Summary
患者由来の卵巣がんオルガノイドを用いた治療薬試験の実施に使用できるプロトコルを提示します。
Abstract
卵巣がんは致命的な婦人科がんであり、米国の女性のがんによる死亡原因の第5位です。新薬の開発は、医療を進歩させ、患者の転帰を改善するために不可欠です。オルガノイドは、in vitroの3次元多細胞ミニチュア臓器です。卵巣がんの患者由来オルガノイド(PDO)モデルは、2次元細胞培養モデルよりも対象組織をより正確に再現し、患者由来の異種移植片と比較して安価であるため、薬物スクリーニングに最適である可能性があります。さらに、卵巣がんPDOは、卵巣がんに典型的に見られる可変的な腫瘍微小環境および遺伝的背景を模倣している。ここでは、卵巣癌組織および腹水に由来するPDO上で従来薬および新規薬剤を試験するために用いることができる方法について説明する。発光ベースのアデノシン三リン酸(ATP)アッセイは、生存率、成長率、および薬剤感受性を測定するために使用されます。PDOの薬物スクリーニングは、オルガノイド形成と薬物治療の速度に応じて、7〜10日で完了できます。
Introduction
まれではありますが、卵巣がんは最も致命的な婦人科がんの1つです1,2。新しい治療法の開発における課題は、卵巣がんが不均一であり、腫瘍の微小環境が患者によって大きく異なることです。さらに、多くの卵巣がんは、プラチナ製剤ベースの化学療法およびポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ阻害剤に対する耐性を発現し、より大きな治療選択肢の必要性を強調しています3,4,5。
新しい治療法の特定に役立つ可能性のあるアプローチの1つは、患者由来オルガノイド(PDO)を使用することです。オルガノイドは、複数の細胞タイプの3次元クラスターであり、自己組織化してin vitroで「ミニ臓器」を形成します6,7,8,9,10。オルガノイドは、重要な組織形態および遺伝子発現プロファイルを再現することができる11,12。最初のオルガノイドのいくつかは、マウスとヒトの両方の腸がん細胞、胃がん細胞、結腸がん細胞に由来していました8,9,13。膀胱、結腸、胃、膵臓、脳、網膜、肝臓など、広範囲の良性および悪性組織から長寿命のオルガノイド培養が確立されています14,15,16。私たちは以前、卵巣癌の腫瘍と腹水サンプルからPDOを確立する方法を実証しました17。PDOは、分子特性、細胞メカニズム、および新しい薬物治療の研究に使用できます18,19,20。PDOには、薬物スクリーニングのための従来の2次元初代細胞培養に比べていくつかの利点があります。一次二次元培養は薬物スクリーニングのための低コストの方法であるが、初代細胞培養は単一細胞タイプであり、腫瘍の三次元構造を欠いている21、22、23。それにもかかわらず、PDOは貴重なリソースであり、治療薬スクリーニングでの使用を最適化するには、費用対効果の高いプロトコルが必要です。
本稿では、卵巣がんPDOを使用して既知薬または候補薬の効果を試験するin vitro法について述べる。PDOを用いた現在のミディアムスループットおよびハイスループットの薬物スクリーニングには、高価な自動分注装置が必要ですが24、25、26、この費用対効果の高い方法では、すぐに入手できる基本的なラボ用品と、標準的な96ウェルプレートフォーマットのATPベースの細胞生存率アッセイを使用します(図1A)。この方法は、より大きなスクリーニングにスケールアップする前に、新しい卵巣がん治療薬の予備試験を容易にします27,28。ここでは卵巣がんのPDOが用いられていますが、この方法は他のがんオルガノイドモデルにも適用できます。
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Protocol
この研究のための人体標本の収集は、ワシントン大学医学部の治験審査委員会によって承認されました。18歳以上のすべての適格な患者は、高悪性度漿液性卵巣がんの診断を受けたか、診断されたと推定され、インフォームドコンセントを提供する意思と能力がありました。腹水および胸水に加えて、原発部位または転移部位のいずれかの腫瘍組織は、ケア時に同意された患者から得られた。
1. 生存率試験のための既成PDOの選定
注:通常、これらのオルガノイドは最初の5継代以内にあります。前述したように、卵巣がんPDOは、CultrexやMatrigel17 などの基底膜抽出物(BME)に初代細胞懸濁液を再懸濁することによって形成されます( 資料表参照)。
- PDOは、アッセイの効率を最大限に高めるために、24〜72時間の倍加時間を認識する必要があります。継代/プレーティング後にオルガノイドが形成されるまでの日数を視覚的に決定することにより、知覚される倍加時間を推定します。
