Summary
We presenteren een protocol dat kan worden gebruikt om therapeutische geneesmiddelentests uit te voeren met van patiënten afkomstige eierstokkankerorganoïden.
Abstract
Eierstokkanker is een dodelijke gynaecologische kanker en de vijfde belangrijkste doodsoorzaak door kanker bij vrouwen in de Verenigde Staten. Het ontwikkelen van nieuwe medicamenteuze behandelingen is cruciaal voor het bevorderen van de gezondheidszorg en het verbeteren van de resultaten voor patiënten. Organoïden zijn in-vitro driedimensionale meercellige miniatuurorganen. Patiënt-afgeleide organoïde (PDO) -modellen van eierstokkanker kunnen optimaal zijn voor het screenen van geneesmiddelen, omdat ze weefsels van belang nauwkeuriger recapituleren dan tweedimensionale celkweekmodellen en goedkoop zijn in vergelijking met van patiënten afgeleide xenotransplantaten. Bovendien bootsen BOB's voor eierstokkanker de variabele micro-omgeving en genetische achtergrond van de tumor na die doorgaans worden waargenomen bij eierstokkanker. Hier wordt een methode beschreven die kan worden gebruikt om conventionele en nieuwe geneesmiddelen te testen op BOB's die zijn afgeleid van eierstokkankerweefsel en ascites. Een op luminescentie gebaseerde adenosinetrifosfaat (ATP)-test wordt gebruikt om de levensvatbaarheid, groeisnelheid en gevoeligheid van het geneesmiddel te meten. Geneesmiddelenscreening in BOB's kan binnen 7-10 dagen worden voltooid, afhankelijk van de snelheid van organoïdevorming en medicamenteuze behandelingen.
Introduction
Hoewel zeldzaam, is eierstokkanker een van de meest dodelijke gynaecologische kankers 1,2. Een uitdaging bij het ontwikkelen van nieuwe behandelingen is dat eierstokkanker heterogeen is en dat de micro-omgeving van de tumor sterk verschilt tussen patiënten. Bovendien ontwikkelen veel eierstokkankers resistentie tegen op platina gebaseerde chemotherapie en poly (ADP-ribose) polymeraseremmers, wat de behoefte aan meertherapeutische opties benadrukt3,4,5.
Een benadering die nuttig kan zijn bij het identificeren van nieuwe therapieën is het gebruik van van patiënten afgeleide organoïden (BOB's). Organoïden zijn driedimensionale clusters van meerdere celtypen die zichzelf organiseren en in vitro "mini-organen" vormen6,7,8,9,10. Organoïden kunnen belangrijke weefselmorfologie en genexpressieprofielen recapituleren11,12. Enkele van de eerste organoïden waren afgeleid van darm-, maag- en darmkankercellen van zowel muizen als mensen 8,9,13. Langlevende organoïdeculturen zijn vastgesteld uit een breed scala aan goedaardige en kwaadaardige weefsels, waaronder de blaas, dikke darm, maag, alvleesklier, hersenen, netvlies en lever 14,15,16. We hebben eerder methoden gedemonstreerd om BOB's vast te stellen uit eierstokkankertumoren en ascitesmonsters17. BOB's kunnen worden gebruikt om moleculaire kenmerken, cellulaire mechanismen en nieuwe medicamenteuze behandelingen te bestuderen 18,19,20. BOB's hebben verschillende voordelen ten opzichte van traditionele tweedimensionale primaire celculturen voor het screenen van geneesmiddelen. Hoewel primaire tweedimensionale culturen een goedkope methode zijn voor het screenen van geneesmiddelen, zijn primaire celculturen eencellige typen en missen ze de driedimensionale architectuur van tumoren 21,22,23. Desalniettemin zijn BOB's een kostbare hulpbron en zijn kosteneffectieve protocollen nodig om het gebruik ervan bij het screenen van therapeutische geneesmiddelen te optimaliseren.
