Summary
ここでは、磁気共鳴ガイド下集束超音波を使用して 、in vivo マウス神経膠芽腫モデルで超音波力態療法を実施する方法を詳述するプロトコルについて説明します。
Abstract
ソノダイナミック療法(SDT)は、超音波処理中の感度を高めるために超音波増感剤が腫瘍をプライミングできるようにする集束超音波(FUS)の応用です。残念ながら、膠芽腫(GBM)の現在の臨床治療は不足しており、患者の長期生存率が低いことにつながっています。SDTは、効果的で非侵襲的、かつ腫瘍特異的な方法で膠芽腫を治療するための有望な方法です。ソノセンシティーターは、周囲の脳実質と比較して腫瘍細胞に優先的に侵入します。超音波増感剤の存在下でのFUSの適用は、アポトーシスをもたらす反応性酸化種を生成する。この治療法は前臨床試験で有効であることが以前に示されていますが、確立された標準化されたパラメーターが不足しています。この治療戦略を前臨床および臨床使用に最適化するには、標準化された方法が必要です。この論文では、磁気共鳴ガイド下FUS(MRgFUS)を使用して、前臨床GBMげっ歯類モデルでSDTを実行するためのプロトコルについて詳しく説明します。MRgFUSは、侵襲的な手術(開頭手術など)を必要とせずに脳腫瘍を特異的に標的にすることができるため、このプロトコルの重要な特徴です。ここで使用するベンチトップ型デバイスは、MRI画像上のターゲットをクリックすることで、3次元で特定の位置に焦点を合わせることができるため、ターゲットの選択が簡単になります。このプロトコルは、MRgFUS SDTの標準化された前臨床法を研究者に提供し、トランスレーショナルリサーチのパラメータを変更および最適化するための柔軟性を追加します。
Introduction
神経膠芽腫(GBM)は、10万人あたり3.21人の発生率を持つ非常に悪性度の高い脳腫瘍の一種であり、最も一般的な悪性脳腫瘍です1。現在の標準治療には、外科的切除、放射線療法、および化学療法が含まれる2。腫瘍の浸潤性および浸潤性の性質のため、腫瘍の完全切除はまれである。腫瘍辺縁に残存組織があると、腫瘍の再発率が高く、5年後の生存率は6%未満と低くなります1。
この予後により、研究者はこの致命的な病気と戦うための新しい治療法の選択肢を模索しています。ソノダイナミック療法(SDT)は、低強度焦点式超音波(FUS)と超音波増感剤を組み合わせて、標的細胞に細胞毒性効果をもたらす非侵襲的治療法です3。一例として、5-アミノレブリン酸(5-ALA)などのポルフィリンベースのソノセンシタイザーは、腫瘍細胞によって優先的に取り込まれ、集束超音波に曝露されると、反応性酸化種(ROS)産生を有害なレベルまで増加させます。細胞内のROSの過剰発現レベルは、細胞構造を損傷し、アポトーシスを引き起こす可能性があります。5-ALAは腫瘍細胞に優先的に取り込まれるため、治療領域内の健康な組織は無傷です3,4。予備的なin vitro研究では、多くのがん細胞がSDT治療によって溶解されることが明らかになりましたが、細胞死率は細胞株に依存します。予備的なin vivo研究でも同様の結果が得られ、SDTがアポトーシスの引き金となることが確認されています5。
このプロトコルはbenchtop FUSの研究プラットホームを使用してintracranially埋め込まれたGBMのセルが付いている齧歯類モデルのSDTの処置のための有効な技術そして変数を記述することを向ける。研究者は、このプロトコルを使用して、トランスレーショナルFUS研究のためのSDTを実行および最適化できます。
Protocol
すべての動物実験は、ジョンズ・ホプキンス大学動物実験委員会(IACUC)に従って承認され、実施されました。無胸症の裸の雌マウス(生後10週齢)は、市販の情報源から入手した( 資料表参照)。マスク、手袋、ガウンの使用を含む、すべてのバイオセーフティレベル2(BSL-2)規制が遵守されました。
1. 腫瘍移植と生物発光イメージング
- 研究の初期段階では、以前に発表されたレポートに従って、頭蓋内腫瘍移植を実施します6。
注:この研究では、4 μLの細胞懸濁液中の100,000個のM59ヒトGBM異種移植細胞を使用して、頭蓋骨への深さ3.0 mmで移植しました。 - 治療前に、以前に発表されたレポート7に従って、in vivo発光イメージングシステム(資料表を参照)を使用して、各マウスの腫瘍サイズを非侵襲的に定量化します。
注:これは、最初の腫瘍移植の7日後、治療日に行われました。 - 画像定量を使用して、マウスを同等のサブグループに分けて治療します。
注:この研究では、(1)未治療の担がんマウス(n = 4)と(2)SDTを受けている担がんマウス(n = 4)の2つのサブグループが含まれていました。治療前の腫瘍の大きさに統計学的に有意な差は2群間で認められなかった(p > 0.05)。
2. 施術日の設定
- 5-ALA塩酸塩( 材料表を参照)を冷凍庫から取り出し、200 mg/kgのマウス重量の5-ALAを秤量します(例:25 gのマウスの場合、5 mgの秤量)。周囲光の下でのみ行ってください。
