Summary
Vi presenterar ett protokoll som kan användas för att genomföra terapeutiska läkemedelstester med patienthärledda äggstockscancerorganoider.
Abstract
Äggstockscancer är en dödlig gynekologisk cancer och den femte vanligaste orsaken till cancerdöd bland kvinnor i USA. Att utveckla nya läkemedelsbehandlingar är avgörande för att utveckla sjukvården och förbättra patientresultaten. Organoider är in vitro tredimensionella flercelliga miniatyrorgan. Patient-derived organoid (PDO) modeller av äggstockscancer kan vara optimala för läkemedelsscreening eftersom de mer exakt rekapitulerar vävnader av intresse än tvådimensionella cellodlingsmodeller och är billiga jämfört med patient-deriverade xenograft. Dessutom efterliknar PDO:er för äggstockscancer den variabla tumörmikromiljön och genetiska bakgrunden som vanligtvis observeras vid äggstockscancer. Här beskrivs en metod som kan användas för att testa konventionella och nya läkemedel på SUB som härrör från äggstockscancervävnad och ascites. En luminiscensbaserad adenosintrifosfat (ATP) analys används för att mäta viabilitet, tillväxthastighet och läkemedelskänslighet. Läkemedelsscreening i SUB kan slutföras på 7-10 dagar, beroende på organoidbildningshastigheten och läkemedelsbehandlingar.
Introduction
Även om äggstockscancer är sällsynt är den en av de mest dödliga gynekologiska cancerformerna 1,2. En utmaning vid utveckling av nya behandlingar är att äggstockscancer är heterogen och att tumörens mikromiljö skiljer sig mycket åt mellan patienterna. Dessutom utvecklar många äggstockscancerformer resistens mot platinabaserad kemoterapi och poly (ADP-ribos) polymerashämmare, vilket belyser behovet av fler terapeutiska alternativ 3,4,5.
Ett tillvägagångssätt som kan vara användbart för att identifiera nya terapier är att använda patient-deriverade organoider (PDO). Organoider är tredimensionella kluster av flera celltyper som självorganiserar sig och bildar in vitro "miniorgan"6,7,8,9,10. Organoider kan rekapitulera viktig vävnadsmorfologi och genuttrycksprofiler11,12. Några av de första organoiderna härrörde från tarm-, mag- och tjocktarmscancerceller från både möss och människor 8,9,13. Långlivade organoidkulturer har etablerats från ett brett spektrum av godartade och maligna vävnader, inklusive urinblåsan, tjocktarmen, magen, bukspottkörteln, hjärnan, näthinnan och levern 14,15,16. Vi har tidigare demonstrerat metoder för att etablera PDO:er från äggstockscancertumörer och ascitesprover17. SUB kan användas för att studera molekylära egenskaper, cellulära mekanismer och nya läkemedelsbehandlingar 18,19,20. SUB har flera fördelar jämfört med traditionella tvådimensionella primära cellkulturer för läkemedelsscreening. Även om primära tvådimensionella kulturer är en billig metod för läkemedelsscreening, är primära cellkulturer encellstyper och saknar den tredimensionella arkitekturen hos tumörer 21,22,23. Icke desto mindre är SUB en värdefull resurs, och kostnadseffektiva protokoll behövs för att optimera deras användning vid terapeutisk läkemedelsscreening.
Denna artikel beskriver en in vitro-metod för att använda PDO:er för äggstockscancer för att testa effekterna av kända läkemedel eller läkemedelskandidater. Medan nuvarande läkemedelsscreening med medelhög och hög kapacitet som använder SUB kräver dyra automatiserade dispenseringsinstrument 24,25,26, använder denna kostnadseffektiva metod lättillgängliga grundläggande laboratorieförnödenheter och en ATP-baserad cellviabilitetsanalys i ett standardformat med 96-brunnars plattor (figur 1A). Denna metod kommer att underlätta preliminära tester av nya läkemedel mot äggstockscancer innan de skalas upp till större skärmar27,28. Även om PDO:er för äggstockscancer används här, kan denna metod tillämpas på andra cancerorganoidmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Insamlingen av mänskliga prover för denna forskning godkändes av Washington University School of Medicine Institutional Review Board. Alla kvalificerade patienter över 18 år hade en diagnos eller förmodad diagnos av höggradig serös äggstockscancer och var villiga och kapabla att ge informerat samtycke. Tumörvävnaden från antingen primära eller metastaserande platser, förutom ascites och pleuravätska, erhölls från samtyckta patienter vid vårdtillfället.