Dit artikel beschrijft een in vitro methode om BOB's bij eierstokkanker te gebruiken om de effecten van bekende of kandidaat-geneesmiddelen te testen. Terwijl de huidige middellange- en high-throughput medicijnschermen met behulp van BOB's dure geautomatiseerde doseerinstrumenten vereisen 24,25,26, maakt deze kosteneffectieve methode gebruik van direct beschikbare basislaboratoriumbenodigdheden en een op ATP gebaseerde cellevensvatbaarheidstest in een standaard plaatformaat met 96 putjes (Figuur 1A). Deze methode zal voorbereidende tests van nieuwe geneesmiddelen tegen eierstokkanker vergemakkelijken voordat ze worden opgeschaald naar grotere schermen27,28. Hoewel hier BOB's voor eierstokkanker worden gebruikt, kan deze methode worden toegepast op andere kankerorganoïdemodellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De verzameling menselijke specimens voor dit onderzoek werd goedgekeurd door de Washington University School of Medicine Institutional Review Board. Alle in aanmerking komende patiënten ouder dan 18 jaar hadden een diagnose of vermoedelijke diagnose van hooggradige sereuze eierstokkanker en waren bereid en in staat om geïnformeerde toestemming te geven. Het tumorweefsel van primaire of gemetastaseerde plaatsen, naast ascites en pleuravocht, werd verkregen van patiënten met toestemming op het moment van zorg.
1. Selectie van vastgestelde BOB's voor levensvatbaarheidstest
OPMERKING: Meestal bevinden deze organoïden zich in de eerste vijf passages. Zoals eerder beschreven, worden BOB's bij eierstokkanker gevormd door primaire celsuspensie te resuspenderen in basaalmembraanextract (BME) zoals Cultrex of Matrigel17 (zie Materiaaltabel).
- BOB's moeten een waargenomen verdubbelingstijd van 24-72 uur hebben voor de beste efficiëntie van de test. Maak een schatting van de waargenomen verdubbelingstijd door visueel het aantal dagen te bepalen dat organoïden nodig hebben om zich te vormen na het passeren/plateren.
OPMERKING: Onze ervaring is dat organoïden die langer dan drie dagen nodig hebben om zich te vormen, niet kunnen worden gebruikt voor deze groeiremmingstest. - Identificeer geneesmiddelen en selecteer een reeks concentraties om te testen (bijv. Carboplatine, 0-50 μM, zie Tabel met materialen).
- Bepaal de plaatopstelling. Deze test zal in drievoud worden uitgevoerd, waardoor het aantal geneesmiddelen en concentraties dat op één plaat kan worden getest, wordt beperkt.
OPMERKING: Geselecteerde BOB-lijnen moeten zorgvuldig worden geobserveerd voordat de test wordt uitgevoerd. Gevestigde BOB's voor eierstokkanker vormen meercellige vaste en holle bolletjes met tumorachtige ontluikende vormen (Figuur 1B). De morfologie van de BOB, het genoomprofiel, enz. moeten worden vergeleken met die van het patiëntmonster (indien mogelijk) voordat de test29-33 wordt uitgevoerd. BOB's voor eierstokkanker kunnen worden gegenereerd uit primaire en gemetastaseerde tumormonsters en ascites17.
2. Bereiding van het reagens voor de levensvatbaarheidstest
- Basismedia: Voeg aan geavanceerde DMEM/F12 1% (v/v) penicilline-streptomycine, 1x glutamax en 1% (v/v)HEPES17 toe (zie materiaaltabel).
- Bereid Advance Organoid Media voor eierstokkanker-organoïden voor naar aanleiding van eerder gepubliceerd rapport17.
3. Plateren van organoïden (~Dag -2)
OPMERKING: Deze stap moet 1-3 dagen voor het toevoegen van de medicijnen worden uitgevoerd. Verwarm voor aanvang alle reagentia (Base Media, Advance Organoid Media en Organoid Dissociation Reagens; zie Tabel met Materialen) tot 37 °C in een waterbad. Ontdooi BME in een ijswaterbad.
- Gebruik een helderveldmicroscoop om te bevestigen of interessante organoïden voor 70%-90% samenvloeien.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om afbeeldingen van de organoïden op te slaan voor toekomstig gebruik. - Voeg 1-2 ml verwarmde basismedia toe aan het putje met organoïden en pipette op en neer om de BME-bevattende organoïden mechanisch te dissociëren. Breng de volledige oplossing over in een conische buis van 15 ml17.