注:私たちの経験では、形成に3日以上かかるオルガノイドは、この成長阻害アッセイには使用できません。 - 薬物を同定し、試験する濃度の範囲を選択します(例:カルボプラチン、0-50 μM、 材料表を参照)。
- プレートの設定を決定します。このアッセイは 3 回に分けて実施されるため、1 枚のプレートでテストできる薬物の数と濃度が制限されます。
注:アッセイを実行する前に、選択したPDOラインを注意深く観察する必要があります。確立された卵巣がんPDOは、腫瘍様の出芽形状を持つ多細胞の固体および中空球を形成します(図1B)。PDOの形態、ゲノムプロファイルなどは、アッセイ29〜33を実行する前に、(可能な場合)患者サンプルのそれと比較する必要があります。卵巣がんのPDOは、原発性および転移性腫瘍サンプルおよび腹水から生成することができる17。
2. 生存率アッセイのための試薬調製
- ベース培地:高度なDMEM/F12には、1%(v/v)のペニシリン-ストレプトマイシン、1xグルタマックス、および1%(v/v)HEPES17 を添加します( 材料表を参照)。
- 卵巣がんオルガノイド用のアドバンスオルガノイド培地を、以前に発表されたレポート17に従って調製します。
3. オルガノイドのプレーティング(~Day -2)
注:このステップは、薬を追加する1〜3日前に実行する必要があります。開始する前に、すべての試薬(ベース培地、アドバンスオルガノイド培地、オルガノイド解離試薬、 材料表を参照)をウォーターバスで37°Cに温めます。BMEを氷水浴で解凍します。
- 明視野顕微鏡を使用して、目的のオルガノイドが70%〜90%コンフルエントであるかどうかを確認します。
注:オルガノイドの画像は、後で参照できるように保存しておくことをお勧めします。 - 温めたベース培地1〜2 mLをオルガノイドを含むウェルに加え、ピペットで上下させてBME含有オルガノイドを機械的に解離します。溶液全体を15mLのコニカルチューブ17に移す。
注:通常、BMEを適切に希釈するには、1〜2 mLの培地で十分です。同じ患者と継代のオルガノイドを組み合わせることができます。 - 5〜10秒間ボルテックスして細胞をさらに解離させ、室温(RT)で1107 x g で5分間遠心分離します。
- シングルチャンネルピペットで上清を取り除き、廃棄します。オルガノイドを1 mLのオルガノイド解離試薬( 材料表を参照)に再懸濁し、1.5 mLの微量遠心チューブに移します。37°Cで7分間インキュベートします。
- BMEが残っているためにペレットがまだゼラチン状になっている場合は、さらに1 mLのベース培地を加え、5〜10秒間ボルテックスし、遠心分離を繰り返します。
- 室温で1107 x g で5分間遠心分離し、上清を除去して廃棄し、細胞ペレットを1 mLのベース培地に再懸濁します。
- 自動セルカウンター( 材料表を参照)または血球計算盤を使用して、各PDO培養の細胞数をカウントします。
- 25%塩基培地および75%BMEの10 μLあたり20,000細胞で細胞を再懸濁します。これを行うには、培地中のオルガノイドを再懸濁し、BMEと混合します。
- 再懸濁した BME + PDO 細胞の 3 μL 液滴 1 個を、黒色不透明の 96 ウェルプレートの 1 つのウェルに播種します( 材料表を参照)。各ウェルの中央に液滴を置きます。各薬物濃度を3回に分けてプレーティングします。
注:細胞生存率アッセイは発光ベースであるため、バックグラウンドを避けるために黒色の不透明プレートを使用するのが最善です。アッセイ中にオルガノイドを可視化するために透明なプレートを使用できますが、発光を測定する前にプレートの底部を不透明なテープで覆う必要があります。 - 細胞培養インキュベーターで37°Cで15分間プレートをインキュベートします。
- 各ウェルに 100 μL の Advance Organoid Media を添加します。プレートを24〜72時間インキュベートします(知覚されたPDO倍加時間に応じて決定します)。100 μL の Advance Organoid Media を空のウェルに添加し、ブランクとして使用します。
注:目標は、オルガノイドの形成を可能にすることです。 - オプション:成長率分析では、追加のトリプリケートPDOを別のプレートにプレートします。これは、Time = 0 で細胞をカウントするために使用され、セクション 5 で説明した生存率アッセイを使用して 0 日目にアッセイする必要があります。
4.0日目の生存率アッセイのための薬剤の追加
注:0日目とは、完全に形成されたオルガノイドに薬剤が添加された日を指します。
- 選択した薬剤をAdvance Organoid Mediaで所望の濃度に希釈します。希釈は、1.5 mLチューブまたは事前にセットアップされた96ウェルプレートで行うことができ、マルチチャンネルピペットを使用して培地を分注することができます。
