Summary
Hasta kaynaklı yumurtalık kanseri organoidleri ile terapötik ilaç testi yapmak için kullanılabilecek bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Yumurtalık kanseri ölümcül bir jinekolojik kanserdir ve Amerika Birleşik Devletleri'ndeki kadınlar arasında kanser ölümlerinin beşinci önde gelen nedenidir. Yeni ilaç tedavileri geliştirmek, sağlık hizmetlerini ilerletmek ve hasta sonuçlarını iyileştirmek için çok önemlidir. Organoidler, in vitro üç boyutlu çok hücreli minyatür organlardır. Yumurtalık kanserinin hasta kaynaklı organoid (PDO) modelleri, iki boyutlu hücre kültürü modellerinden daha doğru bir şekilde özetlendiği ve hasta kaynaklı ksenogreftlere kıyasla ucuz olduğu için ilaç taraması için optimal olabilir. Ek olarak, yumurtalık kanseri PDO'ları, yumurtalık kanserinde tipik olarak gözlenen değişken tümör mikroçevresini ve genetik arka planı taklit eder. Burada, yumurtalık kanseri dokusu ve asitten elde edilen PDO'lar üzerinde geleneksel ve yeni ilaçları test etmek için kullanılabilecek bir yöntem açıklanmaktadır. Canlılığı, büyüme hızını ve ilaç duyarlılığını ölçmek için lüminesans bazlı bir adenozin trifosfat (ATP) testi kullanılır. PDO'larda ilaç taramaları, organoid oluşum hızına ve ilaç tedavilerine bağlı olarak 7-10 günde tamamlanabilir.
Introduction
Nadir de olsa yumurtalık kanseri en ölümcül jinekolojik kanserlerden biridir 1,2. Yeni tedavilerin geliştirilmesindeki bir zorluk, yumurtalık kanserinin heterojen olması ve tümör mikroçevresinin hastalar arasında büyük farklılıklar göstermesidir. Ek olarak, birçok yumurtalık kanseri, platin bazlı kemoterapiye ve poli (ADP-riboz) polimeraz inhibitörlerine direnç geliştirir ve bu da daha büyük terapötik seçeneklereolan ihtiyacı vurgular 3,4,5.
Yeni terapötiklerin belirlenmesinde yararlı olabilecek bir yaklaşım, hasta kaynaklı organoidlerin (PDO'lar) kullanılmasıdır. Organoidler, kendi kendini organize eden ve in vitro "mini organlar" oluşturan çoklu hücre tiplerinin üç boyutlu kümeleridir6,7,8,9,10. Organoidler, önemli doku morfolojisini ve gen ekspresyon profilleriniözetleyebilir 11,12. İlk organoidlerden bazıları, hem farelerden hem de insanlardanalınan bağırsak, mide ve kolon kanseri hücrelerinden türetilmiştir 8,9,13. Mesane, kolon, mide, pankreas, beyin, retina ve karaciğer dahil olmak üzere çok çeşitli iyi huylu ve kötü huylu dokulardan uzun ömürlü organoid kültürler oluşturulmuştur 14,15,16. Daha önce yumurtalık kanseri tümörlerinden ve asit örneklerinden PDO oluşturma yöntemlerini göstermiştik17. PDO'lar moleküler özellikleri, hücresel mekanizmaları ve yeni ilaç tedavilerini incelemek için kullanılabilir 18,19,20. PDO'lar, ilaç taraması için geleneksel iki boyutlu birincil hücre kültürlerine göre çeşitli avantajlara sahiptir. Primer iki boyutlu kültürler ilaç taramaları için düşük maliyetli bir yöntem olmasına rağmen, primer hücre kültürleri tek hücreli tiplerdir ve tümörlerin üç boyutlu mimarisinden yoksundur 21,22,23. Bununla birlikte, PDO'lar değerli bir kaynaktır ve terapötik ilaç taramasında kullanımlarını optimize etmek için uygun maliyetli protokollere ihtiyaç vardır.
