Summary
Vi presenterer en protokoll for dyrking av høyreproduserbare sfæroider og deres fenotypiske karakterisering ved hjelp av bildeopptak og proteomikk.
Abstract
Vi presenterer en protokoll som beskriver egenskapene og fordelene ved å bruke en frittstående klinostatinkubator for dyrking, behandling og overvåking av 3D-cellekulturer. Klinostaten etterligner et miljø der celler kan samle seg som svært reproduserbare sfæroider med lave skjærkrefter og aktiv næringsdiffusjon. Vi demonstrerer at både kreft og ikke-kreft hepatocytter (HepG2 / C3A og THLE-3 cellelinjer) krever 3 ukers vekst før man oppnår funksjoner som kan sammenlignes med leverceller. Denne protokollen fremhever bekvemmeligheten ved å bruke inkubatorer for 3D-celler med kameraer som overvåker celleveksten, da øyeblikksbilder kan tas for å telle og måle sfæroider ved behandling. Vi beskriver sammenligningen av THLE-3 og HepG2 / C3A cellelinjer, som viser hvordan ikke-kreftcellelinjer kan dyrkes så vel som udødeliggjorte kreftceller. Vi demonstrerer og illustrerer hvordan proteomikkeksperimenter kan utføres fra noen få sfæroider, som kan samles uten perturbing cellesignalering, dvs. ingen trypsinisering nødvendig. Vi viser at proteomikkanalyse kan brukes til å overvåke den typiske leverfenotypen av respiratorisk kjedemetabolisme og produksjon av proteiner involvert i metallavgiftning og beskrive et halvautomatisert system for å telle og måle sfæroidens område. Til sammen presenterer protokollen en verktøykasse som består av en fenotypisk karakterisering via bildeopptak og en proteomikkrørledning for å eksperimentere med 3D-cellekulturmodeller.
Introduction
In vitro cellekulturer har vist seg å være nødvendige og uvurderlige for å etablere grunnleggende kunnskap i biologi. Mye av den vitenskapelige forståelsen i biologi og kreft spesifikt har kommet fra 2D-kultursystemet som er celler som vokser i et monolag. Selv om 2D-kultur har vært det dominerende cellekultursystemet, har det mange ulemper som potensielt kan kvele ytterligere biologiske fremskritt. For eksempel mangler 2D-kulturer celle-celle-interaksjoner som er viktige for cellesignalering og spredning1. Hittil har 3D-kultursystemer vist seg å bedre modelldifferensiering, legemiddelrespons, tumorinvasjon og biologi 2,3,4,5. 3D-modellering av ondartede kreftformer er spesielt viktig på grunn av økningen i den aldrende befolkningen og kreftdødeligheten. Hepatocellulært karsinom (HCC) er en av de viktigste årsakene til kreftrelatert dødelighet over hele verden og har ofte en elendig prognose6. HCC er kjent for å ha en lav kurrate, dårlig legemiddelrespons og høy grad av gjentakelse 6,7,8. Flere 3D-modeller for normal lever og HCC er utviklet som etterligner fysiologien til in vivo normalt og ondartet levervev 9,10.
Noen av de nåværende 3D-systemene inkluderer flytende overlegg, bioreaktorer, hydrogel, stillaser og 3D-trykte strukturer. Sfæroider generert i bioreaktorer gir spesielt unike fordeler fordi de etterligner tumorfordeling av næringseksponering, gassutveksling og celleproliferasjon / ro11. Bioreaktorer er spesielt egnet for kreftmodeller på grunn av deres brukervennlighet, store skalerbarhet, næringsdiffusjon, og tilgjengelighet11. I tillegg kan bioreaktorer tillate eksperimenter med høy gjennomstrømning, større reproduserbarhet og redusert menneskelig feil. Bioreaktoren som brukes i denne studien er unik fordi den simulerer et system med redusert tyngdekraft, noe som minimerer forstyrrende skjærkrefter som brukes i typiske bioreaktorer, noe som muliggjør bedre reproduserbarhet12. Den omnidireksjonelle tyngdekraften og reduksjonen i skjærkrefter gjør det mulig for cellene å utvikle seg på en mer fysiologisk måte. Som bevis utvikler HepG2 / C3A-celler dyrket under denne metoden sfæriske organeller som produserer in vivo nivåer av ATP, adenylatkinase, urea og kolesterol13,14. I tillegg er medikamentelle behandlinger i dette 3D-systemet mer avanserte og automatiserte i forhold til 2D-kulturer. I 2D-kulturer må medikamentelle behandlinger ofte ha et kort tidsforløp på grunn av behovet for å trypsinisere og opprettholde cellehelse. Likevel, i vårt tilfelle, kan vi utføre langsiktige medikamentelle behandlinger av sfæroider uten å måtte forstyrre cellens struktur og fysiologi. Derfor er et skifte fra 2D til 3D-kulturer nødvendig for å bedre modellere in vivo biologiske fenomener og videre vitenskapelig utvikling.
Denne artikkelen presenterer en metodikk for dyrking av høyreproduserbare sfæroider (figur 1 og figur 2) og viser et halvautomatisert system for fenotypisk karakterisering av 3D-strukturer (figur 3). På bildenivå gir vi informasjon om telling og måling av sfæroidenes areal (figur 3). Ved hjelp av massespektrometrimetoder viser vi hvordan proteomikk kan brukes til å vurdere spesifikke biologiske funksjoner (figur 4). Ved å samle og analysere disse dataene håper vi å forbedre forståelsen av biologien bak 3D-cellekultursystemer.
Protocol
1. Buffere og reagenser
- Cellevekstmedier for HepG2 / C3A-celler: Forbered Dulbeccos modifiserte Eagle's medium (DMEM, 4,5 g / L glukose) som inneholder 10% føtalt bovint serum (FBS), ikke-essensielle aminosyrer (1% v / v), L-glutamin (1% v / v) og penicillin / streptomycin (0,5% v / v). Oppbevar vekstmediet ved 4 °C.