1. Urval av etablerade skyddade ursprungsbeteckningar för genomförbarhetstest
OBS: Vanligtvis finns dessa organoider inom de första fem passagerna. Som tidigare beskrivits bildas PDO:er för äggstockscancer genom att primär cellsuspension återsuspenderas i basalmembranextrakt (BME) såsom Cultrex eller Matrigel17 (se materialförteckning).
- SUB bör ha en upplevd fördubblingstid på 24-72 timmar för bästa effektivitet av analysen. Uppskatta den upplevda fördubblingstiden genom att visuellt bestämma antalet dagar det tar för organoider att bildas efter passering/plätering.
OBS: Enligt vår erfarenhet kan organoider som tar längre tid än tre dagar att bildas inte användas för denna tillväxthämningsanalys. - Identifiera läkemedel och välj ett intervall av koncentrationer att testa (t.ex. karboplatin, 0-50 μM, se materialtabell).
- Bestäm plattans inställning. Denna analys kommer att utföras i tre exemplar, vilket begränsar antalet läkemedel och koncentrationer som kan testas på en platta.
OBS: Valda PDO-linjer måste observeras noggrant innan analysen utförs. Etablerade PDO:er för äggstockscancer bildar flercelliga, fasta och ihåliga sfärer med tumörliknande knoppande former (Figur 1B). SUB-morfologi, genomisk profil etc. måste jämföras med patientprovets (när så är möjligt) innan analys29-33 utförs. Skyddade ursprungsbeteckningar för äggstockscancer kan genereras från primära och metastaserande tumörprover och ascites17.
2. Beredning av reagens för viabilitetstestet
- Basmedia: Till avancerad DMEM/F12, tillsätt 1 % (v/v) penicillin-streptomycin, 1x glutamax och 1 % (v/v)HEPES17 (se materialförteckning).
- Förbered Advance Organoid Media för äggstockscancerorganoider enligt tidigare publicerad rapport17.
3. Plätering av organoider (~ Dag -2)
OBS: Detta steg måste utföras 1-3 dagar innan du lägger till läkemedlen. Värm alla reagenser (basmedia, avancerade organoidmedier och organoiddissociationsreagens innan du börjar, se materialtabell) till 37 °C i ett vattenbad. Tina BME i ett isvattenbad.
- Använd ett ljusfältsmikroskop för att bekräfta om organoider av intresse är 70%-90% sammanflytande.
OBS: Det rekommenderas att spara bilder av organoiderna för framtida referens. - Tillsätt 1-2 ml uppvärmt basmedia till de brunnsinnehållande organoiderna och pipettera upp och ner för att mekaniskt dissociera de BME-innehållande organoiderna. Överför hela lösningen till ett 15 ml koniskt rör17.
OBS: Vanligtvis räcker det med 1-2 ml media för att späda ut BME ordentligt. Organoider från samma patient och passage kan kombineras. - Virvla i 5-10 s för att ytterligare dissociera cellerna och centrifugera vid 1107 x g i 5 minuter vid rumstemperatur (RT).
- Ta bort supernatanten med en enkanalspipett och kassera. Återsuspendera organoider i 1 ml organoiddissociationsreagens (se materialtabell) och överför till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Inkubera i 7 minuter vid 37 °C.
- Om pelleten fortfarande är geléartad på grund av den återstående BME, tillsätt ytterligare 1 ml basmedia, virvla i 5-10 s, och upprepa centrifugeringen.
- Centrifugera vid 1107 x g i 5 minuter vid RT. Ta bort och kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 1 ml basmedia.
- Räkna antalet celler i varje odling med skyddad ursprungsbeteckning med hjälp av en automatisk cellräknare (se materialförteckning) eller en hemocytometer.
- Återsuspendera cellerna vid 20 000 celler per 10 μl 25 % basmedia och 75 % BME. Gör detta genom att suspendera organoiderna i mediet och blanda med BME.
- Platta en 3 μL droppar av resuspenderade BME + SUB-celler i en brunn på en svart ogenomskinlig 96-hålsplatta (se materialtabell). Placera dropparna i mitten av varje brunn. Platta varje läkemedelskoncentration i tre exemplar.