Bu makale, bilinen veya aday ilaçların etkilerini test etmek için yumurtalık kanseri PDO'larını kullanmak için bir in vitro yöntemi açıklamaktadır. PDO'ları kullanan mevcut orta ve yüksek verimli ilaç ekranları pahalı otomatik dağıtım cihazlarıgerektirirken 24,25,26, bu uygun maliyetli yöntem, standart 96 oyuklu plaka formatında hazır temel laboratuvar malzemeleri ve ATP tabanlı bir hücre canlılığı testi kullanır (Şekil 1A). Bu yöntem, daha büyük ekranlara ölçeklendirilmeden önce yeni yumurtalık kanseri ilaçlarının ön testlerini kolaylaştıracaktır27,28. Burada yumurtalık kanseri PDO'ları kullanılsa da bu yöntem diğer kanser organoid modellerine de uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu araştırma için insan örneklerinin toplanması Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandı. 18 yaşın üzerindeki tüm uygun hastalar, yüksek dereceli seröz yumurtalık kanseri tanısı veya varsayılan tanısına sahipti ve bilgilendirilmiş onam vermeye istekli ve yetenekliydi. Asit ve plevral sıvıya ek olarak primer veya metastatik bölgelerden tümör dokusu, bakım sırasında onam hastalardan elde edildi.
1. Canlılık testi için yerleşik PDO'ların seçimi
NOT: Tipik olarak, bu organoidler ilk beş pasajın içindedir. Daha önce tarif edildiği gibi, yumurtalık kanseri PDO'ları, Cultrex veya Matrigel17 gibi bazal membran ekstraktında (BME) primer hücre süspansiyonunun yeniden süspanse edilmesiyle oluşturulur (bkz.
- PDO'lar, testin en iyi verimliliği için 24-72 saatlik algılanan bir ikiye katlama süresine sahip olmalıdır. Organoidlerin geçiş/kaplamadan sonra oluşması için geçen gün sayısını görsel olarak belirleyerek algılanan iki katına çıkma süresini tahmin edin.
NOT: Deneyimlerimize göre, oluşması üç günden uzun süren organoidler bu büyüme inhibisyon testi için kullanılamaz. - İlaçları tanımlayın ve test etmek için bir konsantrasyon aralığı seçin (örneğin, Karboplatin, 0-50 μM, bkz.
- Plaka kurulumunu belirleyin. Bu tahlil, bir plaka üzerinde test edilebilecek ilaç sayısını ve konsantrasyonlarını sınırlayarak üç kopya halinde gerçekleştirilecektir.
NOT: Testi gerçekleştirmeden önce seçilen PDO çizgileri dikkatlice gözlemlenmelidir. Yerleşik yumurtalık kanseri PDO'ları, tümör benzeri tomurcuklanma şekillerine sahip çok hücreli katı ve içi boş küreler oluşturur (Şekil 1B). PDO morfolojisi, genomik profil vb., testi gerçekleştirmeden önce (mümkün olduğunda) hasta örneğininkiyle karşılaştırılmalıdır29-33. Yumurtalık kanseri PDO'ları primer ve metastatik tümör örneklerinden ve asitten üretilebilir17.
2. Canlılık testi için reaktif hazırlığı
- Temel Ortam: Gelişmiş DMEM/F12'ye %1 (h/h) penisilin-streptomisin, 1x glutamax ve %1 (h/h)HEPES17 ekleyin (bkz.
- Daha önce yayınlanmış rapor17'yi takiben yumurtalık kanseri organoidleri için Gelişmiş Organoid Ortamı hazırlayın.
3. Organoidlerin kaplanması (~ Gün -2)
NOT: Bu adım, ilaçları eklemeden 1-3 gün önce gerçekleştirilmelidir. Başlamadan önce, tüm reaktifleri (Base Besiyeri, Gelişmiş Organoid Besiyeri ve organoid ayrışma reaktifi; Malzeme Tablosuna bakınız) bir su banyosunda 37 °C'ye ısıtın. BME'yi buzlu su banyosunda çözdürün.
- İlgilenilen organoidlerin %70-90 birleşik olup olmadığını doğrulamak için parlak alan mikroskobu kullanın.
NOT: Organoidlerin görüntülerinin ileride başvurmak üzere saklanması önerilir. - Kuyu içeren organoidlere 1-2 mL ısıtılmış Baz Ortam ekleyin ve BME içeren organoidleri mekanik olarak ayırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Tüm çözeltiyi 15 mL'lik bir konik tüpeaktarın 17.
NOT: Tipik olarak, BME'yi uygun şekilde seyreltmek için 1-2 mL ortam yeterlidir. Aynı hastanın ve pasajın organoidleri birleştirilebilir. - Hücreleri daha fazla ayrıştırmak için 5-10 saniye vorteksleyin ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 1107 x g'de santrifüjleyin.