OPMERKING: Meestal is 1-2 ml media voldoende om de BME goed te verdunnen. Organoïden van dezelfde patiënt en passage kunnen worden gecombineerd. - Vortex gedurende 5-10 s om de cellen verder te dissociëren, en centrifugeer bij 1107 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Verwijder het supernatans met een enkelkanaalspipet en gooi het weg. Resuspendeer organoïden in 1 ml organoïdedissociatiereagens (zie Materiaaltabel) en breng over naar een microcentrifugebuisje van 1,5 ml. Incubeer gedurende 7 minuten bij 37 °C.
- Als de pellet nog gelatineachtig is vanwege de resterende BME, voeg dan nog eens 1 ml basismedia, vortex gedurende 5-10 s toe en herhaal de centrifugatie.
- Centrifugeer bij 1107 x g gedurende 5 minuten bij RT. Verwijder het supernatans en gooi het weg en resuspendeer de celpellet in 1 ml basismedia.
- Tel het aantal cellen in elke BOB-cultuur met behulp van een automatische celteller (zie Materiaaltabel) of een hemocytometer.
- Resuspendeer cellen bij 20.000 cellen per 10 μL van 25% basismedia en 75% BME. Doe dit door de organoïden in de media te resuspenderen en te mengen met BME.
- Plaat één druppel van 3 μL geresuspendeerde BME + BOB-cellen in één putje van een zwarte ondoorzichtige plaat met 96 putjes (zie Materiaaltabel). Plaats de druppels in het midden van elk putje. Registreer elke geneesmiddelconcentratie in drievoud.
OPMERKING: Aangezien de cellevensvatbaarheidstest op luminescentie is gebaseerd, is het het beste om zwarte ondoorzichtige platen te gebruiken om achtergrond te vermijden. Transparante platen kunnen worden gebruikt om organoïden te visualiseren tijdens de test, maar de onderkant van de platen moet worden bedekt met ondoorzichtige tape voordat de luminescentie wordt gemeten. - Incubeer de plaat in een celkweekincubator bij 37 °C gedurende 15 min.
- Voeg 100 μL Advance Organoid Media toe aan elk putje. Incubeer de plaat gedurende 24-72 uur (bepaal op basis van de waargenomen PDO-verdubbelingstijd). Voeg 100 μL Advance Organoid Media toe aan een leeg putje voor gebruik als blanco.
OPMERKING: Het doel is om organoïden te laten vormen. - Optioneel: Voor de analyse van de groeisnelheid plaatst u extra BOB's in drievoud in een aparte plaat. Dit zal worden gebruikt om cellen te tellen op tijdstip = 0 en moet op dag 0 worden getest met behulp van de levensvatbaarheidstest beschreven in sectie 5.
4. Toevoeging van geneesmiddelen voor de levensvatbaarheidstest op dag 0
OPMERKING: Dag 0 verwijst naar de dag waarop de medicijnen worden toegevoegd aan de volledig gevormde organoïden.
- Verdun geselecteerde geneesmiddelen in Advance Organoid Media tot de gewenste concentraties. Verdunningen kunnen worden gemaakt in buisjes van 1,5 ml of in een vooraf ingestelde plaat met 96 putjes, waardoor een meerkanaalspipet kan worden gebruikt om de media te doseren.
OPMERKING: Geneesmiddelen moeten opnieuw worden gesuspendeerd in het oplosmiddel dat door de fabrikant wordt aanbevolen, zoals dimethylsulfoxide. Voor deze studie werden de volgende verdunningen van carboplatine in Advance Organoid Media gemaakt: 1, 5, 10, 25, 50 en 75 μM. - Verwijder de media uit elk putje met een enkel- of meerkanaalspipet en zorg ervoor dat u de BOB/BME-druppel niet aanraakt of verstoort.
- Voeg 100 μL Advance Organoid Media en het gewenste geneesmiddel(en) toe aan elk putje. Zorg ervoor dat u verse media toevoegt aan de drie controleputten.