OBS: Eftersom cellviabilitetsanalysen är luminiscensbaserad är det bäst att använda svarta ogenomskinliga plattor för att undvika bakgrund. Transparenta plattor kan användas för att visualisera organoider under analysen, men botten av plattorna bör täckas med ogenomskinlig tejp innan luminiscensen mäts. - Inkubera plattan i en cellodlingsinkubator vid 37 °C i 15 minuter.
- Tillsätt 100 μl Advance Organoid Media till varje brunn. Inkubationsplattan i 24-72 timmar (bestäm enligt upplevd SUB-fördubblingstid). Tillsätt 100 μl Advance Organoid Media till en tom brunn för användning som blindprov.
OBS: Målet är att tillåta organoider att bildas. - Valfritt: För analys av tillväxthastigheten, platta ytterligare tre SUB i en separat platta. Detta kommer att användas för att räkna celler vid tid = 0 och bör analyseras dag 0 med hjälp av viabilitetstestet som beskrivs i avsnitt 5.
4. Tillsats av läkemedel för viabilitetstestet på dag 0
OBS: Dag 0 avser den dag då läkemedlen läggs till de fullt utvecklade organoiderna.
- Späd utvalda läkemedel i Advance Organoid Media till önskade koncentrationer. Spädningar kan göras i 1,5 ml rör eller i en förinställd 96-hålsplatta, vilket skulle möjliggöra användning av en flerkanalspipett för att dispensera mediet.
OBS: Läkemedel måste återsuspenderas i det lösningsmedel som rekommenderas av tillverkaren, såsom dimetylsulfoxid. För denna studie gjordes följande utspädningar av karboplatin i Advance Organoid Media: 1, 5, 10, 25, 50 och 75 μM. - Ta bort media från varje brunn med en pipett med en eller flera kanaler, var försiktig så att du inte vidrör eller stör PDO/BME-droppen.
- Tillsätt 100 μl Advance Organoid Media och önskat läkemedel till varje brunn. Se till att fylla på nytt media i de tre kontrollbrunnarna.
OBS: Läkemedelskoncentrationerna varierar och beror på den vetenskapliga frågan och läkemedlets verkningsmekanism. När vi bestämmer vilka koncentrationer som ska användas börjar vi med tidigare etablerade läkemedelskoncentrationer i jämförbara 2D-cellinjer (t.ex. immortaliserade äggstockscancercellinjer). Koncentrationerna kan behöva ökas om det inte finns någon observerad effekt på organoider. - Uppdatera media och läkemedel efter behov (upprepa steg 4.1-4.3). Huruvida mediet kommer att behöva uppdateras beror på analyslängden, läkemedlets biologiska aktivitet och läkemedlets halveringstid. För analyser under en vecka måste mediet uppdateras minst en gång.
5. Avsluta livskraftsanalysen för avläsning (~ dag 7)
OBS: Detta steg kan utföras på dag 7-10. Analyslängden måste bestämmas i enlighet med halveringstiden och farmakodynamiken för de läkemedel som testas.
- Låt viabilitetsanalysreagenserna nå rumstemperatur i mörker. Förvara reagenserna vid 4 °C över natten (i mörker) för att minska upptiningstiden.
- Ta bort analysplattan från cellodlingsinkubatorn och låt den acklimatisera sig till rumstemperatur i 30 minuter. Plattan behöver inte acklimatisera sig i mörkret.
- Tillsätt 100 μl viabilitetsanalysreagens (se materialtabell) till varje brunn (för en total volym på 200 μL) och placera på en plattskakare i 5 minuter (80 rpm). Ta bort plattan från shakern och inkubera i ytterligare 25 minuter i rumstemperatur. Se till att plattan alltid är skyddad från ljus genom att täcka den med folie eller en ogenomskinlig låda.
- Slå på bioluminiscensplattläsaren och öppna i-control-programvaran (se materialförteckning).
- Under Anslut till: Instrumentnamn väljer du infinite 200Pro.
- Välj Luminiscens och Standardskript.
- Från rullgardinsmenyn väljer du plåttyp [BD96fb_Falcon-BD] Falcon 96 Flat Black.
- Bestäm vilka brunnar som ska läsas och markera motsvarande brunnar under Del av plåt.
- Under Mått till vänster på skärmen, dra och släpp Luminescence under Del av plåt.
- Välj luminiscensparametrar: Dämpning: INGEN; Integrationstid: 1000 ms; Tidsavräkning: 0 ms.
- Ta bort locket från plattan och ladda det i plattläsaren. Tryck på Start för att börja.