- Süpernatanı tek kanallı bir pipetle çıkarın ve atın. Organoidleri 1 mL organoid ayrışma reaktifinde yeniden süspanse edin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 37 °C'de 7 dakika inkübe edin.
- Kalan BME nedeniyle pelet hala jelatinimsi ise, ilave 1 mL Baz Ortam ekleyin, 5-10 saniye girdap yapın ve santrifüjlemeyi tekrarlayın.
- RT'de 5 dakika boyunca 1107 x g'de santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve atın ve hücre peletini 1 mL Baz Ortamda yeniden süspanse edin.
- Otomatik bir hücre sayacı (Malzeme Tablosuna bakınız) veya bir hemositometre kullanarak her PDO kültüründeki hücre sayısını sayın.
- Hücreleri, 10 μL başına 20.000 hücrede %25 Baz Ortam ve %75 BME'de yeniden süspanse edin. Bunu, ortamdaki organoidleri yeniden süspanse ederek ve BME ile karıştırarak yapın.
- Plaka bir, 3 μL'lik yeniden süspanse edilmiş BME + PDO hücresi damlacıklarını, siyah opak 96 oyuklu bir plakanın bir kuyucuğuna yerleştirin (bkz. Damlacıkları her kuyucuğun ortasına yerleştirin. Her ilaç konsantrasyonunu üç kopya halinde plakalayın.
NOT: Hücre canlılığı testi lüminesans tabanlı olduğundan, arka plandan kaçınmak için siyah opak plakalar kullanmak en iyisidir. Şeffaf plaklar, tahlil sırasında organoidleri görselleştirmek için kullanılabilir, ancak lüminesansı ölçmeden önce plakaların tabanı opak bantla kaplanmalıdır. - Plakayı bir hücre kültürü inkübatöründe 37 °C'de 15 dakika inkübe edin.
- Her kuyucuğa 100 μL Gelişmiş Organoid Ortam ekleyin. Plakayı 24-72 saat inkübe edin (algılanan PDO ikiye katlama süresine göre belirleyin). Boş olarak kullanmak için boş bir kuyucuğa 100 μL Gelişmiş Organoid Ortam ekleyin.
NOT: Amaç, organoidlerin oluşmasına izin vermektir. - İsteğe bağlı: Büyüme hızı analizi için, PDO'ları ayrı bir plakada ek olarak üçlü olarak plakalayın. Bu, Zaman = 0'daki hücreleri saymak için kullanılacaktır ve Bölüm 0'da açıklanan canlılık testi kullanılarak 5. günde test edilmelidir.
4. 0. Günde canlılık testi için ilaç ilavesi
NOT: 0. gün, ilaçların tam olarak oluşmuş organoidlere eklendiği günü ifade eder.
- Seçilen ilaçları Advance Organoid Media'da istenen konsantrasyonlara seyreltin. Seyreltmeler, 1,5 mL'lik tüplerde veya önceden ayarlanmış 96 oyuklu bir plakada yapılabilir, bu da ortamı dağıtmak için çok kanallı bir pipetin kullanılmasına izin verir.
NOT: İlaçlar, dimetil sülfoksit gibi üretici tarafından önerilen çözücü içinde yeniden süspanse edilmelidir. Bu çalışma için, Advance Organoid Media'da aşağıdaki karboplatin dilüsyonları yapılmıştır: 1, 5, 10, 25, 50 ve 75 μM. - PDO/BME damlacığına dokunmamaya veya rahatsız etmemeye dikkat ederek her bir kuyucuktan ortamı tek veya çok kanallı bir pipetle çıkarın.
- Her oyuğa 100 μL İleri Organoid Ortam ve istenen ilaç(lar)ı ekleyin. Üç kontrol kuyusuna taze ortam eklediğinizden emin olun.