OPMERKING: Geneesmiddelconcentraties variëren en zijn afhankelijk van de wetenschappelijke vraag en het werkingsmechanisme van het geneesmiddel. Bij het beslissen welke concentraties we moeten gebruiken, beginnen we met eerder vastgestelde geneesmiddelconcentraties in vergelijkbare 2D-cellijnen (bijv. onsterfelijke eierstokkankercellijnen). Het kan nodig zijn de concentraties te verhogen als er geen effect op organoïden wordt waargenomen. - Ververs media en medicijnen indien nodig (herhaal stap 4.1-4.3). Of de media moeten worden ververst, hangt af van de testlengte, de biologische activiteit van het medicijn en de halfwaardetijd van het medicijn. Voor tests van meer dan een week moeten de media minstens één keer worden ververst.
5. Beëindiging van de levensvatbaarheidstest voor uitlezing (~Dag 7)
OPMERKING: Deze stap kan worden uitgevoerd op dag 7-10. De duur van de test moet worden bepaald aan de hand van de halfwaardetijd en farmacodynamiek van de geneesmiddelen die worden getest.
- Laat de reagentia van de levensvatbaarheidstest in het donker op kamertemperatuur komen. Bewaar de reagentia 's nachts (in het donker) bij 4 °C om de dooitijd te verkorten.
- Verwijder de testplaat uit de celkweekincubator en laat deze gedurende 30 minuten acclimatiseren tot kamertemperatuur. De plaat hoeft niet te acclimatiseren in het donker.
- Voeg 100 μl levensvatbaarheidstestreagens (zie materiaaltabel) toe aan elk putje (voor een totaal volume van 200 μl) en plaats het gedurende 5 minuten (80 rpm) op een platenschudder. Haal de plaat uit de shaker en incubeer nog eens 25 minuten op kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de plaat altijd beschermd is tegen licht door deze af te dekken met folie of een ondoorzichtige doos.
- Schakel de bioluminescentieplaatlezer in en open de i-control-software (zie Materiaaltabel).
- Selecteer onder Verbinden met: Instrumentnaam de optie oneindig 200Pro.
- Selecteer Luminescentie en standaardscript.
- Kies in het vervolgkeuzemenu het plaattype [BD96fb_Falcon-BD] Falcon 96 Flat Black.
- Bepaal welke putjes je wilt lezen en markeer de bijbehorende putjes onder Part of Plate.
- Sleep onder Metingen aan de linkerkant van het scherm Luminescentie onder het Onderdeel van de plaat.
- Selecteer de luminescentieparameters: Demping: GEEN; Integratietijd: 1000 ms; Vestigingstijd: 0 ms.
- Verwijder het deksel van de plaat en plaats het in de plaatlezer. Druk op Start om te beginnen.
- Na voltooiing gegevens exporteren en opslaan.
6. Data-analyse
- Bereken het percentage levensvatbaarheid van de cel.
- Trek de "Blanco" af van elk putje voor de Blanco Gecorrigeerde metingen. Bereken vervolgens het controlegemiddelde door het gemiddelde te nemen van de drie controleputten.
- Gebruik de volgende vergelijking om het percentage levensvatbare cellen in elk putje te berekenen: (Experimenteel putje / Controlegemiddelde) x 100
- Maak een grafiek van de resulterende gegevens in de analysesoftware (zie Tabel met materialen).
- Onderzoek de statistieken van het groeipercentage (GR).
- Bereken handmatig de GR-metriek volgens het gepubliceerde rapport34.
- U kunt ook de online GR-calculator (zie Materiaaltabel) gebruiken om de statistiekente genereren 35. Gebruik de metingen op dag 0 als "cell_count_time0", die de groeisnelheid van de onbehandelde BOB's weergeven.
- Exporteer gegevens en grafiek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze resultaten illustreren de respons van twee BOB's op het chemotherapiemedicijn carboplatine, dat wordt gebruikt voor de behandeling van eierstokkanker. Organoïden werden afgeleid van tumorbiopsie (PDO #1) en van ascites (PDO #2). Deze organoïden werden geselecteerd op basis van hun waargenomen verdubbelingstijd (1-2 dagen) en morfologische verschijning (vorming van veel grote organoïden). Zowel BOB #1 als BOB #2 werden geplateerd op dag -2, bij passage twee, en carboplatine werd toegevoegd op dag 0. We hebben de volgende carboplatineconcentraties getest verdund in Advance Organoid Media: 1, 5, 10, 25, 50 en 75 μM. Aan het einde van het experiment op dag 7 werd het reagens van de levensvatbaarheidstest aan de plaat toegevoegd en werden de resultaten geanalyseerd. Figuur 2A toont het percentage levende cellen na behandeling met carboplatine.