- Cellevekstmedier for THLE-3-celler: Forbered bronkial epitelcellevekstmedium [BEGM] som inneholder dets kosttilskudd (bovint hypofyseekstrakt [BPE], hydrokortison, human epidermal vekstfaktor [hEGF], adrenalin, transferrin, insulin, retinsyre, trijodtyronin, gentamicinsulfat-amfotericin [GA]) samt 10% FBS, 5 ng / ml hEGF og 70 ng / ml fosfoetanolamin.
- 500 mM DL-Dithiothreitol (DTT): For å forberede 10 ml, resuspender 0,771 g DTT i 10 ml HPLC-vann av kvalitet. Oppbevares 100 μL alikoter ved -20 °C.
- 200 mM jodoacetamid: For å klargjøre 1 ml, resuspender 36 mg jodoacetamid i 1 ml 50 mM ammoniumbikarbonat. Ikke oppbevar resuspendert iodoacetamid.
- 5% natriumdodecylsulfat (SDS): For å forberede 50 ml, resuspender 2,5 g SDS i 50 ml 50 ml ammoniumbikarbonat. Oppbevares ved 4 °C.
- 12% fosforsyre: For å forberede 100 ml, fortynn 14,1 ml 85% fosforsyre i 85,9 ml HPLC-kvalitet vann. Oppbevares i en glassflaske ved romtemperatur (RT).
- Bindingsbuffer: For å forberede 1 L, tilsett 900 ml konsentrert metanol til 100 ml 10 mM ammoniumbikarbonat eller TEAB.
- 0,1% Trifluoreddiksyre (TFA) løsning: Tilsett 1 ml konsentrert TFA til 999 ml HPLC-vann av kvalitet. Oppbevares ved 4 °C.
- 60 % acetonitril / 0,1 % TFA-løsning: Tilsett 600 ml HPLC-grad acetonitril (60 % v/v) til 399 ml HPLC-kvalitetsvann. Tilsett deretter 1 ml konsentrert TFA til denne oppløsningen, og oppbevares deretter ved 4 °C.
- Mobil fase A (MPA) - 0,1% maursyre: Tilsett 1 ml konsentrert maursyre til 999 ml HPLC-vann og bland godt.
- Mobil fase B (MPB) - 80% HPLC-grade acetonitril + 0,1% maursyre: Tilsett 800 ml HPLC-grade acetonitril til 199 ml HPLC-grade vann. Deretter tilsettes 1 ml konsentrert maursyre til denne løsningen og blandes.
2. Fremstilling av sfæroider
MERK: Figur 1A representerer de første trinnene for å forberede og dyrke 3D-sfæroider fra cellelinjer.
- Tine frosne HepG2 / C3A og THLE-3 celler og vokse dem som et monolag ved hjelp av standard vekstmedier i en vevskulturflaske eller tallerken til de når omtrent 80% sammenløp.
MERK: Når celler når samløp, sjekk den generelle cellulære morfologien og vekstmønstrene ved hjelp av et mikroskop. Det anbefales ikke å bruke celler ved høye passasjenumre. - Vask cellene to ganger med Hanks Balanced Salt Solution (HBSS, bruk 5 ml for en T75 cm2 kolbe eller 10 cm tallerken).
- Tilsett 5 ml 0,05 % trypsin-EDTA fortynnet i HBSS (1:2 fortynning) og inkuber i 5 minutter ved 37 °C med 5 % CO2. Bruk et mikroskop for å vurdere celleavløsning og legg til 3 ml FBS eller vekstmedier (inneholdende 10% FBS) for å nøytralisere trypsinreaksjon.
- Overfør cellesuspensjonen til et 15 ml rør. Spinn ned ved 270 x g ved RT i 5 min.
- Aspirer supernatant- og resuspendasjonscellene i 5 ml av komplette vekstmedier.
MERK: Hvis det er for mange celler, fortynn cellesuspensjonen før du teller. - Tell antall celler og fortynn cellesuspensjonen i fullstendig vekstmedium for å oppnå 1 x 106 i et maksimalt volum på 1,5 ml.
- Likevekt en ultra-lav vedlegg 24-brønns rund bunnplate som inneholder mikrobrønner.
- Vask brønnene med 0,5 ml vekstmedier.
- Sentrifuger platen ved 3000 x g i 5 minutter (dette fjerner luftbobler fra overflaten av brønner).
- Overfør cellesuspensjonen (tilberedt i trinn 1.4) til platen og sentrifugen i 3 minutter ved 120 x g.
MERK: Cellesuspensjonsvolumet kan variere avhengig av celletallet, men det er viktig å begrense det til 1,5 ml. - Inkuber platen i 24 timer ved 37 °C med 5 % CO2 for å starte sfæroiddannelse.
3. Sfæroidkultur i bioreaktorer (figur 2)
MERK: For å bevare strukturen til sfæroider, bruk brede borespisser når du håndterer 3D-kuler.
- Balanser bioreaktoren ved å fylle fuktighetskammeret med 25 ml sterilt vann og cellekammeret med 9 ml vekstmedier 24 timer før sfæroidene overføres til det (figur 2A). Pass på at du bruker en 10 ml sprøyte koblet til en lang nål når du fyller fuktighet og cellekamre.
- Inkuber bioreaktoren, roterende (15 rpm) i 3D-inkubatoren (figur 2D, F), i 24 timer ved 37 ° C med 5% CO2.
- Bruk 1 ml brede borespisser, pipetter forsiktig opp og ned for å løsne sfæroider fra den ultralave festeplaten og overfør sfæroidene til en vevskulturskål.
- Vask den ultralave festeplaten med 0,5 ml forvarmede vekstmedier for å fange opp rester av sfæroider og overfør dem til samme tallerken fra trinn 3.3.
- Vurder sfæroiders størrelse, kompaktitet og rundhet ved hjelp av et lysmikroskop (4x forstørrelse) og velg de som er tilstrekkelig dannet.