NOT: İlaç konsantrasyonları değişecektir ve bilimsel soruya ve ilacın etki mekanizmasına bağlı olacaktır. Hangi konsantrasyonların kullanılacağına karar verirken, karşılaştırılabilir 2D hücre hatlarında (örneğin, ölümsüzleştirilmiş yumurtalık kanseri hücre hatları) önceden belirlenmiş ilaç konsantrasyonları ile başlarız. Organoidler üzerinde gözlenen bir etki yoksa konsantrasyonların arttırılması gerekebilir. - Ortamı ve ilaçları gerektiği gibi yenileyin (4.1-4.3 arasındaki adımları tekrarlayın). Ortamın yenilenmesi gerekip gerekmediği, tahlil uzunluğuna, ilacın biyolojik aktivitesine ve ilacın yarı ömrüne bağlıdır. Bir haftayı aşan tahliller için ortamın en az bir kez yenilenmesi gerekecektir.
5. Okuma için canlılık testinin sonlandırılması (~ Gün 7)
NOT: Bu adım 7-10. günlerde gerçekleştirilebilir. Test uzunluğu, test edilen ilaçların yarılanma ömrüne ve farmakodinamiğine göre belirlenmelidir.
- Canlılık tahlil reaktiflerinin karanlıkta oda sıcaklığına ulaşmasına izin verin. Çözülme süresini azaltmak için reaktifleri gece boyunca (karanlıkta) 4 °C'de saklayın.
- Test plakasını hücre kültürü inkübatöründen çıkarın ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığına alışmasına izin verin. Plakanın karanlıkta alışması gerekmez.
- Her bir oyuğa (toplam 200 μL hacim için) 100 μL canlılık tahlil reaktifi (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve 5 dakika (80 rpm) boyunca bir plaka çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Plakayı çalkalayıcıdan çıkarın ve oda sıcaklığında 25 dakika daha inkübe edin. Plakayı folyo veya opak bir kutu ile kaplayarak her zaman ışıktan korunduğundan emin olun.
- Biyolüminesans plaka okuyucuyu açın ve i-control yazılımını açın (bkz.
- Bağlan: Cihaz Adı altında, sonsuz 200Pro'yu seçin.
- Lüminesans ve Varsayılan Komut Dosyası'nı seçin.
- Açılır menüden plaka tipini seçin [BD96fb_Falcon-BD] Falcon 96 Düz Siyah.
- Hangi kuyucukların okunacağını belirleyin ve Plakanın Bir Parçası altındaki ilgili kuyucukları vurgulayın.
- Ekranın sol tarafındaki Ölçümler altında, Lüminesans'ı Plaka Parçası'nın altına sürükleyip bırakın.
- Lüminesans parametrelerini seçin: Zayıflama: YOK; Entegrasyon süresi: 1000 ms; Yerleşme süresi: 0 ms.
- Kapağı plakadan çıkarın ve plaka okuyucuya yükleyin. Başlamak için Başlat'a basın.
- Tamamlandığında, verileri dışa aktarın ve kaydedin.
6. Veri analizi
- Hücre canlılığı yüzdesini hesaplayın.
- Boş Düzeltilmiş okumalar için her kuyudan "Boş" u çıkarın. Ardından, üç kontrol kuyusunun ortalamasını alarak Kontrol Ortalamasını hesaplayın.
- Her bir kuyucuktaki canlı hücrelerin yüzdesini hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın: (Deneysel kuyu / Kontrol Ortalaması) x 100
- Analiz yazılımında elde edilen verilerin grafiğini çizin (bkz. Malzeme Tablosu).
- Büyüme Oranı (GR) metriklerini inceleyin.
- Yayınlanan rapora göre GR metriklerini manuel olarak hesaplayın34.
- Alternatif olarak,metrikleri oluşturmak için çevrimiçi GR hesaplayıcısını kullanın (Malzeme Tablosuna bakın) 35. Gün 0 ölçümlerini, tedavi edilmeyen PDO'ların büyüme oranını yansıtan "cell_count_time0" olarak kullanın.
- Verileri ve grafiği dışa aktarın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu sonuçlar, iki PDO'nun yumurtalık kanserini tedavi etmek için kullanılan kemoterapi ilacı karboplatine verdiği yanıtı göstermektedir. Organoidler tümör biyopsisinden (PDO #1) ve asitten (PDO #2) elde edildi. Bu organoidler, algılanan iki katına çıkma sürelerine (1-2 gün) ve morfolojik görünümlerine (birçok büyük organoidin oluşumu) göre seçildi. Hem PDO #1 hem de PDO #2, -2. günde, ikinci geçişte kaplandı ve 0. günde karboplatin eklendi. Gelişmiş Organoid Ortamda seyreltilmiş aşağıdaki karboplatin konsantrasyonlarını test ettik: 1, 5, 10, 25, 50 ve 75 μM. 7. gündeki deneyin sonunda, canlılık tahlil reaktifi plakaya eklendi ve sonuçlar analiz edildi. Şekil 2A , karboplatin tedavisinden sonra canlı hücrelerin yüzdesini göstermektedir.