注意: 使用前にすべての機器を滅菌してください。 - 5-ALAの総量をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解し、各動物に60 mg/mLの5-ALA溶液を正しい重量の投与量で投与します(例えば、25 gのマウスの場合、5 mgの5-ALAを83.33 μLのPBSに溶解します)。
- SDT試験群の各動物について、適切な量の5-ALA溶液を動物腹腔内に注射します(ステップ2.1および2.2で計算)。
- 動物をケージに3時間放置して、5-ALAを代謝します。
3. 実験に必要なものの準備
- リザーバーに脱イオン(DI)水を入れます。
注:必要な水の量は、研究で使用したマウスの数に基づいています。 - フロー イン チューブと フローアウト チューブを超音波脱気器に取り付け( 材料表を参照)、脱気器を電源に接続します(1 = ON、0 = OFF)。
- フロー イン チューブと フローアウト チューブのもう一方の端をDI貯水槽に配置します。
- デガッサーをオンにし、45分間実行します。
- 新しく脱気した水を、研究中に使用する気密密閉容器の上部に満たします。
- 超音波ジェル( 材料表を参照)を円錐形のチューブに注ぎ、遠心分離機に入れ、160 x g で5分間回転させてゲルから空気を取り除きます。
注:各動物の頭にゲルの塊を形成するのに十分なゲルが必要です。
4. MRgFUSシステムのセットアップ
- MRgFUSシステム( 材料表を参照)を、図1(底面パネル)に示す配線 図 で接続します。
- 必要なすべてのコンポーネント(デスクトップコンピュータ、モニタ、MRgFUSプラットフォーム、オシロスコープ、アンプ)を電源に接続します。
- すべてのケーブルを正しい場所に接続します。
- BNCケーブルと同軸ケーブル を介して 目的のトランスデューサをMRgFUSプラットフォームに接続し、対応するインピーダンスマッチングボックスを正しいワイヤに接続します。
注:本研究では、515 kHzのトランスデューサーを使用しました。
- すべてのデバイスの電源を入れます。
- デスクトップコンピュータのオペレーティングシステムで、FUSシステムソフトウェアにすでに統合されているAUREUSアプリケーションを開きます。
- [すべてのハードウェアを接続]を選択して、 ハードウェアを システムに接続し、コンポーネントがソフトウェアと通信していることを確認します。
- ドロップダウンメニューを選択し、目的のトランスデューサを選択して、使用するトランスデューサを選択します。
5. 初期化
- ファントムから下部のネジを緩め、キャビティに脱イオン水と脱気水があふれるまで満たしてから、ネジを再度交換します。
- ファントムを対応するMRIベッドの位置に挿入し( 図2を参照)、MRIベッドをMRIクレードルの対応するスロットに配置します。
- MRIクレードルをMRIスキャナーの対応する場所に置きます( 材料表を参照)。ファントムMRIベッドが障害物なくMRIボアにスライドしてファントムの高品質の画像を取得できるようにクレードルを調整します。この場所をマークして、後で簡単に複製できるようにします。
注:この場所が見つかると、治療の残りの間、場所は変更されません。したがって、動物のMRIを留置するのに適した場所であることを確認しないと、登録全体を繰り返す必要があります。 - 表1の設定を使用して、ファントムのMRIスキャンを行います。
- クレードルをマグネットボアから取り外しますが、スキャナーには取り付けたままにしておきます。ファントムを含むMRIベッドをクレードルから取り外し、ファントム付きのベッドを底面のペグを正しいスロットにスライドさせてMRgFUSシステムに配置します。
- 探触子アームの磁気スロットに転写チップを差し込み、ファントムに向かって下を向くようにします( 図2を参照)。
- ソフトウェアで、[ 新しいホームポジションの選択]を選択し、[ ジョグモードオン ]を選択して、ガイド付きフォーカス検索を開始します。ジョグモードを切り替えた後、左、右、上、下、ページアップ、およびページダウンキーを使用して、トランスデューサーアームをそれぞれ左、右、前、後、上、および下の方向に手動で動かします。
- ポインタの先端がファントムの上部にある十字パターンの中央に触れるまで、ポインタを3次元すべてで手動で調整します( 図2を参照)。
- ファントム MRI 画像をコンピューターにダウンロードし、選択したディレクトリ内のフォルダーに配置し、[ ファントム イメージのロード] を選択して MRI イメージをソフトウェアにロードします。アキシャルファントムスライスは、右側の画面に表示されます。これらのスライスをマウスのスクロールバー で スクロールします。画像をクリックしたまま、マウスを上下に動かして明るさを調整します。
注:フォルダ内のファイルのいずれかが非圧縮DICOMファイルでない場合、ソフトウェアはそれらを読み取ってインポートできないため、そのフォルダから他のファイルをすべて削除します。 - ファントムの画像までスクロールすると、それぞれに3つの暗い穴がある透明な円があります。ファントムの中央をクリックすると、赤い円がポップアップします。円が同じ直径になり、ファントムの円周と揃うまで、円をクリックしてドラッグします( 図2を参照)。