MERK: Celler er tilstrekkelig dannet når de er kompakte og ikke faller fra hverandre under håndtering. Det er også viktig at sfæroider er en enkelt enhet og ikke klumpet sammen. En sfæroidstørrelse mellom 100-200 μm foretrekkes når den overføres til bioreaktoren. - Overfør sfæroider til den likevektede bioreaktoren fylt med 5 ml ferske vekstmedier. Etter overføring av sfæroider, fyll bioreaktoren helt med friske vekstmedier, og sørg for å unngå å legge bobler til bioreaktoren når du fyller den med media.
- Plasser bioreaktoren i 3D-inkubatoren og juster rotasjonshastigheten ved hjelp av kontrollenheten (figur 2C). For HepG2 / C3A sfæroider, sett rotasjonshastigheten til 10-11 o / min; for THLE-3 sfæroider, sett den til 11-12 o / min.
MERK: Rotasjonshastigheten er riktig innstilt når sfæroidene er jevnt fordelt i midten av bioreaktoren og ikke berører veggene. Figur 2E viser en roterende bioreaktor. - Utveksle vekstmedier hver 2-3 dag ved å fjerne 10 ml gamle medier og erstatte det med 10 ml ferske medier; pass på at du ikke fjerner sfæroider når du bytter medier (figur 2B).
MERK: Det anbefales å ha en rutine for medieutveksling (for eksempel 48 h / 48 h / 72 h) og holde en detaljert post. - Juster rotasjonshastigheten hver gang mediet endres. Øk hastigheten etter hvert som sfæroider vokser i størrelse og antall.
- Etter 15 dager i kultur, splitt sfæroider i to nye bioreaktorer.
MERK: Avhengig av cellelinjen og veksthastigheten, kan tiden variere og bør optimaliseres individuelt. - Etter 20 dager er sfæroider klare til innsamling.
4. Bildeopptak og telling av sfæroider
MERK: Den forenklede rørledningen for sfæroidantall er vist i figur 3A. For sfæroidtelling og arealbestemmelse (seksjon 5) er det avgjørende å evaluere kompaktheten til 3D-strukturene. Dette vil bidra til en mer forbedret fargekontrast, noe som er nødvendig for at metoden skal være nøyaktig.
- Åpne 3D-appen som er installert på nettbrettet.
- Velg bioreaktoren og ta et øyeblikksbilde.
MERK: Alternativt kan et bilde tas. Følgende parametere bør vurderes.- Plasser en svart bakgrunn bak bioreaktoren (svart støtte er gitt i bioreaktorboksen).
- Forsikre deg om at det ikke er lysrefleksjon på cellekammeret.
- Ta bildet så nær bioreaktoren som mulig.
- Åpne ett bilde i FIJI (ImageJ).
- Forbered bildet for analyse:
- Velg det ovale verktøyet. Tegn en sirkel rundt pluggen.
- Klikk på Slett på tastaturet for å gjøre alt inne i sirkelen svart. Tegn en sirkel rundt cellekammeret. Pass på at alle sfæroider er inne i sirkelen.
- Kjør makro for å telle sfæroider:
- Klikk Plugin-moduler > Makro > Registrer. Kopier makrotekst fra tilleggsfil 1 til opptakeren.
- Trykk på Opprett, og et nytt vindu åpnes. Trykk Kjør for å analysere bildet som åpnes.
- Et nytt vindu åpnes med resultatene (antall, totalt areal, gjennomsnittlig størrelse og prosentområde).
- Lukk bildet og gjenta trinn 4.4 og 4.5 for hvert bilde som sfæroidantallet er nødvendig for. For enklere og raskere behandling, lagre makroen og kjør den ved å klikke Plugin-moduler > Makro > Kjør og velg den lagrede makroen.
5. Planimetrisk bestemmelse av sfæroidområdet
MERK: Den forenklede rørledningen for bestemmelse av sfæroidområdet er vist i figur 3B.
- Ta bilder som beskrevet i trinn 3.5.
- Før du starter, sett en global skala for å måle arealet av sfæroidene.
- Åpne i FIJI et bilde med en skalalinje med ønsket forstørrelse. Velg linjeverktøyet. Tegn over skalalinjen (linjen må være så lang som skalastangen er).
- Åpne Analyser > angi skala. Skriv kunnskapsavstanden (lengden på linjen legges automatisk inn i avstanden i piksler. Sørg for å krysse av for Global.
- Trykk på OK. Nå er skalaen satt for bildet som skal analyseres.
- Hvis du vil starte den planimetrisk bestemmelsen, kjører du makroen (tilleggsfil 2).
- Klikk Behandle > satsvis > makro. Velg mappen som inneholder bildene som skal analyseres. Denne mappen vil være inngangen.
- Velg mappen som ble opprettet i trinn 5.3.1 som Utdata. Trykk på Prosess.
- Som en kvalitetskontroll, vurder om det sfæroide området som måles, tilsvarer det opprinnelige bildet.
MERK: Makro ekskluderer sfæroider på kanten der bare en del av sfæroiden kan måles.
6. Innsamling av sfæroider
MERK: Det anbefales sterkt at sfæroider samles inn ved hjelp av brede borespisser for å bevare 3D-strukturen. Oppsamlingen kan gjøres ved å bruke pluggen foran på bioreaktoren (figur 2A).
Størrelsen på sfæroider ved innsamling kan variere avhengig av cellelinjen, startantall celler og delingsprosess (dager i kultur, antall sfæroider per bioreaktor og splittingsforhold).
- For å samle sfæroider, fjern 5 ml media fra bioreaktoren gjennom toppporten ved hjelp av en sprøyte koblet til en lang nål. Pass på å la sfæroider synke til bunnen av bioreaktoren (nær bunnporten).
- Åpne frontporten og samle sfæroider ved hjelp av en 1 ml bred borespiss. Plasser sfæroidene i mikrosentrifugerør. Sentrifuger sfæroidene ved 500 x g i 5 minutter og kast mediet.