Vervolgens werd de online GR Calculator gebruikt om de gegevens te analyseren. Bij gebrek aan gegevens over het celgetal werden de luminescentiewaarden gebruikt die in de levensvatbaarheidstest werden gemeten. Na het exporteren van de GR-metriek werden de GR-waarden in een grafiek weergegeven, dit zijn de verhoudingen tussen waargenomen groeisnelheden in behandelde en onbehandelde aandoeningen genormaliseerd tot een enkele celdeling34. Deze waarden werden vervolgens uitgezet tegen de carboplatineconcentraties (figuur 2B). Tabel 1 geeft een overzicht van de GR-statistieken, inclusief de respectievelijke verdubbelingstijden voor controle- en behandelde cellen en de GR Area Over the Curve (GRAOC), die de dosis-responscurve integreert over een reeks geteste carboplatineconcentraties34. De gevoeligheid voor een bepaald medicijn kan worden bepaald door de GR50-waarde te interpreteren, die overeenkomt met de concentratie waarbij het medicijn een half-maximaal effect heeft. De GR50-waarde voor BOB #1 is bijvoorbeeld veel hoger dan die voor BOB #2 (4,85 μMvs. 0,97 μM), wat aangeeft dat BOB #1 beter bestand is tegen platinachemotherapie dan BOB #2.
Figuur 1: Van patiënten afgeleide organoïden vóór screening van geneesmiddelen. (A) Experimenteel overzicht voor PDO-drugsscreening. Gezien de verdubbelingstijd van de BOB-lijn en de blootstellingstijd aan geneesmiddelen, moet het experimentele plan mogelijk worden aangepast. (B) Representatieve helderveldbeelden (40x) van twee PDO-lijnen voor eierstokkanker (#1 en #2). Schaalbalk = 50 μm. Afkortingen: BOB = patient-derived organoids. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve resultaten van eierstokkanker BOB na behandeling met carboplatine. (A) Twee BOB-lijnen werden gedurende zeven dagen behandeld met toenemende concentraties carboplatine. De X-as toont de carboplatineconcentratie; de Y-as toont het % levende cellen dat is genormaliseerd om organoïden te controleren (geen carboplatine). De tests werden in drievoud uitgevoerd met twee biologische replicaten. De foutbalken geven de standaarddeviatie aan. (B) GR-waardegrafiek die de logaritmische carboplatineconcentratie (x-as) en de GR-waarde (Y-as) weergeeft. Deze waarden zijn gegenereerd in de online GR-calculator. De foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Behandeling | Verdubbelingstijd van de controlecel | Verdubbelingstijd van behandelde cellen | GR50 | GR_AOC | |
| BOB #1 | Carboplatine | 0.744 | 0.112 | 4.85 | 1.28 |
| BOB #2 | Carboplatine | 0.972 | 0.0532 | 0.97 | 1.51 |
Tabel 1: Tabel met de verdubbelingstijd van de controlecel, de verdubbelingstijd van de behandelde cel, GR50 en GR_AOC waarden die in de GR-calculator zijn gegenereerd . Afkortingen: BOB = van de patiënt afgeleide organoïden, GR = groeisnelheid, GR_AOC = groeisnelheid oppervlakte over de curve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel beschrijft een methode die kan worden gebruikt om de therapeutische effecten van conventionele of nieuwe geneesmiddelen op BOB's bij eierstokkanker te beoordelen. Onderzoekers moeten verschillende zaken in overweging nemen voordat ze de levensvatbaarheidstest in het BOB-model uitvoeren.
Ten eerste moet men bij het selecteren van een BOB om te gebruiken in de levensvatbaarheidstest het ideale organoïdetype (tumor vs. ascites) en het passagenummer voor hun behoeften bepalen. Onze ervaring is dat van ascites afgeleide BOB's sneller groeien en gemakkelijker te genereren zijn dan van tumoren afgeleide BOB's. Omdat deze test afhankelijk is van de groeisnelheid, kan het moeilijk zijn om organoïden te gebruiken die er lang over doen om zich te vormen/groeien. We hebben alleen met succes gebruik gemaakt van BOB-lijnen met verdubbelingstijden van minder dan 4 dagen.