Ardından, verileri analiz etmek için çevrimiçi GR Hesaplayıcı kullanıldı. Hücre sayımı verilerinin yokluğunda, canlılık testinde ölçülen lüminesans değerleri kullanılmıştır. GR metriklerini dışa aktardıktan sonra, tek bir hücre bölünmesine normalleştirilen tedavi edilen ve tedavi edilmeyen koşullarda algılanan büyüme oranları arasındaki oranlar olan GR değerleri grafiklendirildi34. Bu değerler daha sonra karboplatin konsantrasyonlarına göre çizildi (Şekil 2B). Tablo 1 , ilgili kontrol ve tedavi edilen hücre ikiye katlama süreleri ve test edilen bir dizi karboplatin konsantrasyonu üzerinde doz-yanıt eğrisini entegre eden Eğri Üzerindeki GR Alanı (GRAOC) dahil olmak üzere GR ölçümlerini özetlemektedir34. Belirli bir ilaca duyarlılık, ilacın yarı maksimum etkiye sahip olduğu konsantrasyona karşılık gelen GR50 değerinin yorumlanmasıyla belirlenebilir. Örneğin, PDO #1 için GR50 değeri, PDO #2 için olandan çok daha yüksektir (4.85 μM'yekarşı 0.97 μM), PDO #1'in platin kemoterapisine PDO #2'den daha dirençli olduğunu gösterir.
Şekil 1: İlaç taramasından önce hasta kaynaklı organoidler. (A) PDO ilaç taraması için deneysel taslak. PDO hattının iki katına çıkma süresi ve ilaca maruz kalma süresi göz önüne alındığında, deney planının ayarlanması gerekebilir. (B) İki yumurtalık kanseri PDO hattının (# 1 ve # 2) temsili parlak alan görüntüleri (40x). Ölçek çubuğu = 50 μm. Kısaltmalar: PDO = hasta kaynaklı organoidler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Karboplatin tedavisini takiben yumurtalık kanseri PDO'sunun temsili sonuçları. (A) İki PDO hattı, yedi gün boyunca artan karboplatin konsantrasyonları ile muamele edildi. X ekseni karboplatin konsantrasyonunu gösterir; Y ekseni, organoidleri kontrol etmek için normalleştirilmiş canlı hücrelerin yüzdesini gösterir (karboplatin içermez). Tahliller, iki biyolojik kopya ile üç kopya halinde tamamlandı. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. (B) Logaritmik karboplatin konsantrasyonunu (x Ekseni) ve GR değerini (Y Ekseni) temsil eden GR değeri grafiği. Bu değerler çevrimiçi GR hesaplayıcısında oluşturulmuştur. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Muamele | Kontrol Hücresi İki Katına Çıkma Süresi | Tedavi Edilen Hücre İkiye Katlama Süresi | GR50 Serisi | GR_AOC | |
| PDO #1 | Karboplatin | 0.744 | 0.112 | 4.85 | 1.28 |
| Piyasa Değeri #2 | Karboplatin | 0.972 | 0.0532 | 0.97 | 1.51 |
Tablo 1: GR hesaplayıcısında oluşturulan kontrol hücresi ikiye katlama süresini, tedavi edilen hücre ikiye katlama süresini, GR50 ve GR_AOC değerlerini gösteren tablo. Kısaltmalar: PDO = hasta kaynaklı organoidler, GR = büyüme hızı, GR_AOC = eğri üzerindeki büyüme hızı alanı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, konvansiyonel veya yeni ilaçların yumurtalık kanseri PDO'ları üzerindeki terapötik etkilerini değerlendirmek için kullanılabilecek bir yöntem açıklanmaktadır. Araştırmacılar, PDO modelinde canlılık testini gerçekleştirmeden önce birkaç konuyu göz önünde bulundurmalıdır.