注:薬物は、ジメチルスルホキシドなど、メーカーが推奨する溶媒に再懸濁する必要があります。この研究では、Advance Organoid Mediaでカルボプラチンを1、5、10、25、50、および75 μMに希釈しました。 - シングルチャンネルまたはマルチチャンネルピペットで、PDO/BMEの液滴に触れたり邪魔したりしないように注意しながら、各ウェルから培地を取り除きます。
- 100 μL の Advance Organoid 培地と目的の薬剤を各ウェルに加えます。必ず 3 つのコントロールウェルに新鮮な培地を追加してください。
注:薬物濃度はさまざまで、科学的な疑問と薬物の作用機序によって異なります。使用する濃度を決定する際には、比較可能な2D細胞株(不死化卵巣がん細胞株など)で以前に確立された薬物濃度から始めます。オルガノイドへの影響が観察されない場合は、濃度を上げる必要があるかもしれません。. - 必要に応じて培地と薬剤をリフレッシュします(手順4.1〜4.3を繰り返します)。培地のリフレッシュが必要かどうかは、アッセイの長さ、薬物の生物学的活性、および薬物の半減期によって異なります。1週間以上のアッセイの場合、培地は少なくとも1回はリフレッシュする必要があります。
5. 読み出しのための生存率アッセイの終了(~7日目)
注:このステップは、7〜10日目に実行できます。アッセイの長さは、試験する薬物の半減期と薬力学に従って決定する必要があります。
- 生存率アッセイ試薬を暗所で室温に上げます。試薬を4°Cで一晩(暗所)で保存し、解凍時間を短縮します。
- アッセイプレートを細胞培養インキュベーターから取り出し、室温に30分間順応させます。プレートは暗闇で順応する必要はありません。
- 100 μLの生存率アッセイ試薬( 材料表を参照)を各ウェルに添加し(総容量200 μL)、プレートシェーカーに5分間(80 rpm)置きます。プレートをシェーカーから取り出し、室温でさらに25分間インキュベートします。プレートをホイルまたは不透明な箱で覆うことにより、プレートが常に光から保護されていることを確認してください。
- 生物発光プレートリーダーの電源を入れ、i-controlソフトウェアを開きます( 材料表を参照)。
- 「Connect to: Instrument Name」で「infinite 200Pro」を選択します。
- 「ルミネッセンス」と「デフォルトスクリプト」を選択します。
- ドロップダウンメニューから、プレートタイプ [BD96fb_Falcon-BD] Falcon 96 Flat Blackを選択します。
- どのウェルを読み取るかを決定し、 プレートの一部(Part of Plate)で対応するウェルをハイライト表示します。
- 画面左側の 測定値(Measurements )で、 ルミネッセンス(Luminescence )をプレートの部品(Part of Plate)の下にドラッグ&ドロップします。
- 発光パラメータを選択します: Attenuation: NONE;積分時間:1000ms;セトリング時間:0ms。
- プレートからカバーを取り外し、プレートリーダーにセットします。 [開始 ]を押して開始します。
- 完了したら、データをエクスポートして保存します。
6. データ解析
- 細胞生存率を計算します。
- すべてのウェルから「ブランク」を差し引いて、ブランク補正された読み取り値を取得します。次に、3つのコントロールウェルを平均化してコントロールアベレージを計算します。
- 次の式を使用して、各ウェル内の生細胞の割合を計算します:(実験ウェル/対照平均) x 100
- 解析ソフトウェアで結果のデータをグラフ化します( 材料表を参照)。
- 成長率 (GR) メトリックを調べます。
- 公開されたレポート34に従ってGRメトリックを手動で計算します。
- あるいは、オンラインGR計算機( 材料表を参照)を使用して、メトリック35を生成する。0日目の測定値を「cell_count_time0」として使用し、未処理のPDOの成長率を反映します。
- データとグラフをエクスポートします。
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Representative Results
これらの結果は、卵巣がんの治療に使用される化学療法薬カルボプラチンに対する2つのPDOの反応を示しています。オルガノイドは腫瘍生検(PDO #1)および腹水(PDO #2)に由来する。これらのオルガノイドは、知覚される倍加時間(1〜2日)と形態学的外観(多数の大きなオルガノイドの形成)に基づいて選択されました。PDO#1とPDO#2の両方を-2日目の継代2に播種し、カルボプラチンを0日目に添加しました。Advance Organoid Mediaで希釈したカルボプラチン濃度(1、5、10、25、50、75 μM)を試験しました。7日目の実験終了時に、生存率アッセイ試薬をプレートに添加し、結果を解析した。 図2A は、カルボプラチン処理後の生細胞の割合を示しています。