- Vask sfæroidene med 200 μL HBSS for å fjerne FBS. Sentrifuger ved 500 x g i 5 minutter og kast supernatanten.
- Snap-frys sfæroidpelleten med flytende nitrogen og oppbevar ved -80 °C til behandling.
7. Levedyktighet av sfæroider
MERK: Sfæroid levedyktighet ble bestemt ved å måle aktiviteten til adenylatkinasen (AK) frigjort av skadede celler (figur 4A). På grunn av diffusjonsgradienten er AK-måling effektiv når sfæroider er mindre enn 900 μm i diameter12. Hvis sfæroidene blir større, eller hvis det er tvil om levedyktighetsmålingen, kan en ATP-analyse utføres15.
- Samle sfæroidsupernatanten og overfør 20 μL til en 96-brønns hvitveggplate (flat bunn klar). Tilsett 100 μL adenylatkinasedeteksjonsreagens til hver brønn og homogeniser ved å pipettere forsiktig opp og ned.
- Fjern bobler ved sentrifugering i hastighetsvakuumet i 2 min ved RT. Inkuber platene i 20 min ved RT.
- Plasser platen i armometeret (plateleser, luminescensmodus) og start programmet. Still inn parametrene i henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: I bioluminescerende levedyktighetsanalyser kan den direkte luminometerlysutgangen (vanligvis RLUer) brukes til å beregne celleresponsen. Siden adenylatkinase bare lekker fra celler hvis celleintegritet er kompromittert, er det mulig å oppnå total adenylatkinasekontroll ved bruk av lysareagens.
8. Protein ekstraksjon
MERK: Figur 1B representerer arbeidsflyten for sfæroidbehandling og proteinekstraksjon.
- Samle sfæroider (seksjon 6) på dag 36. Resuspender sfæroider i 25 μL av 5% SDS for å lyse cellene.
- Etter å ha tilsatt 5% SDS, homogeniser pelleten ved å pipettere opp og ned. I noen tilfeller når det er vanskelig å lyse sfæroidene, bruk en liten pestle.
- Inkuber prøvene med 20 mM DTT i 1 time for å redusere proteiner. Bland ved å pipettere opp og ned.
- Inkuber prøver med 40 mM jodoacetamid i 30 minutter beskyttet mot lys til alkylatproteiner. Bland ved å pipettere opp og ned.
- Tilsett 12% fosforsyreoppløsning (10x) til prøvene ved en endelig konsentrasjon på 1,2%.
- Fortynn prøvene i seks volumer bindingsbuffer og bland forsiktig.
- Legg prøven i en filterplate med S-Trap og sentrifugering ved 500 x g i 30 sekunder.
MERK: Hvis det totale volumet av prøven i trinn 8.4 overskrider kolonnevolumkapasiteten, laster du prøver i grupper og gjentar trinn 8.6 til alt er passert gjennom kolonnen. - Vask prøvene to ganger med 150 μL bindingsbuffer. Etter hver vask, sentrifugering ved 500 x g i 30 sekunder og kast gjennomstrømningen.
- Inkuber prøvene med 1 μg trypsin av sekvenseringskvalitet fortynnet i 50 mM ammoniumbikarbonat over natten ved 37 °C.
MERK: Minst 20 μg protein anbefales som utgangsmateriale for omfattende proteomanalyse. For dette er 1 μg trypsin den ideelle mengden for effektiv fordøyelse. Fjern eventuelle bobler mellom bufferen og kolonnesengen. - Elute peptider med 40 μL 50 mM ammoniumbikarbonat og basseng i samme oppsamlingsrør.
- Spinn ned ved 500 x g i 30 s. Elute peptider med 40 μL 0,1% TFA og samle dem i samme oppsamlingsrør.
- Spinn ned ved 500 x g i 30 s. Eler peptidene med 40 μL 60% acetonitril og 0,1% TFA og samle dem i samme oppsamlingsrør.
- Spinn ned ved 500 x g i 30 s. Dry pooled eluates i hastighetsvakuum og lagrer prøvene ved -80 °C til behandling.
9. Eksempel på opprydding
MERK: Før du går videre til proteomikkanalysen, er det nødvendig å fjerne saltet som er tilstede i prøvene. Salter kan forstyrre høyytelses væskekromatografi-massespektrometri (HPLC-MS) analyse når de ioniserer under elektrospray, undertrykker signalet fra peptider. Oppsettet for avsalting som ble brukt i denne studien, ble tidligere demonstrert av Joseph-Chowdhury og kolleger16.
- Før du starter, må du sørge for at det er en ren oppsamlingsplate med 96 brønner for å samle strømmen gjennom under de følgende trinnene. Bland C18-harpiksen (50 mg/ml i 100 % acetonitril) på en magnetisk røreplate.
- Tilsett 70 μL av C18-harpikssuspensjonen per brønn på filterplaten med 96 brønner, gjør dette raskt for å sikre at C18-harpiksen ikke samler seg i bunnen av pipetten.
- Slå forsiktig på vakuumet for å forhindre sprut. Kast gjennomstrømningen som er samlet på oppsamlingsplaten med 96 brønner.
- Vask harpiksen med 100 μL 0,1% TFA. Slå forsiktig på vakuumet for å forhindre sprut og blanding av prøver, og kast gjennomstrømningen.
- Resuspender hver prøve i 100 μL på 0,1% TFA. Kontroller og sørg for at pH er mellom 2-3.
- Legg hver prøve i hver brønn på filterplaten. Slå forsiktig på vakuumet for å forhindre sprut og blanding av prøver, og kast gjennomstrømningen.
- Vask med 100 μL 0,1% TFA. Slå forsiktig på vakuumet for å forhindre sprut og blanding av prøver. Kast gjennomstrømningen.
- Bytt ut oppsamlingsplaten med 96 brønner med en ny 96-brønnsplate for å samle de avsaltede prøvene.