- När du är klar exporterar du data och sparar.
6. Analys av data
- Beräkna cellviabiliteten i procent.
- Subtrahera "Blank" från varje brunn för de tomma korrigerade avläsningarna. Beräkna sedan kontrollmedelvärdet genom att beräkna medelvärdet av de tre kontrollbrunnarna.
- Använd följande ekvation för att beräkna procentandelen livskraftiga celler i varje brunn: (experimentell brunn / kontrollmedelvärde) x 100
- Rita upp resulterande data i analysprogrammet (se materialförteckning).
- Undersök tillväxttaktsmått (GR).
- Beräkna GR-måtten manuellt enligt den publicerade rapporten34.
- Alternativt kan du använda GR-kalkylatorn online (se Materialförteckning) för att generera mätvärdena35. Använd dag 0-mätningarna som "cell_count_time0", vilket återspeglar tillväxthastigheten för de obehandlade skyddade ursprungsvärdena.
- Exportera data och diagram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaten illustrerar hur två PDO:er svarar på cellgiftsläkemedlet karboplatin, som används för att behandla äggstockscancer. Organoider härleddes från tumörbiopsi (PDO #1) och från ascites (PDO #2). Dessa organoider valdes ut baserat på deras upplevda fördubblingstid (1-2 dagar) och morfologiska utseende (bildning av många stora organoider). Både PDO #1 och PDO #2 pläterades på dag -2, vid passage två, och karboplatin tillsattes på dag 0. Vi testade följande karboplatinkoncentrationer utspädda i Advance Organoid Media: 1, 5, 10, 25, 50 och 75 μM. Vid slutet av experimentet på dag 7 tillsattes viabilitetsanalysreagenset till plattan och resultaten analyserades. Figur 2A visar andelen levande celler efter karboplatinbehandling.
Därefter användes GR-kalkylatorn online för att analysera data. I avsaknad av cellräkningsdata användes de luminiscensvärden som uppmättes i viabilitetsanalysen. Efter att ha exporterat GR-måtten ritades GR-värdena, som är förhållandet mellan upplevd tillväxthastighet i behandlade och obehandlade tillstånd normaliserat till en enda celldelning34. Dessa värden plottades sedan mot karboplatinkoncentrationerna (figur 2B). Tabell 1 sammanfattar GR-måtten, inklusive respektive kontroll- och behandlad cellfördubblingstid och GR Area Over the Curve (GRAOC), som integrerar dos-responskurvan över ett intervall av testade karboplatinkoncentrationer34. Känsligheten för ett visst läkemedel kan bestämmas genom att tolka GR50-värdet , vilket motsvarar den koncentration vid vilken läkemedlet har en halv maximal effekt. Till exempel är GR50-värdet för PDO #1 mycket högre än det för PDO #2 (4,85 μMjämfört med 0,97 μM), vilket indikerar att PDO #1 är mer resistent mot platinakemoterapi än PDO #2.
Figur 1: Organoider från patienter före läkemedelsscreening. (A) Experimentell disposition för PDO-läkemedelsscreening. Med tanke på fördubblingstiden för PDO-linjen och exponeringstiden för läkemedlet kan försöksplanen behöva justeras. (B) Representativa ljusfältsbilder (40x) av två linjer för SUB för äggstockscancer (#1 och #2). Skalstapel = 50 μm. Förkortningar: PDO = patient-derived organoids. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representativa resultat av utplåning av äggstockscancer efter karboplatinbehandling. (A) Två SUB-linjer behandlades med ökande koncentrationer av karboplatin under sju dagar. X-axeln visar karboplatinkoncentrationen; Y-axeln visar procentandelen levande celler normaliserade för att kontrollera organoider (inget karboplatin). Analyserna genomfördes i tre exemplar med två biologiska replikat. Felstaplarna anger standardavvikelsen. (B) GR-värdesgraf som representerar den logaritmiska karboplatinkoncentrationen (x-axeln) och GR-värdet (Y-axeln). Dessa värden genererades i GR-kalkylatorn online. Felstaplarna anger standardavvikelsen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Behandling | Fördubblingstid för kontrollcell | Fördubblingstid för behandlade celler | GR50 | GR_AOC | |
| SUB #1 | Karboplatin | 0.744 | 0.112 | 4.85 | 1.28 |
| SUB #2 | Karboplatin | 0.972 | 0.0532 | 0.97 | 1.51 |
Tabell 1: Tabell som visar kontrollcellens fördubblingstid, fördubblingstid för behandlad cell, GR50 och GR_AOC värden som genererats i GR-kalkylatorn. Förkortningar: PDO = organoider från patienter, GR = tillväxthastighet, GR_AOC = tillväxthastighetsarean över kurvan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna artikel beskriver en metod som kan användas för att bedöma de terapeutiska effekterna av konventionella eller nya läkemedel på PDO:er för äggstockscancer. Forskare måste överväga flera frågor innan de utför viabilitetsanalysen i PDO-modellen.