Ten tweede werden in dit onderzoek ondoorzichtige zwarte platen met 96 putjes gebruikt. Aangezien de ATP-levensvatbaarheidstest op luminescentie is gebaseerd, zullen transparante putjes de signaalintensiteit verminderen en signaalverontreiniging genereren. Ondoorzichtige, transparante bodemplaten maken de visualisatie van organoïden tijdens de test mogelijk en kunnen helpen bij het monitoren van door de behandeling geïnduceerde veranderingen in de celmorfologie. Hoewel het een sterkte is die verband houdt met de kosten, is een beperking van deze test het gebruik van een plaat met 96 putjes, waardoor het aantal monsters en medicijnen dat tegelijkertijd kan worden geëvalueerd, wordt beperkt.
Ten derde moet het aantal geplateerde cellen zorgvuldig worden overwogen en geoptimaliseerd voor levensvatbaarheidstests. Dit geldt met name vanwege de variabele groeisnelheid van BOB-lijnen; Te weinig cellen zullen geen organoïden vormen en te veel cellen zullen leiden tot overgroei van organoïden. Om de uniforme verdeling van de cellen te garanderen, werd een automatische cellenteller gebruikt die dezelfde BME-tot-mediaverhouding (75:25) handhaafde. Dit hoge percentage BME zorgt ervoor dat de druppels gedurende de hele test gestold blijven. Hier werden druppeltjes BME van 3 μL in het midden van de put geplaatst. Hoewel de grootte van de druppel kan worden vergroot, waarschuwen we tegen het coaten van de hele put. Door de hele put te coaten, zullen de organoïden zich in de randen van de put nestelen, wat zowel hun algehele groei zal belemmeren als de resultaten van de levensvatbaarheidstest zal beïnvloeden. Plaatsing van de druppel uit het midden is prima, zolang deze de randen van de put niet raakt.
Ten vierde introduceert zelfpipetteren menselijke fouten, maar dit kan worden ondervangen door aandacht voor detail en het opnemen van extra controleputten.
Ten slotte moet de lengte van de test zorgvuldig worden gekozen. Langdurige blootstelling aan geneesmiddelen zal de levensvatbaarheid van BOB's beïnvloeden, onafhankelijk van het werkingsmechanisme van het geneesmiddel. Om deze reden is het belangrijk om gedurende minimaal vijf dagen een reeks geneesmiddelconcentraties te testen. Het is belangrijk om te beslissen of de media voor langere perioden moeten worden vervangen, omdat verminderde niveaus van groeifactoren de effecten van de medicijnen zullen belemmeren36. Om te onderzoeken of de media tijdens de test moeten worden vervangen, moet men de resultaten van de controles op dag 0 en dag 7 vergelijken. Onbehandelde BOB-controles moeten gedurende de hele test continu blijven groeien.
Naarmate BOB's steeds complexer worden en hun weefsels van oorsprong beter kunnen recapituleren, zou het gebruik ervan de ontdekking van geneesmiddelen moeten verbeteren. BOB's zullen echter waarschijnlijk een kostbare hulpbron blijven en vereisen kosteneffectieve methoden om het gebruik ervan te behouden en te optimaliseren. In tegenstelling tot medium- en high-throughput-technieken, kan dit protocol worden gebruikt om bekende en nieuwe verbindingen tegen lagere kosten te testen met gemakkelijk verkrijgbare materialen en apparatuur. Ten slotte kan deze methode gemakkelijk worden aangepast aan verschillende organoïdemodellen van kanker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Onderzoek dat in deze publicatie wordt gerapporteerd, werd ondersteund door het National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder Award Number R01CA243511. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. De auteurs danken Deborah Frank voor haar redactionele commentaar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Plastic Tubes | |||
| 15 mL Plastic Tubes | |||
| 96 well Flat Black Plates | MidSci | 781968 | |
| Advance Organoid Media | see Graham et al 2022 (Jove) | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher | 12634028 | |
| Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | |
| Brightfield Microscope | |||
| Carboplatin | Teva Pharmaceuticals USA | NDC 00703-4246-01 | |
| CellTiter-Glo 3D Viability | Promega | G9681 | |
| Cultrex | R & D Systems | 3533-010-02 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| GR Calculator | http://www.grcalculator.org | Online calculator | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. | ||
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Plate Rocker | |||
| Sterile P10, P200, and P1000 Barrier Sterile Pipette Tips | |||
| Sterile P10, P200, and P1000 Pipettes | |||
| Tecan Infinte 200Pro Plate Reader; i-Control Software | Tecan | ||
| TrypLE | Thermo Fisher | 12605010 | Organoid dissociation reagent |
References
- Matulonis, U. A., Sood, A. K., Fallowfield, L., Howitt, B. E., Sehouli, J. m, Karlan, B. Y.