- Tilsett 60 μL acetonitril/0,1 % TFA per brønn. For å eluere prøvene fra C18-harpiksen, slå forsiktig på vakuumet for å forhindre sprut.
- Samle strømmen gjennom og tørk i et hastighetsvakuum ved RT. Fortsett til LC-MS / MS eller oppbevar platen ved -80 ° C til klar til å behandle prøvene.
10. Proteomikkanalyse via væskekromatografi kombinert med massespektrometri
MERK: For å generere dataene for dette manuskriptet ble det brukt et nLC-MS/MS-system med et tokolonners systemoppsett med en 300 μm ID x 0,5 cm C18 fellesøyle og en 75 μm ID x 25 cm C18-AQ (3 μm) analytisk nanokolonne pakket internt.
- Forbered de mobile fasene for å kjøre på HPLC:
Mobil fase A (MPA): 0,1 % maursyre i vann av HPLC-kvalitet
Mobil fase B (MPB): 0,1% maursyre i HPLC-grad acetonitril - Programmer HPLC-metoden som følger: 4% -34% MPB over 120 min, 34% -90% MPB over 5 min, isokratisk 90% MPB over 5 min; strømningshastighet: 300 nL/min.
- Definer MS-innsamlingsmetoden for å utføre datauavhengig innsamling (DIA) for å generere MS/MS-spektra av de oppdagede peptidsignalene.
- Resuspender 1 μg prøver i 10 μL 0,1% TFA før du plasserer prøvene i nLC autosampler.
- Kjør nLC-MS-metoden som programmert for kanonisk proteomikkoppkjøp:
- Sett full MS-skanning til 300-1100 m/z i orbitrap, med en oppløsning på 120 000 (ved 200 m/z) og et AGC-mål (automatic gain control) på 125.
- Sett MS/MS i orbitrap med sekvensielt isolasjonsvindu på 50 m/z med et AGC-mål på 400 og en HCD-energi (Higher-energy collisional dissociation) på 30.
11. Analyse av data
- Importer nLC-MS/MS-rådatafilene til en toppdeteksjonsprogramvare som er kompatibel med MS-plattformen som brukes.
- Velg riktig database (menneske, mus, etc).
- Sett N-terminal acetylering som variabel modifikasjon og karbamidometylcystein som fast modifikasjon.
- Spesifiser trypsin som fordøyelsesenzym med to savnet spaltning tillatt.
- Still inn massetoleransen i samsvar med masseanalysatoren som brukes til spektrainnsamlingen.
- Eksporter analysen som et regneark og behandle dataene videre etter behov.
Representative Results
I denne protokollen beskriver vi egenskapene til en innovativ stressfri 3D-celleinkubator, et system designet spesielt for dyrking av 3D-sfæroider (figur 2). Vi optimaliserte protokollen for 3D-dyrking av THLE-3- og HepG2/C3A-cellelinjer. Protokollen beskrevet her er enkel å bruke og muliggjør reproduserbarhet og kostnadseffektiv dyrking av > 100 sfæroider per bioreaktor. En gang i bioreaktoren behandles sfæroider på samme måte som celler opprettholdt i 2D-kultur. Optimale vekstforhold oppnås ved å bytte media to til tre ganger i uken (figur 2B) og justere rotasjonshastigheten i henhold til sfæroidenes vekst og størrelse (figur 2C). Dette systemet, der 3D-sfæroider dyrkes i roterende bioreaktorer (figur 2E, F), gir et optimalt vekstmiljø for 3D-strukturer ved å utsette sfæroid for en lik og svært lav mengde skjærkraft.
Vi har tidligere vist hvordan sfæroider kan brukes til analyse av kromatinmodifikasjon16. Her demonstrerer vi i detalj hvordan man får tak i leversfæroider og hvordan proteomikkforsøk kan utføres for analyse av hele proteomet (figur 1). Kort fortalt ble protokollen initiert ved bruk av THLE-3 eller HepG2/C3A flate celler til kulturen nådde 80% konfluens. For å dyrke celler som sfæroider ble ca. 2000 celler belagt i en ultra-lav festeplate som inneholdt mikrobrønner for å tillate dem å aggregere seg selv, og deretter ble dannede sfæroider overført til en bioreaktor (figur 1A). Selv om de er funksjonelt aktive etter 3 uker i kultur, som tidligere demonstrert17, viser vi resultater fra sfæroider samlet inn etter 36 dager i kultur for denne protokollen. Etter oppsamling ble sfæroider spunnet ned, og både pellet og supernatant ble lagret for analyse. Cellenes levedyktighet ble vurdert fra supernatanten for kvantifisering av adenylatkinase frigjort av skadede celler, som beskrevet tidligere17. Cellulære proteiner ble ekstrahert fra cellepelleten, og hele proteomet ble analysert med høyoppløselig massespektrometri (figur 1B).
Denne protokollen demonstrerer også en halvautomatisert metode for telling av sfæroider (figur 3A) ved bruk av det offentlige bildebehandlingsprogrammet FIJI (Fiji Is Just ImageJ)18. For analysen bør det tas et godt bilde av sfæroiden, og noen parametere bør vurderes som nevnt i avsnitt 5. Deretter, etter å ha klargjort bildet for analyse, brukes et makroskript (tilleggsfil 1) for å telle sfæroidene. Makroen fungerer ved først å lage en mappe som heter FIJI Spheroids telling, inne i mappen der de sfæroide bildene er plassert. I denne mappen lagres all informasjon fra analysen; Dette inkluderer et bilde av sfæroidene som ble talt, med et ID-nummer på hver sfæroid. Den inneholder også en Excel-fil kalt sfæroidtelling. Denne filen inneholder pikselområdet og ID-nummeret for hver sfæroid som ble talt. Dataene som tilsvarer ett analysert bilde, presenteres i hver fane i filen. Fanen er merket i henhold til navnet på bildet som er analysert. Siden sfæroidstørrelsen kan svekkes av mange faktorer, inkludert antall strukturer i et fartøy og medikamentell behandling, er det også viktig å overvåke overflaten (planimetri). Makroskriptet som presenteres her (tilleggsfil 2) fungerer ved å måle de svarte områdene, som tilsvarer sfæroider på bildet (figur 3B). Utdataene samles i en fil som kalles planimetri.xlsx, som inneholder det målte området, omkretsen og diameteren til hver sfæroid. Det er også en måling kalt Feret, som brukes til å beregne diameteren. Feret er lengst mulig diameter, mens minFeret er den korteste. Diameteren er gjennomsnittet av disse to. Inne i utdatamappen, i tillegg til planimetri.xlsx filen, er det også et bilde av sfæroidene som ble målt.
