;参见 材料表）在水浴中加热至37°C。在冰水浴中解冻BME。
- 使用明场显微镜确认感兴趣的类器官是否融合 70%-90%。
注意：建议保存类器官的图像以备将来参考。 - 向含有类器官的孔中加入 1-2 mL 加热的基础培养基，并上下移液以机械解离含有 BME 的类器官。将整个溶液转移到 15 mL 锥形管17 中。
注意：通常，1-2 mL 培养基足以适当稀释 BME。同一患者和传代的类器官可以组合。 - 涡旋5-10秒以进一步解离细胞，并在室温（RT）下以1107× g 离心5分钟。
- 用单通道移液管除去上清液并丢弃。将类器官重悬于1 mL类器官解离试剂中（参见 材料表），并转移到1.5 mL微量离心管中。在37°C孵育7分钟。
- 如果由于残留的 BME 而使沉淀仍呈凝胶状，则再加入 1 mL 基础培养基，涡旋 5-10 秒，然后重复离心。
- 在室温下以 1107 x g 离心 5 分钟。 取出并弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 1 mL 基础培养基中。
- 使用自动细胞计数器（参见 材料表）或血细胞计数器计算每个PDO培养物中的细胞数。
- 每 10 μL 25% 基础培养基和 75% BME 重悬 20,000 个细胞。通过将类器官重悬于培养基中并与 BME 混合来做到这一点。
- 将一滴 3 μL 重悬的 BME + PDO 细胞铺入黑色不透明 96 孔板的一个孔中（参见 材料表）。将液滴放在每个孔的中心。将每种药物浓度一式三份。
注意：由于细胞活力测定是基于发光的，因此最好使用黑色不透明板以避免背景。透明板可用于在测定过程中可视化类器官，但在测量发光之前，板的底部应用不透明胶带覆盖。 - 在37°C的细胞培养箱中孵育板15分钟。
- 向每个孔中加入 100 μL 高级类器官培养基。孵育板24-72小时（根据感知的PDO倍增时间确定）。将 100 μL 高级类器官培养基加入空孔中，用作空白。
注意：目标是允许类器官形成。 - 可选：对于生长速率分析，将额外的一式三份 PDO 铺在单独的板中。这将用于在时间 = 0 时计数细胞，并应在第 0 天使用第 5 节中描述的活力测定进行测定。
4. 在第 0 天添加用于活力测定的药物
注意：第 0 天是指将药物添加到完全形成的类器官中的那一天。
- 将预先类器官培养基中的选定药物稀释至所需浓度。可以在 1.5 mL 试管或预先设置的 96 孔板中进行稀释，这样可以使用多通道移液器来分配培养基。
注意：药物必须重悬于制造商建议的溶剂中，例如二甲基亚砜。在这项研究中，在高级类器官培养基中制备了以下卡铂稀释液：1、5、10、25、50 和 75 μM。 - 用单通道或多通道移液器从每个孔中取出培养基，注意不要触摸或干扰PDO / BME液滴。
- 向每个孔中加入 100 μL 高级类器官培养基和所需药物。确保向三个控制孔中添加新鲜培养基。
注意：药物浓度会有所不同，并取决于科学问题和药物作用机制。在决定使用什么浓度时，我们从先前在可比的 2D 细胞系（例如，永生化卵巢癌细胞系）中建立的药物浓度开始。如果对类器官没有观察到影响，则可能需要增加浓度。 - 根据需要刷新培养基和药物（重复步骤4.1-4.3）。是否需要刷新培养基取决于检测时间、药物的生物活性和药物的半衰期。对于超过一周的检测，培养基至少需要刷新一次。
5. 结束读出的活力测定（~第 7 天）
注意：此步骤可以在第 7-10 天执行。测定长度必须根据被测药物的半衰期和药效学确定。
- 让活力测定试剂在黑暗中达到室温。将试剂在4°C下储存过夜（在黑暗中）以减少解冻时间。
- 从细胞培养箱中取出测定板，使其适应室温30分钟。盘子不必在黑暗中适应。
- 向每个孔中加入 100 μL 活力测定试剂（参见 材料表）（总体积为 200 μL），并置于板振荡器上 5 分钟 （80 rpm）。从振荡器中取出板，并在室温下再孵育25分钟。用箔纸或不透明的盒子盖住盘子，确保盘子始终避光。
- 打开生物发光酶标仪并打开 i-control 软件（参见 材料表）。
- 在 “连接到：仪器名称”下，选择 无限 200Pro。
- 选择“发光”（ Luminescence ） 和 “默认脚本”（Default Script）。
- 从下拉菜单中，选择板类型 [BD96fb_Falcon-BD] Falcon 96 Flat Black。
- 确定要读取的孔，并在 “板的一部分”下突出显示相应的孔。
- 在屏幕左侧的 “测量 ”下，将 “发光 ”拖放到“板的部件”下。
- 选择发光参数：衰减：无;积分时间：1000毫秒;建立时间：0 ms。
- 从板上取下盖子并将其装入读板器。按 开始 开始。