İlk olarak, canlılık tahlilinde kullanılacak bir PDO seçerken, ihtiyaçları için ideal organoid tipi (tümör ve asit) ve geçiş sayısı belirlenmelidir. Deneyimlerimize göre, asit kaynaklı PDO'lar daha hızlı büyür ve tümör kaynaklı PDO'lardan daha kolay üretilir. Bu tahlil büyüme hızına bağlı olduğundan, oluşması/büyümesi uzun zaman alan organoidleri kullanmak zor olabilir. PDO hatlarını yalnızca 4 günden daha kısa ikiye katlama süreleriyle başarıyla kullandık.
İkinci olarak, bu çalışmada opak siyah 96 oyuklu plakalar kullanılmıştır. ATP canlılık testi lüminesans tabanlı olduğundan, şeffaf kuyular sinyal yoğunluğunu azaltacak ve sinyal kontaminasyonu oluşturacaktır. Opak duvarlı, şeffaf alt plakalar, test sırasında organoidlerin görselleştirilmesine izin verir ve hücre morfolojisinde tedaviye bağlı değişikliklerin izlenmesine yardımcı olabilir. Maliyetle ilgili bir güç olmasına rağmen, bu testin bir sınırlaması, aynı anda değerlendirilebilecek numune ve ilaç sayısını sınırlayan 96 oyuklu bir plaka kullanmaktır.
Üçüncüsü, kaplanan hücrelerin sayısı, canlılık deneyleri için dikkatlice düşünülmeli ve optimize edilmelidir. Bu, özellikle PDO hatlarının değişken büyüme hızı nedeniyle geçerlidir; Çok az hücre organoid oluşturmaz ve çok fazla hücre organoid aşırı büyümeye yol açar. Hücrelerin düzgün dağılımını sağlamak için otomatik bir hücre sayacı kullanıldı ve aynı BME-ortam oranını (75:25) korudu. Bu yüksek BME yüzdesi, damlacıkların testin tamamı boyunca katılaşmış kalmasını sağlar. Burada, kuyunun ortasına 3 μL BME damlacıkları yerleştirildi. Damlacığın boyutu artırılabilse de, bütünün iyi kaplanmasına karşı uyarıda bulunuyoruz. Tüm kuyunun kaplanması, organoidlerin kuyu kenarlarına yerleşmesine neden olacak, bu da hem genel büyümelerini engelleyecek hem de canlılık tahlil sonuçlarını etkileyecektir. Damlacığın merkez dışına yerleştirilmesi, kuyu kenarlarına temas etmediği sürece iyidir.
Dördüncüsü, kendi kendine pipetleme insan hatasına neden olur, ancak ayrıntılara dikkat edilerek ve ek kontrol kuyularının dahil edilmesiyle bunun üstesinden gelinebilir.
Son olarak, tahlilin uzunluğu dikkatlice seçilmelidir. İlaçlara uzun süre maruz kalmak, ilacın etki mekanizmasından bağımsız olarak PDO'ların yaşayabilirliğini etkileyecektir. Bu nedenle, en az beş gün boyunca bir dizi ilaç konsantrasyonunun test edilmesi önemlidir. Besiyerinin daha uzun süre değiştirilmesi gerekip gerekmediğine karar vermek önemlidir, çünkü azalan büyüme faktörleri seviyeleri ilaçların etkilerini engelleyecektir36. Test sırasında ortamın değiştirilmesi gerekip gerekmediğini incelemek için, 0. ve 7. gün kontrollerinden elde edilen sonuçların karşılaştırılması gerekir. Tedavi edilmeyen PDO kontrolleri, test boyunca sürekli olarak büyümeye devam etmelidir.