- この位置の座標は「ホーム位置」と呼ばれます。これを保存するには 、L/R、A/P、およびS/Iの設定をクリックします。
- Jog Mode Off(ジョグモードオフ)をクリックし、探触子アームから転写チップを取り外して、Exit Focus Finding(フォーカス検出を終了)を選択します。ホームポジションを確認して、初期化シーケンスを完了します。
6. SDTの動物用調製
- 誘導チャンバー内でイソフルラン-O2ガス混合物を使用してマウスを麻酔します。麻酔導入のためにガス流量を1.0 mL / minに、気化器を2.0%に設定し、通常、チャンバー内で3〜5分かかります(材料表を参照)。
- つま先をつまんで、動物が適切な鎮静状態にあるかどうかを評価します。角膜の乾燥を避けるために眼科用軟膏を目に塗ります。
注意: 処置全体を通して麻酔の深さを監視します。 - 尾静脈から40μLのガドリニウム造影剤をマウスに注入します( 材料表を参照)。
- 頭蓋骨の上の頭皮を塞いでいる髪の毛を、脱毛クリームと電子シェーバーで取り除きます。
- 次の手順を使用して、動物をMRIベッドに固定します( 図3を参照)。
- MRIベッド(図3A)のインレットチューブを麻酔用イソフルランの供給源に接続し、麻酔導入用のガス流量を1.0 mL / minに、気化器を2.0%に設定します。出口チューブをチャコールフィルターキャニスターに接続して麻酔吸収します。
- ノーズコーンピースをスロットに入れます( 図3Bを参照)。図のように、ノーズコーンとベッドの端の両方にあるバイトバーの穴にバイトバーを通し、バイトガードの端をMRIベッドの開いたウェルの上にホバリングさせます。
- 動物をMRIベッドに置き、耳を定位耳棒の穴に合わせ、噛み合わせガードに歯を通して所定の位置に保ちます。ノーズコーンを前方にスライドさせて、動物の鼻の上に乗せて、安定した麻酔の流れを提供します。
- MRIベッドの両側にある穴にイヤーバーを通し、両方のイヤーバーがマウスの外耳道に収まるまで動物の頭を上げます。
注意: 動物の鼓膜を傷つける可能性があるため、押しすぎないでください。 - 動物が快適な姿勢にあることを確認してください。次に、マイナスドライバーを使用して、MRI互換のネジをねじ込み、両方のイヤーバー、ノーズコーン、およびバイトバーをロックします。これにより、動物が所定の位置にロックされ、動物がベッドから取り出されるまで頭の動きが防止されます。
注意: この手順に従って、MRIベッドでの動物の位置に乱れがないことを確認してください。動物が動いた場合、プロトコルがどれだけ進んでいるかに関係なく、セットアップ全体(ステップ6.5)を繰り返す必要があります。 - 動物が待っている間、体温を維持するためにMRIベッドを温かい温熱パッドの上に置きます。
注意: 手順全体を通して体温を監視および維持します。
- イソフルランは、プラットフォームに設けられた固定具を使用して、動物用ベッドがFUSシステムに固定されている場合、治療中、ノーズコーンに取り付けられたチューブ を介して 動物に継続的に供給されます。
7.MRI手順
- 図3に示すように、動物を定位的に固定した状態でMRIベッドを取り、MRIベッドの穴の端にあるMRIベッドの穴をMRIクレードルのペグに挿入して、MRIスキャナーに事前に接続したMRIクレードル(材料表を参照)に配置します。入口と出口の麻酔チューブをMRI装置の対応するチューブに取り付けます。
- 動物が入ったMRIクレードルをMRIボアにスライドさせ、ファントムが置かれた場所と同じ位置を保ってください。
- ローカライザーを実行して動物の脳の位置を確認し、次に表2のMRI設定を使用して脳全体をカバーする造影後T1強調MRIスキャンを実行します。
- MRIスキャンを、スライスごとに1つずつ、非圧縮DICOMファイルのセットとしてエクスポートします。
8.焦点を絞った超音波治療(図4)
- スキャン完了後、動物をMRIクレードルから取り出し、ベッドの前面をプラットフォームの背面にある対応するペグに挿入し、ベッドの背面を対応するペグに挿入して、プラットフォームに配置します。
- MRIベッドのインレットチューブを麻酔用のイソフルラン源に接続し、麻酔を維持するためにガス流量を1.0mL / minに、気化器を2.0%に設定します。出口チューブをチャコールフィルターキャニスターに接続して麻酔吸収します。
- DICOMファイルのセットをコンピュータに転送し、現在のスタディのメイン作業ディレクトリのフォルダに配置します。
注: ファイルの要件については、手順 5.9 を参照してください。 - ソフトウェアで、メインの初期化ページに移動し、[ガイド付きフォーカス検索]をクリックしてジョグモードをオンにし、[ジョグモードオン]をクリックします。
- 遠心分離した超音波ジェルを動物の頭に軽くたたき、頭蓋骨の上の頭皮全体を覆うのに十分なジェルを置きます。
- DIと脱気した水をウォーターバスに最大80%注ぎ、ウォーターバスをプラットフォーム上の対応するカラムに挿入します。
- 底の膜が動物の頭の超音波ゲルに触れ、水とゲルの間に結合面を形成するまで、脱イオン水で満たされたウォーターバスを下げます。超音波ジェルが動物の頭全体を水浴まで覆っていること、および水浴とマウスの頭皮の間の超音波ジェルに気泡がないことを確認してください。