Før vi gikk videre til proteomanalysen, ble sfæroidenes levedyktighet evaluert over kulturtid. Nivåene av AK øker frem til dag 17, når omtrent 7% av celledød, og deretter reduseres døden til nivåer under 5% (figur 4A), som er i samsvar med tidligere publisert arbeid17. Denne protokollen viser også den fullstendige proteomanalysen for overvåking av cellefenotypen. For det første ble proteomene til THLE-3 og HepG2/C3A flate celler og sfæroider sammenlignet. Ved å analysere den første hovedkomponenten (PC1) er det tydelig at det er en streng separasjon av sfæroidprøver fra flate cellekulturer, og det ser ut til at korrelasjonen av celletype (THLE-3 og HepG2/C3A) ikke er relevant (figur 4B). Selv om THLE-3 og HepG2 / C3A sfæroider ikke klynger sammen, deler de lignende profiler i samsvar med leverfunksjonen. Vi demonstrerer i denne protokollen eksemplet på metallothioneiner, som har en rolle i metallavgiftning utført av leveren. I proteomikkanalysen identifiserte vi 2 isoformer overuttrykt i sfæroider sammenlignet med flate celler (MT1E og MT1X) (figur 4C). Vi viser også genontologi (GO) anrikning av begge cellelinjer dyrket som sfæroider. Karbohydratmetabolsk prosess, som omfatter trikarboksylsyresyklusen (TCA-syklus), elektrontransportkjeden (cellulær respirasjon) og pyruvatmetabolisme, er en hyppig betegnelse og er anriket i både HepG2/C3A og THLE-3 sfæroider (figur 4D,E). Cellulær avgiftning, fettsyrer og kolesterolmetabolisme er andre funksjoner beriket i begge sfæroider. Sammen er disse funksjonene kjent for å være avgjørende for leverfunksjonen.
Figur 1: Arbeidsflyt for sfæroidkultur og prøvepreparering . (A) 3D-cellekultur eksperimentell tilnærming. Flate cellekulturer ved ønsket samløp ble trypsinisert og sådd på en ultra-lav vedlegg 24 brønnplate inneholdende mikrobrønner, hvor celler selvmonteres i sfæroider. Etter 24 timer ble sfæroider overført til en bioreaktor og dyrket til de er klare for analyse. (B) Etter oppsamling ble sfæroider pelletert og både pellets- og dyrkningssupernatant ble lagret til behandling. Histoner16og ikke-histonproteiner ble ekstrahert, fordøyd til peptider og analysert ved høyoppløselig massespektrometri. Råfiler hentet fra massespektrometrien ble søkt mot den menneskelige databasen, og dataene ble viderebearbeidet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: 3D-cellekultursystem . (A) Bioreaktor deler. Bioreaktoren består av et gassutvekslings- og befuktingskammer som inneholder vannperler og et åpningscellekammer med to plugger for medieutveksling og sfæroidoppsamling. (B) Utveksling av bioreaktormedier. Bioreaktoren er fylt med 10 ml vekstmedier ved hjelp av en sprøyte med en nål. (C) Systemkontrollappen. Rotasjonshastigheten, CO2-nivået, temperaturen, alarmloggen og andre funksjoner kan styres ved hjelp av kontrollenheten. (D) Plassering av bioreaktoren i 3D-inkubatoren. Hver bioreaktor har en tilhørende motor som kan spinne bioreaktoren sakte. (E) Bioreaktor i bevegelse med hastigheten (rpm) styrt av en (C) tablett. Hastigheten (rpm) justeres i henhold til sfæroidenes størrelse. (F) Bioreaktorer inne i de 3D-inkubator. 3D-inkubatoren kan passe opptil 6 individuelt kontrollerte bioreaktorer. Foto med tillatelse fra Jason Torres Photography. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Fenotypisk karakterisering av sfæroider via bildeopptak . (A) Semi-automatisert sfæroidantall. Etter å ha tatt øyeblikksbilder av sfæroidene i bioreaktoren, blir bildet forberedt for analyse i FIJI. Hver sfæroid telles, og et ID-nummer er gitt for hver av dem. En makro brukes, og resultatene vises som viser IDen for den telte sfæroiden, etiketten (navnet på bildet som ble analysert) og området (antall piksler som telles i sfæroiden). (B) Planimetrisk bestemmelse av sfæroidområdet. Ved hjelp av en makro bestemmes området, omkretsen og diameteren til en bestemt sfæroid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 Proteomanalyse av leversfæroider. (A) Levedyktigheten til sfæroider ble beregnet basert på frigjøring av adenylatkinase (AK) på dyrkningssupernatant. Resultatene er et middel til dupliserte datapunkter ± SD. (B) Prinsipal komponentanalyse (PCA) ble utført for å sammenligne proteomet til THLE-3 og HepG2/C3A flate celler og sfæroider. (C) Relativ overflod av metallothioneiner, som er proteiner uttrykt av den menneskelige leveren. Data er representert som midler ± SEM. (D) Funksjonelt gruppert nettverk viser GO-berikelse for HepG2/C3A sfæroider og (E) THLE-3 sfæroider, der bare etiketten til den mest signifikante termen per gruppe vises. Nettverket ble bygget ved hjelp av ClueGo19. Nodestørrelsen representerer begrepet berikelsesbetydning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: Makroskript for sfæroidtelling. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: Makro for sfæroider planimetrisk bestemmelse. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Å forstå biologien bak tredimensjonale (3D) cellulære strukturer er ekstremt viktig for en mer omfattende kunnskap om deres funksjonalitet. Det er en økende interesse for å bruke 3D-modeller for å studere kompleks biologi og utføre toksisitetsscreening. Ved dyrking av celler i 3D må mange faktorer vurderes, inkludert fenotypisk vurdering av modellsystemet. En fenotype er definert som en gruppe observerbare egenskaper hos en bestemt organisme, som morfologi, oppførsel, fysiologiske og biokjemiske egenskaper20.