- 完成后，导出数据并保存。
6. 数据分析
- 计算细胞活力百分比。
- 从每个孔中减去“空白”，以获得空白校正读数。接下来，通过对三个控制井进行平均来计算控制平均值。
- 使用以下公式计算每个孔中活细胞的百分比：（实验孔/对照平均值）x 100
- 在分析软件中绘制结果数据图（参见 材料表）。
- 检查增长率 （GR） 指标。
- 根据已发布的报告手动计算 GR 指标34.
- 或者，使用在线 GR 计算器（参见 材料表）生成指标35。使用第 0 天的测量值作为“cell_count_time0”，它反映了未经处理的 PDO 的生长率。
- 导出数据和图表。
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Representative Results
这些结果说明了两种PDO对用于治疗卵巢癌的化疗药物卡铂的反应。类器官来源于肿瘤活检 （PDO #1） 和腹水 （PDO #2）。这些类器官是根据其感知的倍增时间（1-2天）和形态学外观（许多大类器官的形成）来选择的。PDO #1 和 PDO #2 均在第 -2 天的第 2 次传代时接种，并在第 0 天加入卡铂。我们测试了在高级类器官培养基中稀释的以下卡铂浓度：1、5、10、25、50 和 75 μM。在第7天实验结束时，将活力测定试剂加入到平板中，并对结果进行分析。 图2A 描述了卡铂处理后活细胞的百分比。
接下来，使用在线GR计算器对数据进行分析。在没有细胞计数数据的情况下，使用在活力测定中测量的发光值。导出 GR 指标后，绘制 GR 值，这是处理和未处理条件下感知生长率之间的比率，归一化为单细胞分裂34。然后将这些值与卡铂浓度作图（图2B）。 表 1 总结了 GR 指标，包括相应的对照和处理的细胞倍增时间以及 GR 曲线面积 （GRAOC），它整合了测试的一系列卡铂浓度的剂量反应曲线34。对特定药物的敏感性可以通过解释GR 50值来确定，GR50 值对应于药物具有一半最大作用的浓度。例如，PDO #1 的 GR 50 值远高于 PDO #2 的 GR50 值（4.85 μMvs. 0.97 μM），表明 PDO #1 对铂类化疗的耐药性比 PDO #2 更强。
图 1：药物筛选前患者来源的类器官。 （一）PDO药物筛选实验大纲。考虑到PDO线的倍增时间和药物暴露时间，可能需要调整实验计划。（B） 两条卵巢癌 PDO 线（#1 和 #2）的代表性明场图像 （40x）。比例尺 = 50 μm。缩写：PDO = 患者来源的类器官。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：卡铂治疗后卵巢癌 PDO 的代表性结果。 （A） 两条PDO线用浓度递增的卡铂处理7天。X轴显示卡铂浓度;Y 轴显示归一化以控制类器官（无卡铂）的活细胞百分比。检测一式三份，两次生物学重复。误差线表示标准偏差。（B） 代表对数卡铂浓度（x 轴）和 GR 值（y 轴）的 GR 值图。这些值是在在线 GR 计算器中生成的。误差线表示标准偏差。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 治疗 | 对照池倍增时间 | 处理过的细胞倍增时间 | GR50型 | GR_AOC | |
| PDO #1 | 卡铂 | 0.744 | 0.112 | 4.85 | 1.28 |
| PDO #2 | 卡铂 | 0.972 | 0.0532 | 0.97 | 1.51 |
表 1：描述了 GR 计算器中生成的对照细胞倍增时间、处理细胞倍增时间、GR50 和 GR_AOC 值的表格。 缩写：PDO = 患者来源的类器官，GR = 生长速率，GR_AOC = 曲线上的生长速率面积。
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Discussion
本文介绍了一种可用于评估常规或新型药物对卵巢癌 PDO 的治疗效果的方法。在PDO模型中进行活力测定之前，研究人员必须考虑几个问题。
首先，在选择用于活力测定的PDO时，必须确定理想的类器官类型（肿瘤 与腹水）和传代次数以满足他们的需要。根据我们的经验，腹水衍生的PDO比肿瘤衍生的PDO生长更快，更容易产生。由于该测定取决于生长速率，因此使用需要很长时间才能形成/生长的类器官可能很困难。我们只成功使用了倍增时间不到 4 天的 PDO 生产线。
其次，本研究使用不透明的黑色 96 孔板。由于ATP活力测定是基于发光的，透明孔将降低信号强度并产生信号污染。不透明壁透明底板允许在测定过程中可视化类器官，并可能有助于监测治疗诱导的细胞形态变化。虽然这是一个与成本相关的优势，但该测定的局限性是使用 96 孔板，这限制了可以同时评估的样品和药物的数量。