- 超音波トランスデューサをウォーターバスに沈め、トランスデューサの表面に気泡が発生していないことを確認します。
- ジョグモードを使用して探触子アームを部分的に水没した探触子に向かって下げ、探触子の表面が水没したままの状態で磁気スロットを互いに位置合わせして探触子に結合します。
- Jog Modeをオフにし、初期化手順で行ったようにExit Focused Finding(フォーカス検索を終了)にします。前と同じようにホームポジションを必ず確認してください。
- [治療]タブに移動し、画面上部中央のフォルダーアイコンをクリックして、造影後T1強調MRIファイルをアップロードします。以前にコンピューターにアップロードされたDICOMファイルを含むフォルダーを選択して開きます。この手順により、右上のパネルにすべてのDICOMファイルが自動的に読み込まれます。
- 次に、[超音波処理モード]タブで、[バースト]または[連続波]を選択して、適切な処理モードを選択します。バーストモードの場合は、[超音波処理設定]タブで、バースト長、バースト期間、および周期数を入力します。これらのパラメータは、各超音波処理場所に対応します。連続波モードの場合は、超音波処理時間のみを入力します。
注:この研究では、連続波モードを120秒間使用しました。 - ページ上部中央のターゲットアイコンをクリックし、FUS焦点領域を狙う正しいMRIスライス上の適切な位置を選択します。クリックした場所には、赤い円が付いた明るい赤い正方形が表示されます。複数の選択を選択できます。
- MRI画像の左側にはテーブルがあり、選択した焦点領域の3D座標が入力されます。表の最後の列に、各焦点で超音波処理する出力レベルを入力し、所望の圧力または強度レベルを得るために使用するトランスデューサごとに個別に計算できます。表の各焦点をクリックして確認すると、座標が強調表示され、画像上の対応する焦点領域が青色に変わります。
注意: これらの値はトランスデューサ固有のものであるため、表に入力された出力レベルを圧力または強度に変換する方法については、トランスデューサのデータシートを参照してください。 - すべての焦点領域に問題がなければ、 モーションテストを選択します。これにより、ソフトウェアはトランスデューサーをすべての焦点に移動して、移動が可能になるようにします。確認後、ソフトウェアは モーションテスト完了を示します。エラーが発生した場合は、探触子モーターの3D軸内に収まるように焦点領域を調整します。
- 準備ができたら、[超音波処理の開始]を選択して 超音波処理 プロトコルを開始し、トランスデューサーを動かし、選択した各焦点領域に正しいFUSパラメータを適用します。
- 超音波処理プロトコルが終了したら、トランスデューサーをトランスデューサーアームから切り離し、プラットフォームからウォーターバスを取り外し、動物の頭皮から超音波ジェルを拭き取ります。
- 咬傷と耳のバーを緩め、動物をMRIベッドから取り出し、動物が麻酔から目覚めるまで動物を温かいパッドの上に置きます。この時点で、動物をケージに戻します。
- その後の動物については、セクション6から始めて、同じプロトコルを繰り返します。
- 目的の動物が処理されたら、動物が触れたすべての表面を70%エタノールで洗浄します( 材料表を参照)。
- ソフトウェアを終了し、各機器をシャットダウンして電源を切ります。
9. 後処理の手順
- セクション 1 の in vivo イメージング システム (IVIS) プロトコルを繰り返して、処理後 24 時間で生物発光を測定します。治療効果を分析するには、治療前後の生物発光記録を比較して、治療群と未治療群の両方の成長率を決定します。
- 手順6.4と同じ設定を使用してフォローアップMRIスキャンを実行します。造影スキャンを使用して、腫瘍領域の平均グレースケール強度を比較するか、造影剤がカバーする総体積を計算して、治療前と治療後の腫瘍体積の違いを決定します。
Representative Results
治療後24時間でSDTで治療された動物の腫瘍サイズは減少します。
SDT治療当日、対照群と治療群(それぞれN = 4)の元の平均生物発光信号は、それぞれ2.0 x 10 6 ± 3.1 x 10 6および2.3 x 10 6 ± 1.3 x 10 6 p / s / cm2 / srでした。2群間の治療前の腫瘍の大きさに対応する平均生物発光値は統計学的に有意ではなかった(p = 0.89)。SDT後、治療群の平均生物発光シグナルは3.57 x 10 6 ± 2.3 x 10 624時間であったが、対照群の生物発光シグナルは5.5 x 10 6 ± 8.2 x 10 6 p/s/cm2/srに増加した。図5に示すように、指数関数的な成長(p = 0.08)を仮定すると、これはそれぞれ83.4%±78%、172%±34%の成長率に相当します。治療した4匹の動物のうち、3匹は対照群と比較して治療後の成長率が低かった。治療群には、対照群と同等の成長を示した外れ値が1つあり、偏差が歪んでいました。