PDO'lar karmaşıklıkta ilerlemeye devam ettikçe ve orijin dokularını daha iyi özetledikçe, kullanımları ilaç keşfini iyileştirmelidir. Bununla birlikte, PDO'ların değerli bir kaynak olarak kalması muhtemeldir ve kullanımlarını korumak ve optimize etmek için uygun maliyetli yöntemler gerektirir. Orta ve yüksek verimli tekniklerin aksine, bu protokol, bilinen ve yeni bileşikleri hazır malzeme ve ekipmanlarla daha düşük maliyetle test etmek için kullanılabilir. Son olarak, bu yöntem farklı kanser organoid modellerine kolayca uyarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından R01CA243511 Numaralı Ödül altında desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmeyebilir. Yazarlar, editoryal yorumları için Deborah Frank'e teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Plastic Tubes | |||
| 15 mL Plastic Tubes | |||
| 96 well Flat Black Plates | MidSci | 781968 | |
| Advance Organoid Media | see Graham et al 2022 (Jove) | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher | 12634028 | |
| Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | |
| Brightfield Microscope | |||
| Carboplatin | Teva Pharmaceuticals USA | NDC 00703-4246-01 | |
| CellTiter-Glo 3D Viability | Promega | G9681 | |
| Cultrex | R & D Systems | 3533-010-02 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| GR Calculator | http://www.grcalculator.org | Online calculator | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. | ||
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Plate Rocker | |||
| Sterile P10, P200, and P1000 Barrier Sterile Pipette Tips | |||
| Sterile P10, P200, and P1000 Pipettes | |||
| Tecan Infinte 200Pro Plate Reader; i-Control Software | Tecan | ||
| TrypLE | Thermo Fisher | 12605010 | Organoid dissociation reagent |
References
- Matulonis, U. A., Sood, A. K., Fallowfield, L., Howitt, B. E., Sehouli, J. m, Karlan, B. Y.
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Christie, E. L., Bowtell, D. D. L. Acquired chemotherapy resistance in ovarian cancer. Annals of Oncology. 28 (suppl_8), viii13-viii15 (2017).
- Wang, L., Wang, Q., Xu, Y., Cui, M., Han, L. Advances in the treatment of ovarian cancer using PARP inhibitors and the underlying mechanism of resistance. Current Drug Targets. 21 (2), 167-178 (2020).
- Wang, Q., Peng, H., Qi, X., Wu, M., Zhao, X. Targeted therapies in gynecological cancers: a comprehensive review of clinical evidence. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 137 (2020).
- Hofer, M., Lutolf, M. P.
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
- Schutgens, F., Clevers, H. Human organoids: Tools for understanding biology and treating diseases. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 211-234 (2020).
- Zhao, Z., et al.
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. W.
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Graham, O., et al. Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids. Journal of Visualized Experiments. 191, e64878 (2023).
- Liu, C., Qin, T., Huang, Y., Li, Y., Chen, G., Sun, C. Drug screening model meets cancer organoid technology. Translational Oncology. 13 (11), 100840 (2020).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
- Zhou, Z., Cong, L., Cong, X. Patient-derived organoids in precision medicine: drug screening, organoid-on-a-chip and living organoid biobank. Frontiers in Oncology. 11, 762184 (2021).
- Costa, E. C., Moreira, A. F., de Melo-Diogo, D., Gaspar, V. M., Carvalho, M. P., Correia, I. J. 3D tumor spheroids: an overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).
- Foo, M. A., et al. Clinical translation of patient-derived tumour organoids- bottlenecks and strategies. Biomarker Research. 10 (1), 10 (2022).
- Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Bergdorf, K., et al. High-throughput drug screening of fine-needle aspiration-derived cancer organoids. STAR Protocols. 1 (3), 100212 (2020).
- Phan, N., et al. A simple high-throughput approach identifies actionable drug sensitivities in patient-derived tumor organoids. Communications Biology. 2 (1), 78 (2019).
- Putker, M., et al. Medium-throughput drug- and radiotherapy screening assay using patient-derived organoids. Journal of Visualized Experiments. 170, e62495 (2021).
- Dahlin, J. L., Inglese, J., Walters, M. A. Mitigating risk in academic preclinical drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 279-294 (2015).
- Honkala, A., Malhotra, S. V., Kummar, S., Junttila, M. R. Harnessing the predictive power of preclinical models for oncology drug development. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (2), 99-114 (2022).
- de Witte, C. J., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids mimic clinical response and exhibit heterogeneous inter- and intrapatient drug responses. Cell Reports. 31 (11), 107762 (2020).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
- Maenhoudt, N., Vankelecom, H. Protocol for establishing organoids from human ovarian cancer biopsies. STAR Protocols. 2 (2), 100429 (2021).
- Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Scientific Reports. 10 (1), 12581 (2020).
- Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs. Nat Methods. 13 (6), 521-527 (2016).
- Clark, N. A., et al. GRcalculator: an online tool for calculating and mining dose-response data. BMC Cancer. 17 (1), 698 (2017).
- Senkowski, W., et al. A platform for efficient establishment and drug-response profiling of high-grade serous ovarian cancer organoids. Developmental Cell. 58 (12), 1106.e7-1121.e7 (2023).