I denne protokollen demonstrerer vi hvordan proteomikkeksperimenter kan utføres fra noen få sfæroider og kan brukes til å overvåke den typiske leverfenotypen. Massespektrometri har blitt en omfattende anvendt metode for 3D-cellekarakterisering, noe som gjør det mulig å undersøke en rekke biologiske spørsmål 12,16,21,22. For en omfattende proteomanalyse anbefales det å bruke minst 20 μg proteinutgangsmateriale, hvorfra 1 μg injiseres i massespektrometeret. Det er viktig å nevne at å legge til mindre prøve kan føre til tap av følsomhet, og å legge til flere vil gradvis forverre kvaliteten på kromatografien og til slutt føre til blokkering av kolonnen. I denne studien viste vi at HepG2 / C3A og THLE-3 sfæroider er beriket med viktige proteiner fra glykolyse og TCA-syklus, som er spesifikke leverveier og er kritiske for å opprettholde blodsukkernivået og for energiproduksjon23,24. Faktisk gir massespektrometrianalyse ikke bare informasjon på proteinnivå, men tillater også undersøkelse av protein posttranslasjonelle modifikasjoner, som vist tidligere av vår gruppe16.
Et annet aspekt som skal vurderes i 3D-fenotypiske studier er antallet og størrelsen på sfæroider. I tillegg til å gjøre eksperimenter mer reproduserbare, er det viktig å telle antall sfæroider og bestemme størrelsen for å bestemme når kulturen skal deles i flere bioreaktorer, da antall 3D-strukturer i et fartøy kan påvirke sfæroiders størrelse og metabolske aktivitetsnivåer. Det er imidlertid viktig å fremheve at antall og størrelse på sfæroider avhenger av cellelinjen, startantall celler, delingsprosess og tidspunkt for innsamling. Detaljer om HepG2 / C3A sfæroidkultur, for eksempel antall celler per sfæroider, proteininnhold og størrelse som en funksjon av alder, ble gitt av Fey, Korzeniowska og Wrzesinski25. For nøyaktig og vellykket analyse ved hjelp av den halvautomatiserte metoden beskrevet her, er det mest kritiske trinnet et godt sfæroidbilde. For enkelhets skyld kan bildet tas med en telefon eller nettbrett, men oppløsningen bør holdes så høy som mulig. Siden bildene er raske å tilegne seg, tillater de storskala screeningeksperimenter for å visualisere spesifikke fenotypiske trekk eller undersøke respons på narkotikabehandling. Derfor, på grunn av det økende antallet cellebaserte analyser, har en rekke åpen kildekode-programvare blitt utviklet de siste 10 årene for bildeanalyse26. I denne protokollen beskriver vi et halvautomatisert system ved hjelp av programvaren FIJI18 for å telle og måle sfæroidenes størrelse. Vi presenterte skript (enkle programmeringskommandoer) for å definere en sekvens av algoritmiske operasjoner som kan brukes på en bildesamling, noe som gjør analysen til en enkel og rask prosess. Imidlertid, avhengig av karakteristikken til sfæroiden, bør en manuell måling anvendes. For eksempel, hvis sfæroidene er for gjennomsiktige, vil FIJI-skriptet være upresis. Forresten, et av de viktigste kriteriene for at denne metoden skal fungere, er kompaktiteten til sfæroidene. Denne egenskapen vil bidra til en mer forbedret fargekontrast mellom sfæroidene og bakgrunnen, noe som er nødvendig for at metoden skal være nøyaktig.
Oppsummert, foruten å presentere en metodikk for dyrking av høyreproduserbare sfæroider, ble det også beskrevet et halvautomatisert system kombinert med fenotypisk karakterisering via bildeopptak og proteomikk. Vi forventer at denne verktøykassen for analyse av 3D-celler vil bli mer robust med fullautomatisert bildeanalyseprogramvare og neste generasjons massespektrometre.