さらに、治療の翌日に造影MR画像検査を受け、治療前と治療後を比較した。腫瘍中の造影剤の平均グレースケール強度を各動物の各MRIスライスにわたって実施し、腫瘍サイズの推定値として、治療後に腫瘍に侵入した造影剤の量を測定しました。治療前、対照群と治療群の平均腫瘍グレースケール強度は同程度であった。平均して、このグレースケール強度は、対照群で治療群よりも大きな大きさに増加したが、これは有意ではなかった(p = 0.47)。このデータを 表 2 に示します。これらの結果に大きなばらつきがあるのは、MRIが治療後わずか24時間で撮影されたという事実によるものと考えられます。それでも、 図6 はSDTによって作成された病変の例を示しています。
図1:FUSシステムのセットアップ (トップ)ラベル付きコンポーネントを備えたMRgFUSシステム。(フロント)1. プラットフォーム。2.軸電動トランスデューサーアーム。3. FUSのトランスデューサー。4.ウォーターバス。5.MRIベッド。6.モニター。7.トランスデューサーのインピーダンスマッチングボックス。8.パワーアンプボックス。9.関数ジェネレータ。10.ファンクションジェネレータチャンネル1のBNCポート。11.デスクトップコンピュータ。(下)MRgFUSシステムは、以下の接続部で配線回路図を色分けしています。(戻る)1.電源コード。2.HDMIをデスクトップHDMIに監視します。3. B USB B をデスクトップ USB A にポートします。オシロスコープLANイーサネットからデスクトップイーサネットへ。5.デスクトップイーサネットへのモーションインターフェイスイーサネット。6.オシロスコープのAUX入力/出力BNCからAWG入力BNC。7.オシロスコープチャンネル1(フロント)BNCからSYNCBNC。8.マッチングボックス出力BNCからRF入力同軸。9. RF出力同軸から同軸ボックス同軸。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:ファントム登録 (A) ファントム登録時のシステム設定とソフトウェア。(B)ファントム登録画面のスクリーンショットで、赤丸は軸方向断面の選択円周です。(C)MRIベッドに置かれたファントム、上面図。(D)ファントムの側面図で、赤い線はCの円に対応する軸スライス内にあります。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3:動物の配置 。 (A)MRIベッドとクレードル、さまざまな部品にラベルが付けられています。 1.MRIクレードル。2.定位MRIベッド。3.イヤーバー。4.バイトバー。5.ノーズコーン。6. MRIベッドペグホール。7.イソフルラン麻酔チューブ。(B)MRIベッド上のマウスの配置とクレードル上の配置、RFコイル(オレンジ)を表すイラスト(Biorender 2022テンプレートを使用して変更されたイラスト)。(C)FUS治療中のMRIベッド上のマウスの配置を表すイラスト(Biorender 2022テンプレートを使用して修正されたイラスト)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:焦点の選択。 単一の動物における超音波処理点の選択の例。各列は、各スライスが近位 (スライス 1) から遠位 (スライス 5) 方向に 0.5 mm である T1 強調後造影 MRI スライスを表します。腫瘍境界は手動でセグメント化され、赤(行1)で輪郭が描かれており、対応する超音波処理位置(行2)は薄緑色の正方形(焦点最大中心)および青色の円(最大焦点円周の半分)で表されています。各場所は2分間超音波処理されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:SDT後の成長率 測定された発光に基づく、頭蓋内 M59 腫瘍の治療済みおよび未治療 (対照) 動物における SDT 治療前から 24 時間後の GBM 腫瘍の増殖率。エラーバーは標準偏差を示します。有意性を判断するために、2標本の学生のT検定を実施しました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:SDTで発生した病変。 造影前および造影後は、SDTによって作成された腫瘍の病変を示す代表的な軸スライスを特徴とする動物モデルからのT1強調MRIスキャンを強化します。(写真左)SDT治療前にMRIスキャンを行い、腫瘍の輪郭を赤く表示します。(真ん中)最大圧力が水色の円で表され、半値圧力領域が青い円で表されるFUS焦点選択。(写真右)SDT後のMRIスキャンで、腫瘍の輪郭が赤く描かれています。SDTで作られた病変と移植用のシリンジ穴が示されています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| 順序 | T1の |
| 繰り返し時間 | 3000ミリ秒 |
| エコー時間 | 30ミリ秒 |
| スライスの厚さ | 0.5ミリメートル |
| スライス数 | 25 |
| ピクセル間隔 | 0.187 mm x 0.187 mm |
| アクイジション・マトリクス | 133×133 |
| 平均 | 4 |
表1:MRIの設定。
| コントロール | SDTグループ | p値 | |