För det första, när man väljer en PDO som ska användas i viabilitetsanalysen, måste man bestämma den ideala organoidtypen (tumör kontra ascites) och passagenummer för deras behov. Enligt vår erfarenhet växer ascites-härledda PDO:er snabbare och är lättare att generera än tumör-deriverade PDO:er. Eftersom denna analys beror på tillväxthastigheten kan det vara svårt att använda organoider som tar lång tid att bilda/växa. Vi har bara framgångsrikt använt PDO-linjer med fördubblingstider på mindre än 4 dagar.
För det andra användes ogenomskinliga svarta 96-hålsplattor i denna studie. Eftersom ATP-viabilitetsanalysen är luminiscensbaserad kommer transparenta brunnar att minska signalintensiteten och generera signalkontaminering. Ogenomskinliga, transparenta bottenplattor möjliggör visualisering av organoider under analysen och kan hjälpa till att övervaka behandlingsinducerade förändringar i cellmorfologi. Även om det är en styrka relaterad till kostnad, är en begränsning av denna analys att använda en 96-hålsplatta, vilket begränsar antalet prover och läkemedel som kan utvärderas samtidigt.
För det tredje måste antalet celler som pläteras noggrant övervägas och optimeras för viabilitetsanalyser. Detta gäller särskilt på grund av den varierande tillväxthastigheten för SUB-linjer; För få celler kommer inte att bilda organoider, och för många celler kommer att leda till överväxt av organoider. För att säkerställa en jämn fördelning av cellerna användes en automatisk cellräknare som bibehöll samma BME-till-media-förhållande (75:25). Denna höga andel BME säkerställer att dropparna förblir stelnade under hela analysen. Här placerades 3 μL droppar BME i mitten av brunnen. Även om droppens storlek kan ökas, varnar vi för att belägga hela brunnen. Beläggning av hela brunnen kommer att få organoiderna att sätta sig i brunnens kanter, vilket både kommer att hindra deras totala tillväxt och påverka livskraftsanalysresultaten. Placering av droppen utanför mitten är bra så länge den inte vidrör brunnens kanter.
För det fjärde medför självpipettering mänskliga fel, men detta kan övervinnas genom uppmärksamhet på detaljer och inkludering av ytterligare kontrollbrunnar.
Slutligen måste analysens längd väljas noggrant. Långvarig exponering för läkemedel kommer att påverka livskraften hos SUB, oberoende av läkemedlets verkningsmekanism. Av denna anledning är det viktigt att testa en rad läkemedelskoncentrationer under minst fem dagar. Det är viktigt att ta ställning till om medierna kommer att behöva bytas under längre perioder på grund av att minskade nivåer av tillväxtfaktorer kommer att hämma läkemedlens effekter36. För att undersöka om mediet kommer att behöva bytas under analysen behöver man jämföra resultaten från dag 0 och dag 7 kontroller. Obehandlade PDO-kontroller bör fortsätta att växa kontinuerligt under hela analysen.