第三，必须仔细考虑并优化细胞的接种量，以进行活力测定。由于PDO线的可变增长率，这一点尤其正确;细胞太少不会形成类器官，细胞太多会导致类器官过度生长。为了确保细胞的均匀分布，使用了自动细胞计数器并保持相同的 BME 与培养基比率 （75：25）。这种高百分比的 BME 可确保液滴在整个检测过程中保持固化状态。在这里，将 3 μL BME 液滴置于孔的中心。虽然液滴的尺寸可以增加，但我们警告不要包覆整个孔。包被整个孔会导致类器官沉淀在孔的边缘，这既会阻碍它们的整体生长，也会影响活力测定结果。液滴的偏心放置是可以的，只要它不接触孔的边缘。
第四，自移液会引入人为错误，但这可以通过关注细节和包含额外的控制孔来克服。
最后，必须仔细选择测定的长度。长时间接触药物会影响PDO的活力，与药物作用机制无关。因此，在至少五天内测试一系列药物浓度非常重要。重要的是要决定是否需要更长时间地更换培养基，因为生长因子水平的降低会阻碍药物的作用36.为了检查在测定过程中是否需要更换培养基，需要比较第 0 天和第 7 天对照的结果。未经处理的PDO对照品应在整个测定过程中持续生长。
随着PDO的复杂性不断提高，并更好地概括其起源组织，它们的使用应该会改善药物发现。然而，PDO 可能仍然是一种宝贵的资源，需要具有成本效益的方法来保存和优化其使用。与中高通量技术不同，该协议可用于使用现成的材料和设备以较低的成本测试已知和新型化合物。最后，这种方法可以很容易地适应不同的癌症类器官模型。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本出版物中报告的研究得到了美国国立卫生研究院国家癌症研究所的支持，奖项编号为R01CA243511。内容完全由作者负责，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。作者感谢黛博拉·弗兰克（Deborah Frank）的编辑评论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Plastic Tubes | |||
| 15 mL Plastic Tubes | |||
| 96 well Flat Black Plates | MidSci | 781968 | |
| Advance Organoid Media | see Graham et al 2022 (Jove) | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher | 12634028 | |
| Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | |
| Brightfield Microscope | |||
| Carboplatin | Teva Pharmaceuticals USA | NDC 00703-4246-01 | |
| CellTiter-Glo 3D Viability | Promega | G9681 | |
| Cultrex | R & D Systems | 3533-010-02 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| GR Calculator | http://www.grcalculator.org | Online calculator | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. | ||
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Plate Rocker | |||
| Sterile P10, P200, and P1000 Barrier Sterile Pipette Tips | |||
| Sterile P10, P200, and P1000 Pipettes | |||
| Tecan Infinte 200Pro Plate Reader; i-Control Software | Tecan | ||
| TrypLE | Thermo Fisher | 12605010 | Organoid dissociation reagent |
References
- Matulonis, U. A., Sood, A. K., Fallowfield, L., Howitt, B. E., Sehouli, J. m, Karlan, B. Y.