| 前処理 | 7.49×103 ± 2.2×103 | 7.48×103 ± 1×103 | 0.99 |
| 後処理 | 8.79×103 ± 7.7×102 | 7.95×103 ± 1.1×103 | 0.33 |
| パーセント差 | 16% ± 16% | 7% ± 12% | 0.47 |
表2:造影後強調T1強調MRIグレースケール。
Discussion
膠芽腫の患者には、新しい治療的で効果的な治療法の選択肢が必要です。このプロトコルは、現在臨床翻訳のための広範な調査を受けているGBMの前臨床FUS媒介治療の概要を説明しています。SDTはエキサイティングな可能性を秘めていますが、前臨床の現場では、まだ理解し、最適化すべきことがたくさんあります。
このプロトコルの最も重要な要素の1つは、MRガイド下FUSを利用して腫瘍を標的とし、最大限の効果を発揮することです。ファントムを使用して、3D座標空間を作成し、軸方向のMRIスライスの各ピクセルに座標を割り当てることができます。次に、MR画像上の超音波処理位置を選択する簡単な手順で、探触子に照準を合わせる場所を通知します。使用される前臨床FUSシステムは、画像確認なしでは標的にすることが困難な深部腫瘍を含む、腫瘍などの特定の病理学の位置を標的にする必要がある場合に、非常に汎用性が高く、適用できます。ガドリニウムを造影剤として使用すると、腫瘍が明確に可視化され、ユーザーはターゲットを選択する際に十分な情報に基づいた決定を下すことができます。SDTが他の多くの治療法よりも優れている点は、腫瘍特異的な治療法であることです。低強度のFUSは腫瘍組織のみを標的とし、健康な脳実質は比較的手つかずのまま残すべきである3,8。
この実験の結果は、このプロトコルの利点が、SDTの文献にある他の所見と同様の治療結果にどのようにつながるかを強調しています。 図5 は、治療日からわずか24時間以内に、治療されたコホートで腫瘍増殖の鈍化が見られたことを示している。この小さなサンプルサイズでは有意ではありませんが、動物の数が多いと有意性が生じる可能性があります。この腫瘍増殖の遅延は、Wu et al.(2019)によるこのテーマに関する先駆的な論文で示されたものと似ており、治療された動物では時間の経過とともに腫瘍の成長が遅くなり、生存期間が長くなりました9。
このプロトコルを設計する際に考慮されたのは、動物の系統、腫瘍の種類、および超音波増感剤の選択でした。このプロトコルには、複数の理由から、アティミックヌードマウスが選ばれました。まず、裸のマウスは、髪の毛がないため減衰が防止されるため、超音波処理が容易です。また、免疫系がないため、患者由来の異種移植片(PDX)を移植できるため、腫瘍モデルは臨床状況により近いものになります。胸腺モデルを使用することの欠点は、免疫系を特徴付けることができないため、SDTによって生成された免疫応答はこれらの研究で測定されないことです10。選択された腫瘍株は、攻撃的で急速に増殖するPDX株です。腫瘍の確立を確認する必要があるため、治療時間は非常に重要ですが、腫瘍の負荷は頭蓋半球を満たすべきではありません。細胞株が異なれば、前臨床試験に最適なサイズの腫瘍を実現するために必要なインキュベーション時間も異なります。このプロトコルでは、5-ALAは、以前の実験(未発表データ)でこの細胞株の in vitro で確認されているGBM腫瘍の優先的な取り込みのために超音波増感剤として使用されました。他の超音波増感剤を代用して試験し、有効性と安全性に最も適した化合物を決定することができます。最後に、以前の文献では、これがその注射用量5の最適な時間であることが示されているため、治療は5-ALA注射の3時間後に開始されました。
このプロトコルで選択されたFUSパラメータ(各ターゲット位置で515kHzで2分間10W / cm2)は、以前の文献と初期実験のレビューに基づいて決定されました4,9。腫瘍全体を覆う超音波処理点のグリッドは、腫瘍全体にわたってROS効果を生成するために選択された。ここで用いられた強度は他の論文よりも高いが、短期間では、25 W/cm2までの強度がマウスモデルで有意な副作用なしに正常に使用されているため、温度関連の悪影響につながることはないと予想されている11。重要なことは、標準化または最適化されたFUSパラメータのセットが文献に発表されていないことです。したがって、ここで報告される特定の値を調整して、最適なパラメータセットを決定し、安全性を維持しながら腫瘍組織を最大限に縮小することができます。さらに、細胞株が異なれば血管新生や低酸素症のレベルも異なるため、この治療を調整する必要があるかもしれません。SDT治療の24時間以内に腫瘍の増殖が全体的に減少することが示されましたが(図5)、この治療の最大の効果を判断するには、パラメーターを最適化する必要があり、より多くの動物をテストする必要があります。治療後のMRIスキャンでは、健康な組織にFUS治療によって生じた病変は見られず、その影響は腫瘍組織に限局しています(図6)。また、SDTを血液脳関門の一過性透過化などの他のFUS技術と組み合わせて、腫瘍における5-ALAの取り込みを最大化する機会もあります12。このプロトコルは、構造レベルで安全性と有効性をチェックするために、さまざまな組織学技術を実行することによってさらに補完することができます。ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色は、構造的損傷または腫瘍損傷を調べるために実施することができ13、細胞アポトーシスを調べるために、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニックエンドラベリング(TUNEL)染色を行うことができる14。いずれにせよ、このプロトコルは、SDTで治療された腫瘍と未治療の腫瘍の増殖速度を比較し、超音波処理の前後の腫瘍スライスを比較することによって明らかな、治療後24時間でも変化が顕著である安全で腫瘍特異的な治療法を提示します。