I takt med att de skyddade ursprungsbeteckningarna fortsätter att öka i komplexitet och bättre rekapitulera sina ursprungsvävnader bör användningen av dem förbättra upptäckten av läkemedel. SUB kommer dock sannolikt att förbli en värdefull resurs och kräver kostnadseffektiva metoder för att bevara och optimera användningen. Till skillnad från medel- och högkapacitetstekniker kan detta protokoll användas för att testa kända och nya föreningar till lägre kostnad med lättillgängliga material och utrustning. Slutligen kan denna metod lätt anpassas till olika cancerorganoidmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Forskning som rapporteras i denna publikation stöddes av National Cancer Institute of the National Institutes of Health under utmärkelsenummer R01CA243511. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis National Institutes of Healths officiella åsikter. Författarna tackar Deborah Frank för hennes redaktionella kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Plastic Tubes | |||
| 15 mL Plastic Tubes | |||
| 96 well Flat Black Plates | MidSci | 781968 | |
| Advance Organoid Media | see Graham et al 2022 (Jove) | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher | 12634028 | |
| Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | |
| Brightfield Microscope | |||
| Carboplatin | Teva Pharmaceuticals USA | NDC 00703-4246-01 | |
| CellTiter-Glo 3D Viability | Promega | G9681 | |
| Cultrex | R & D Systems | 3533-010-02 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| GR Calculator | http://www.grcalculator.org | Online calculator | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. | ||
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Plate Rocker | |||
| Sterile P10, P200, and P1000 Barrier Sterile Pipette Tips | |||
| Sterile P10, P200, and P1000 Pipettes | |||
| Tecan Infinte 200Pro Plate Reader; i-Control Software | Tecan | ||
| TrypLE | Thermo Fisher | 12605010 | Organoid dissociation reagent |
References
- Matulonis, U. A., Sood, A. K., Fallowfield, L., Howitt, B. E., Sehouli, J. m, Karlan, B. Y.
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Christie, E. L., Bowtell, D. D. L. Acquired chemotherapy resistance in ovarian cancer. Annals of Oncology. 28 (suppl_8), viii13-viii15 (2017).
- Wang, L., Wang, Q., Xu, Y., Cui, M., Han, L. Advances in the treatment of ovarian cancer using PARP inhibitors and the underlying mechanism of resistance. Current Drug Targets. 21 (2), 167-178 (2020).
- Wang, Q., Peng, H., Qi, X., Wu, M., Zhao, X. Targeted therapies in gynecological cancers: a comprehensive review of clinical evidence. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 137 (2020).
- Hofer, M., Lutolf, M. P.
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
- Schutgens, F., Clevers, H. Human organoids: Tools for understanding biology and treating diseases. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 211-234 (2020).
- Zhao, Z., et al.
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. W.
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Graham, O., et al. Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids. Journal of Visualized Experiments. 191, e64878 (2023).
- Liu, C., Qin, T., Huang, Y., Li, Y., Chen, G., Sun, C. Drug screening model meets cancer organoid technology. Translational Oncology. 13 (11), 100840 (2020).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
- Zhou, Z., Cong, L., Cong, X. Patient-derived organoids in precision medicine: drug screening, organoid-on-a-chip and living organoid biobank. Frontiers in Oncology. 11, 762184 (2021).
- Costa, E. C., Moreira, A. F., de Melo-Diogo, D., Gaspar, V. M., Carvalho, M. P., Correia, I. J. 3D tumor spheroids: an overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).
- Foo, M. A., et al. Clinical translation of patient-derived tumour organoids- bottlenecks and strategies. Biomarker Research. 10 (1), 10 (2022).
- Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Bergdorf, K., et al. High-throughput drug screening of fine-needle aspiration-derived cancer organoids. STAR Protocols. 1 (3), 100212 (2020).
- Phan, N., et al. A simple high-throughput approach identifies actionable drug sensitivities in patient-derived tumor organoids. Communications Biology. 2 (1), 78 (2019).
- Putker, M., et al. Medium-throughput drug- and radiotherapy screening assay using patient-derived organoids. Journal of Visualized Experiments. 170, e62495 (2021).
- Dahlin, J. L., Inglese, J., Walters, M. A. Mitigating risk in academic preclinical drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 279-294 (2015).
- Honkala, A., Malhotra, S. V., Kummar, S., Junttila, M. R. Harnessing the predictive power of preclinical models for oncology drug development. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (2), 99-114 (2022).
- de Witte, C. J., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids mimic clinical response and exhibit heterogeneous inter- and intrapatient drug responses. Cell Reports. 31 (11), 107762 (2020).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
- Maenhoudt, N., Vankelecom, H. Protocol for establishing organoids from human ovarian cancer biopsies. STAR Protocols. 2 (2), 100429 (2021).
- Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Scientific Reports. 10 (1), 12581 (2020).
- Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs. Nat Methods. 13 (6), 521-527 (2016).
- Clark, N. A., et al. GRcalculator: an online tool for calculating and mining dose-response data. BMC Cancer. 17 (1), 698 (2017).
- Senkowski, W., et al. A platform for efficient establishment and drug-response profiling of high-grade serous ovarian cancer organoids. Developmental Cell. 58 (12), 1106.e7-1121.e7 (2023).