Disclosures
Helle Sedighi Frandsen er ansatt som forsker ved CelVivo ApS, produsenten av ClinoStar-systemet. Karoline Mikkelsen er en industriell Ph.D. student ansatt ved CelVivo ApS og utfører sin Ph.D. studie ved SDU, Odense, Danmark. Alle andre forfattere har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Sidoli-laboratoriet anerkjenner takknemlig Leukemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics award), Deerfield (Xseed award), Relay Therapeutics, Merck og NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Bio-Rad | 2239480 | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 1481754 | Luer lock tip, graduated to 12 mL |
| 1000 µL wide bore pipet tips | Fisher Scientific | 14222703 | |
| 200 µL wide bore pipet tips | Fisher Scientific | 14222730 | |
| 96-well Orochem filter plate | Orochem | OF1100 | |
| 96-well skirted plate | Axygen | PCR-96-FS-C | |
| 96-well vacuum manifold | Millipore | MAVM0960R | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-25G | |
| Bronchial Epithelial Cell Growth Medium (BEGM) | Lonza | CC-3170 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| ClinoReactor | CelVivo | N/A | Bioreactor for 3D cell culture |
| ClinoStar incubator | CelVivo | N/A | CO2 incubator for 3D cell culture |
| DTT | Sigma | D0632-5G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT17205CV | |
| Elplasia 24-well round bottom ultra-low attachment plate containing microwells | Corning | 4441 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | MT35010CV | |
| Formic acid | Thermo | 28905 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | MT21022CV | |
| hEGF | Corning | 354052 | |
| HERAcell vios 160i | Thermo | 51033557 | CO2 incubator for 2D cell culture |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | |
| HPLC grade methanol | Fisher Scientific | A452-1 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Iodoacetamide | Sigma | I1149-5G | |
| L-glutamine | Fisher Scientific | MT25015CI | |
| Non-essential amino acids | Fisher Scientific | MT25025CI | |
| Oasis HLB Resin 30 µm | Waters | 186007549 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | High resolution mass spectrometer |
| PAULA microscope | Leica | ||
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | MT3002CI | |
| PerkinElmer Victor X2 multilabel microplate reader | PerkinElmer | ||
| pH paper | Hydrion | 93 | |
| Phosphoetanolamine | Sigma | P0503 | |
| Phosphoric acid | Fisher Scientific | A260-500 | |
| Pipette gun | Eppendorf | Z666467 (Milipore Sigma) | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo | 75-217-420 | |
| Reprosil-Pur resin | MSWIL | R13.AQ.003 | 120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 μM bead size |
| SDS | Bio-Rad | 1610301 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V511A | |
| SpeedVac vacuum concentrator (96-well plates) | Thermo | 15308325 | Savant SPD1010 |
| Sterile hood | Thermo | 1375 | |
| Sterile serological pipettes | Fisher Scientific | 1367549 | |
| S-trap | Protifi | C02-micro-80 | |
| Syringe needle (18 G) | Fisher Scientific | 14817100 | 3" length, 0.05" diameter |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Vortex | Sigma | Z258415 | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD10 |
References
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D cell culture systems: advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
- Nirmalanandhan, V. S., Duren, A., Hendricks, P., Vielhauer, G., Sittampalam, G. S. Activity of anticancer agents in a three-dimensional cell culture model. Assay and Drug Development Technologies. 8 (5), 581-590 (2010).
- Erickson, I. E., Huang, A. H., Chung, C., Li, R. T., Burdick, J. A., Mauck, R. L. Differential maturation and structure-function relationships in mesenchymal stem cell- and chondrocyte-seeded hydrogels. Tissue Engineering Part A. 15 (5), 1041-1052 (2009).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10 (29), (2012).
- Liu, J., Abate, W., Xu, J., Corry, D., Kaul, B., Jackson, S. K. Three-dimensional spheroid cultures of A549 and HepG2 cells exhibit different lipopolysaccharide (LPS) receptor expression and LPS-induced cytokine response compared with monolayer cultures. Innate Immunity. 17 (3), 245-255 (2011).
- Khafaga, A. F., Mousa, S. A., Aleya, L., Abdel-Daim, M. M. Three-dimensional (3D) cell culture: a valuable step in advancing treatments for human hepatocellular carcinoma. Cancer Cell International. 22 (1), 243 (2022).
- Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J.
- Sia, D., Llovet, J. M. Liver cancer: Translating '-omics' results into precision medicine for hepatocellular carcinoma. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (10), 571-572 (2017).
- Tang, J., et al. A three-dimensional cell biology model of human hepatocellular carcinoma in vitro. Tumour Biology. 32 (3), 469-479 (2011).
- van Zijl, F., Mikulits, W. Hepatospheres: Three dimensional cell cultures resemble physiological conditions of the liver. World Journal of Hepatology. 2 (1), 1-7 (2010).
- Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
- Wrzesinski, K., Fey, S. J. Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors. Bioengineering(Basel, Switzerland). 5 (1), 22 (2018).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science: AMS. 14 (4), 910-919 (2018).
- Wrzesinski, K., Frandsen, H. S., Calitz, C., Gouws, C., Korzeniowska, B., Fey, S. J. Clinostat 3D cell culture: Protocols for the preparation and functional analysis of highly reproducible, large, uniform spheroids and organoids. Methods in Molecular Biology. 2273, 17-62 (2021).
- Joseph-Chowdhury, J. N., et al. Global level quantification of histone post-translational modifications in a 3D cell culture model of hepatic tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 183, 63606 (2022).
- Wrzesinski, K., Fey, S. J. After trypsinisation, 3D spheroids of C3A hepatocytes need 18 days to re-establish similar levels of key physiological functions to those seen in the liver. Toxicology Research. 2, 123-135 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bindea, G., et al. ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks. Bioinformatics. 25 (8), 1091-1093 (2009).
- Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S.
- Gonneaud, A., Asselin, C., Boudreau, F., Boisvert, F. M. Phenotypic analysis of organoids by proteomics. Proteomics. 17 (20), (2017).
- Avelino, T. M., et al. Mass spectrometry-based proteomics of 3D cell culture: A useful tool to validate culture of spheroids and organoids. SLAS Discovery. 27 (3), 167-174 (2022).
- Chiang, J. Liver physiology: Metabolism and Detoxification. Pathobiology of Human Disease. McManus, L. M., MitchellIn, R. N. , Academic Press, Elsevier, San Diego. 1770-1782 (2014).
- Begriche, K., Massart, J., Robin, M. A., Borgne-Sanchez, A., Fromenty, B. Drug-induced toxicity on mitochondria and lipid metabolism: Mechanistic diversity and deleterious consequences for the liver. Journal of Hepatology. 54 (4), 773-794 (2011).
- Fey, S. J., Korzeniowska, B., Wrzesinski, K. Response to and recovery from treatment in human liver-mimetic clinostat spheroids: a model for assessing repeated-dose drug toxicity. Toxicology Research. 9 (4), 379-389 (2020).
- Smith, K., et al. Phenotypic image analysis software tools for exploring and understanding big image data from cell-based assays. Cell Systems. 6 (6), 636-653 (2018).