次に、オンラインのGR Calculatorを使用してデータを分析しました。細胞数データがない場合、生存率アッセイで測定された発光値を使用しました。GRメトリクスをエクスポートした後、GR値をグラフ化したが、これは、単一の細胞分裂に正規化された、処理された状態と未処理の状態における知覚された成長率との間の比率である34。次に、これらの値をカルボプラチン濃度に対してプロットしました(図2B)。 表1 は、それぞれのコントロール細胞と処理細胞の倍加時間、およびテストされたカルボプラチン濃度の範囲にわたる用量反応曲線を統合したGR曲線上のGR面積(GRAOC)を含むGR指標をまとめたものである34。特定の薬物に対する感受性は、薬物が半値効果を有する濃度に対応するGR50 値を解釈することによって決定することができる。例えば、PDO #1 の GR50 値は PDO #2 の値よりもはるかに高く (4.85 μM対 0.97 μM)、PDO #1 は PDO #2 よりも白金製剤化学療法に対する耐性が高いことを示しています。
図1:薬物スクリーニング前の患者由来オルガノイド。 (A)PDO薬物スクリーニングの実験概要。PDOラインの倍加時間と薬物曝露時間を考えると、実験計画を調整する必要があるかもしれません。(B)2つの卵巣がんPDOライン(#1および#2)の代表的な明視野画像(40倍)。スケールバー = 50 μm。略語:PDO = 患者由来オルガノイド。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:カルボプラチン治療後の卵巣がんPDOの代表的な結果。 (A)2つのPDO株をカルボプラチンの濃度を上げて7日間処理した。X軸はカルボプラチン濃度を示す。Y軸には、コントロールオルガノイド(カルボプラチンなし)に正規化された生細胞の割合が表示されます。アッセイは、2 回の生物学的複製で 3 回に分けて完了しました。誤差範囲は標準偏差を示します。(b)カルボプラチン濃度の対数(x軸)とGR値(y軸)を表すGR値グラフ。これらの値は、オンラインのGR計算機で生成されました。エラーバーは標準偏差を示します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| 処遇 | 制御セル倍加時間 | 処理細胞倍加時間 | GR50の | GR_AOC | |
| PDOの#1 | カルボプラチン | 0.744 | 0.112 | 4.85 | 1.28 |
| PDO#2 | カルボプラチン | 0.972 | 0.0532 | 0.97 | 1.51 |
表1:GR計算機で生成されたコントロールセルの倍加時間、処理細胞の倍加時間、GR50、およびGR_AOC値を示す表。 略語:PDO=患者由来オルガノイド、GR=成長率、GR_AOC=曲線上の成長率面積。
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Discussion
本稿では、卵巣がんPDOに対する従来薬または新規薬の治療効果を評価するために使用できる方法について説明する。研究者は、PDOモデルで生存率アッセイを実施する前に、いくつかの問題を考慮する必要があります。
まず、生存率アッセイで使用するPDOを選択する際には、理想的なオルガノイドタイプ(腫瘍と腹水 )と、そのニーズに合った継代数を決定する必要があります。私たちの経験では、腹水由来のPDOは腫瘍由来のPDOよりも急速に成長し、生成しやすいです。このアッセイは増殖速度に依存するため、形成/増殖に長い時間がかかるオルガノイドの使用は困難な場合があります。私たちは、4日未満の倍加時間でPDOラインをうまく使用しました。
第二に、この研究では不透明な黒色の96ウェルプレートを使用しました。ATP生存率アッセイは発光ベースであるため、透明なウェルはシグナル強度を低下させ、シグナルコンタミネーションを発生させます。不透明な壁の透明な底板は、アッセイ中のオルガノイドの可視化を可能にし、治療による細胞形態の変化のモニタリングに役立つ可能性があります。コスト面の強みではありますが、96ウェルプレートを用いるため、同時に評価できるサンプル数や薬剤数が限られるのが限界です。