どのプロトコルでも、常に比較検討する必要がある欠点や制限があります。現在のプロトコルの主な制限は、時間と費用です。一方、このプロトコルの利点の1つは、その自動化された焦点を絞ることです。この焦点を絞った手順を実行するには、腫瘍の標的が正しいことを確認するために、個々の動物ごとにMRIスキャンを行う必要がありますが、このプロセスには時間と費用がかかる可能性があります。さらに、必要な焦点の数によっては、このプロトコルを実行する時間が数匹でも数時間になる可能性があり、実験動物の数が少なくなります。これらの欠点にもかかわらず、この標的を絞った非侵襲的プロトコルは、開腹手術の選択肢と比較すると、依然として実行可能な好みです。
結論として、このプロトコルは、前臨床マウスモデルで健康な神経組織を維持しながら、治療の24時間以内に脳内の腫瘍増殖を減少させるSDT治療の能力を示しました。SDTの有効性の研究と、ROS産生を増加させるためのさまざまなパラメーターの最適化は、この治療法を臨床的に適切なものにするために必要です。SDTを非侵襲的治療モデルとして使用するための新しい道を模索する必要があります。
Disclosures
著者らは、この研究は、潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または金銭的関係がない状態で実施されたと宣言しています。Amir Manbachiは、BK Medical(GE Healthcare)、Neurosonics Medicalで教鞭を執り、コンサルティングを行っており、特許出願中の多くのFUS技術の発明者でもあります。ベティ・タイラーはNIHから研究資金を受けており、Accelerating Combination Therapies*の共同所有者です。Ashvattha Therapeutics Inc.は、彼女の特許の1つもライセンスしており、彼女はPeabody Pharmaceuticalsの株主です(*株式またはオプションを含む)。
Acknowledgments
著者らは、米国国立科学財団(NSF)のSTTRフェーズ1賞(#:1938939)、ASME国防高等研究計画局(DARPA)賞(#:N660012024075)、および米国国立衛生研究所(NIH)の国立トランスレーショナルサイエンス推進センター(NCATS)が運営するジョンズ・ホプキンス研究所の臨床研究奨学生プログラム(KL2)からの資金援助に感謝しています。細胞は、Mayo Foundation for Medical Education and Researchから購入し、提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| 1 mL Syringes | BD | 309597 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton Company | 49AL65 | |
| 10 µL Pipette tips | USAScientific | ||
| 1000 mL Flask | Corning | MP-34514-25 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | CLS430791 | |
| 200 Proof ethanol | PharmCo | 111000200 | |
| 5 mL pipettes | Falcon | 357543 | |
| 50 mL Conical tubes | Corning | 430290 | |
| 500 mL filter | Corning | 431097 | |
| 5-Aminolevulinic acid hydrochloride | Research Products International | A11250 | |
| 7T PET-MR system | Bruker | Biospec 70/30 | |
| Aluminum foil | Reynolds Brand | ||
| Amplifier | FUS Instruments | 2175 | |
| Athymic nude mice | Charles River Laboratories | Strain Code 490 | |