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Christie, E. L., Bowtell, D. D. L. Acquired chemotherapy resistance in ovarian cancer. Annals of Oncology. 28 (suppl_8), viii13-viii15 (2017).
- Wang, L., Wang, Q., Xu, Y., Cui, M., Han, L. Advances in the treatment of ovarian cancer using PARP inhibitors and the underlying mechanism of resistance. Current Drug Targets. 21 (2), 167-178 (2020).
- Wang, Q., Peng, H., Qi, X., Wu, M., Zhao, X. Targeted therapies in gynecological cancers: a comprehensive review of clinical evidence. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 137 (2020).
- Hofer, M., Lutolf, M. P.
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
- Schutgens, F., Clevers, H. Human organoids: Tools for understanding biology and treating diseases. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 211-234 (2020).
- Zhao, Z., et al.
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. W.
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Graham, O., et al. Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids. Journal of Visualized Experiments. 191, e64878 (2023).
- Liu, C., Qin, T., Huang, Y., Li, Y., Chen, G., Sun, C. Drug screening model meets cancer organoid technology. Translational Oncology. 13 (11), 100840 (2020).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
- Zhou, Z., Cong, L., Cong, X. Patient-derived organoids in precision medicine: drug screening, organoid-on-a-chip and living organoid biobank. Frontiers in Oncology. 11, 762184 (2021).
- Costa, E. C., Moreira, A. F., de Melo-Diogo, D., Gaspar, V. M., Carvalho, M. P., Correia, I. J. 3D tumor spheroids: an overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).
- Foo, M. A., et al. Clinical translation of patient-derived tumour organoids- bottlenecks and strategies. Biomarker Research. 10 (1), 10 (2022).
- Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Bergdorf, K., et al. High-throughput drug screening of fine-needle aspiration-derived cancer organoids. STAR Protocols. 1 (3), 100212 (2020).
- Phan, N., et al. A simple high-throughput approach identifies actionable drug sensitivities in patient-derived tumor organoids. Communications Biology. 2 (1), 78 (2019).
- Putker, M., et al. Medium-throughput drug- and radiotherapy screening assay using patient-derived organoids. Journal of Visualized Experiments. 170, e62495 (2021).
- Dahlin, J. L., Inglese, J., Walters, M. A. Mitigating risk in academic preclinical drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 279-294 (2015).
- Honkala, A., Malhotra, S. V., Kummar, S., Junttila, M. R. Harnessing the predictive power of preclinical models for oncology drug development. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (2), 99-114 (2022).
- de Witte, C. J., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids mimic clinical response and exhibit heterogeneous inter- and intrapatient drug responses. Cell Reports. 31 (11), 107762 (2020).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
- Maenhoudt, N., Vankelecom, H. Protocol for establishing organoids from human ovarian cancer biopsies. STAR Protocols. 2 (2), 100429 (2021).
- Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Scientific Reports. 10 (1), 12581 (2020).
- Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs. Nat Methods. 13 (6), 521-527 (2016).
- Clark, N. A., et al. GRcalculator: an online tool for calculating and mining dose-response data. BMC Cancer. 17 (1), 698 (2017).
- Senkowski, W., et al. A platform for efficient establishment and drug-response profiling of high-grade serous ovarian cancer organoids. Developmental Cell. 58 (12), 1106.e7-1121.e7 (2023).