第三に、播種する細胞の数を慎重に検討し、生存率アッセイのために最適化する必要があります。これは、PDOラインの成長率が変動するため、特に当てはまります。細胞が少なすぎるとオルガノイドが形成されず、細胞が多すぎるとオルガノイドが異常増殖します。細胞の均一な分布を確保するために、自動セルカウンターを使用し、同じBMEと培地の比率(75:25)を維持しました。この高い割合のBMEにより、アッセイ全体を通して液滴が固まったままになります。ここでは、3μLのBME液滴をウェルの中央に置いた。液滴の大きさは大きくできますが、全体をよくコーティングしないように注意してください。ウェル全体をコーティングすると、オルガノイドがウェルの縁に沈殿し、オルガノイド全体の成長が妨げられ、生存率アッセイの結果に影響を与えます。液滴の中心から外れた配置は、ウェルの端に触れない限り問題ありません。
第 4 に、セルフピペッティングは人為的ミスを招きますが、これは細部にまで気を配り、追加のコントロールウェルを含めることで克服できます。
最後に、アッセイの長さを慎重に選択する必要があります。薬物への長期曝露は、薬物の作用機序とは無関係に、PDOの生存率に影響を与えます。このため、最低5日間にわたってさまざまな薬物濃度をテストすることが重要です。成長因子のレベルが低下すると薬物の効果が妨げられるため、培地をより長期間交換する必要があるかどうかを判断することが重要です36。アッセイ中に培地を交換する必要があるかどうかを調べるには、0日目と7日目の対照の結果を比較する必要があります。未処理のPDOコントロールは、アッセイ全体を通して継続的に増殖し続ける必要があります。
PDOの複雑さが増し続け、PDOの起源組織をよりよく再現するにつれて、PDOの使用は創薬を改善するはずです。しかし、PDOは依然として貴重な資源であり続ける可能性が高く、その使用を維持および最適化するための費用対効果の高い方法が必要です。ミディアムスループットおよびハイスループット技術とは異なり、このプロトコルは、すぐに入手できる材料や機器を使用して、既知および新規の化合物を低コストで試験するために使用できます。最後に、この方法は、さまざまながんオルガノイドモデルに容易に適合させることができます。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
この出版物で報告された研究は、米国国立衛生研究所の国立がん研究所の助成を受け、賞番号R01CA243511。内容は著者の責任であり、必ずしも米国国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。著者は、デボラ・フランクの編集コメントに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Plastic Tubes | |||
| 15 mL Plastic Tubes | |||
| 96 well Flat Black Plates | MidSci | 781968 | |
| Advance Organoid Media | see Graham et al 2022 (Jove) | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher | 12634028 | |
| Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | |
| Brightfield Microscope | |||
| Carboplatin | Teva Pharmaceuticals USA | NDC 00703-4246-01 | |
| CellTiter-Glo 3D Viability | Promega | G9681 | |
| Cultrex | R & D Systems | 3533-010-02 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| GR Calculator | http://www.grcalculator.org | Online calculator | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. | ||
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Plate Rocker | |||
| Sterile P10, P200, and P1000 Barrier Sterile Pipette Tips | |||
| Sterile P10, P200, and P1000 Pipettes | |||
| Tecan Infinte 200Pro Plate Reader; i-Control Software | Tecan | ||
| TrypLE | Thermo Fisher | 12605010 | Organoid dissociation reagent |
References
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