| Bone drill | Foredom | HP4-917 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004261 | |
| Charcoal isoflourane waste container | Patterson scientific | 78909457 | |
| Computer | FUS Instruments | 2269 | |
| Cover glass | Fisherbrand | 12-545J | |
| Desktop monitor | ASUS | VZ239H | |
| D-Luciferin | Gold Biotechnology | LUCK-1G | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Electronic shaver | Wahl | 93235-002 | |
| Eppendorf tubes | Posi-Click | 1149K01 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Formalin | Thermo Fisher Scientific | SF100-20 | |
| Function generator | Siglent | QS0201X-E01B | |
| Gadolinium contrast agent (Gadavist) | McKesson Corporation | 2068062 | |
| Gauze | Henry Schein | 101-4336 | |
| Heat lamp | |||
| Heat pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-12 | |
| Induction chamber | Patterson scientific | 78933388 | |
| Isofluorane vaporizer | Patterson scientific | 78916954 | |
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| Isoflurane system | Patterson Scientific | 78935903 | |
| IVIS spectrum | Perkin Elmer | 124262 | |
| Lightfield microscope | BioTek | Cytation 5 | |
| Nair | Church and Dwight Co. | 42010553 | |
| Ophthalmic ointment | Puralube vet ointment | ||
| P-20 pippette | Rainin | 17008650 | |
| Patient derived xenographs | Mayo Clinic | M59 | |
| Penicillin/Streptomyosin | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 70-011-069 | |
| Pippetter | Drummond | 4-000-101 | |
| Povidone-iodine | Covetrus | PI050CV | |
| RK-50 MRgFUS system | FUS Instruments | 2182 | |
| Scale | |||
| Scalpel blade | Covetrus | 7319 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Screwdriver set | Jakemy | JM-8160 | |
| Skin marker | Time Out | D538,851 | |
| Staple remover | MikRon | ACR9MM | |
| Stapler | MikRon | ACA9MM | |
| Staples | Clay Adams | 427631 | |
| Stereotactic frame | Kopf Instruments | 5000 | |
| Stereotactic MRI prototype plastic imaging fixture | FUS Instruments | ||
| T-25 culture flask | Corning | 430641U | |
| Transducer and matching box | FUS Instruments | T515H750-118 | |
| Ultrasonic degasser | FUS Instruments | 2259 | |
| Ultrasound gel | ParkerLabs | 01-08 | |
| Water bath | FUS Instruments | ||
| Xylazine | Covetrus | 1XYL006 |
References
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