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Christie, E. L., Bowtell, D. D. L. Acquired chemotherapy resistance in ovarian cancer. Annals of Oncology. 28 (suppl_8), viii13-viii15 (2017).
- Wang, L., Wang, Q., Xu, Y., Cui, M., Han, L. Advances in the treatment of ovarian cancer using PARP inhibitors and the underlying mechanism of resistance. Current Drug Targets. 21 (2), 167-178 (2020).
- Wang, Q., Peng, H., Qi, X., Wu, M., Zhao, X. Targeted therapies in gynecological cancers: a comprehensive review of clinical evidence. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 137 (2020).
- Hofer, M., Lutolf, M. P.
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
- Schutgens, F., Clevers, H. Human organoids: Tools for understanding biology and treating diseases. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 211-234 (2020).
- Zhao, Z., et al.
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. W.
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Graham, O., et al. Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids. Journal of Visualized Experiments. 191, e64878 (2023).
- Liu, C., Qin, T., Huang, Y., Li, Y., Chen, G., Sun, C. Drug screening model meets cancer organoid technology. Translational Oncology. 13 (11), 100840 (2020).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
- Zhou, Z., Cong, L., Cong, X. Patient-derived organoids in precision medicine: drug screening, organoid-on-a-chip and living organoid biobank. Frontiers in Oncology. 11, 762184 (2021).
- Costa, E. C., Moreira, A. F., de Melo-Diogo, D., Gaspar, V. M., Carvalho, M. P., Correia, I. J. 3D tumor spheroids: an overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).
- Foo, M. A., et al. Clinical translation of patient-derived tumour organoids- bottlenecks and strategies. Biomarker Research. 10 (1), 10 (2022).
- Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Bergdorf, K., et al. High-throughput drug screening of fine-needle aspiration-derived cancer organoids. STAR Protocols. 1 (3), 100212 (2020).
- Phan, N., et al. A simple high-throughput approach identifies actionable drug sensitivities in patient-derived tumor organoids. Communications Biology. 2 (1), 78 (2019).
- Putker, M., et al. Medium-throughput drug- and radiotherapy screening assay using patient-derived organoids. Journal of Visualized Experiments. 170, e62495 (2021).
- Dahlin, J. L., Inglese, J., Walters, M. A. Mitigating risk in academic preclinical drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 279-294 (2015).
- Honkala, A., Malhotra, S. V., Kummar, S., Junttila, M. R. Harnessing the predictive power of preclinical models for oncology drug development. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (2), 99-114 (2022).
- de Witte, C. J., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids mimic clinical response and exhibit heterogeneous inter- and intrapatient drug responses. Cell Reports. 31 (11), 107762 (2020).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
- Maenhoudt, N., Vankelecom, H. Protocol for establishing organoids from human ovarian cancer biopsies. STAR Protocols. 2 (2), 100429 (2021).
- Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Scientific Reports. 10 (1), 12581 (2020).
- Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs. Nat Methods. 13 (6), 521-527 (2016).
- Clark, N. A., et al. GRcalculator: an online tool for calculating and mining dose-response data. BMC Cancer. 17 (1), 698 (2017).
- Senkowski, W., et al. A platform for efficient establishment and drug-response profiling of high-grade serous ovarian cancer organoids. Developmental Cell. 58 (12), 1106.e7-1121.e7 (2023).
