Summary
Her beskriver vi en protokol, der beskriver, hvordan man udfører sonodynamisk terapi i en in vivo museglioblastommodel ved hjælp af magnetisk resonansstyret fokuseret ultralyd.
Abstract
Sonodynamisk terapi (SDT) er en anvendelse af fokuseret ultralyd (FUS), der gør det muligt for et sonosensibiliserende middel til prime tumorer for øget følsomhed under sonikering. Desværre mangler de nuværende kliniske behandlinger for glioblastom (GBM), hvilket fører til lave langsigtede overlevelsesrater blandt patienter. SDT er en lovende metode til behandling af GBM på en effektiv, ikke-invasiv og tumorspecifik måde. Sonosensibilisatorer kommer fortrinsvis ind i tumorceller sammenlignet med det omgivende hjerneparenkym. Anvendelsen af FUS i nærvær af et sonosensibiliserende middel genererer reaktive oxidative arter, hvilket resulterer i apoptose. Selvom denne terapi tidligere har vist sig at være effektiv i prækliniske undersøgelser, mangler der etablerede standardiserede parametre. Standardiserede metoder er nødvendige for at optimere denne terapeutiske strategi til præklinisk og klinisk brug. I dette papir beskriver vi protokollen til at udføre SDT i en præklinisk GBM gnavermodel ved hjælp af magnetisk resonansstyret FUS (MRgFUS). MRgFUS er et vigtigt træk ved denne protokol, da den giver mulighed for specifik målretning af en hjernetumor uden behov for invasive operationer (f.eks. Kraniotomi). Den stationære enhed, der bruges her, kan fokusere på en bestemt placering i tre dimensioner ved at klikke på et mål på et MR-billede, hvilket gør målvalg til en ligetil proces. Denne protokol vil give forskere en standardiseret præklinisk metode til MRgFUS SDT med den ekstra fleksibilitet til at ændre og optimere parametre til translationel forskning.
Introduction
Glioblastom (GBM) er en form for meget aggressiv hjernekræft, der har en forekomst på 3,21 pr. 100.000 mennesker og er den mest almindelige ondartede hjernetumor1. Den nuværende standard for pleje omfatter kirurgisk resektion, stråling og kemoterapi2. På grund af tumorens invasive og infiltrative karakter er fuldstændig tumorresektion sjælden. Resterende væv ved tumormargenerne resulterer i en høj tumorgentagelseshastighed og en lav overlevelsesrate på mindre end 6% efter 5 år1.
På grund af denne prognose undersøger forskere nye terapeutiske muligheder for at bekæmpe denne dødelige sygdom. Sonodynamisk terapi (SDT) er en ikke-invasiv behandling, der kombinerer lavintensitetsfokuseret ultralyd (FUS) og sonosensibiliserende midler til at producere en cytotoksisk virkning i målrettede celler3. Som et eksempel optages porfyrinbaserede sonosensibilisatorer, såsom 5-aminolevulinsyre (5-ALA), fortrinsvis af tumorceller og øger produktionen af reaktive oxidative arter (ROS) til skadelige niveauer, når de udsættes for fokuseret ultralyd. Overudtrykte niveauer af ROS i celler kan beskadige cellulære strukturer og udløse apoptose. Da 5-ALA fortrinsvis optages af tumorceller, er sundt væv inden for behandlingsområdet uskadt 3,4. Foreløbige in vitro-undersøgelser har vist, at mange kræftceller lyseres ved SDT-behandling, selvom celledødshastigheden er afhængig af cellelinjen. Foreløbige in vivo-undersøgelser giver lignende resultater, hvilket bekræfter, at SDT kan udløse apoptose5.
Denne protokol har til formål at beskrive effektive teknikker og parametre til SDT-behandling af gnavermodeller med intrakranielt implanterede GBM-celler ved hjælp af en benchtop FUS-forskningsplatform. Forskere kan bruge denne protokol til at udføre og optimere SDT til translationel FUS-forskning.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt og udført i overensstemmelse med Johns Hopkins University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Athymiske nøgne hunmus (alder: 10 uger) blev hentet fra kommercielle kilder (se materialetabel). Alle regler for biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2) blev fulgt, herunder brugen af masker, handsker og kitler.
1. Tumorimplantationer og billeddannelse af bioluminescens
- I den indledende fase af undersøgelsen udføres intrakraniel tumorimplantation efter en tidligere offentliggjort rapport6.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev 100.000 M59 humane GBM xenograftceller i 4 μL cellesuspension anvendt til implantation i en 3,0 mm dybde ind i kraniet. - Før behandlingen kvantificeres tumorstørrelsen i hver mus noninvasivt ved hjælp af et in vivo luminescensbilleddannelsessystem (se materialetabel) efter en tidligere offentliggjort rapport7.
BEMÆRK: Dette blev gjort på behandlingsdatoen, 7 dage efter de første tumorimplantationer. - Ved hjælp af billeddannelseskvantificering opdeles musene i sammenlignelige undergrupper til behandling.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev to undergrupper inkluderet: (1) ubehandlede tumorbærende mus (n = 4) og (2) tumorbærende mus, der gennemgår SDT (n = 4). Der blev ikke observeret nogen statistisk signifikant forskel i tumorstørrelse før behandling mellem de to grupper (p > 0,05).
2. Opsætning af behandlingsdag
- 5-ALA-hydrochlorid (se materialetabel) fjernes fra fryseren, og der vejes 200 mg/kg musevægt på 5-ALA (f.eks. for en mus på 25 g vejes 5 mg.). Gør det kun under omgivende lys.
BEMÆRK: Steril alt udstyr før brug. - Den totale mængde 5-ALA opløses i fosfatbufret saltvand (PBS), således at hvert dyr får en 60 mg/ml opløsning af 5-ALA med den korrekte vægtdosering (f.eks. opløses 5 mg 5-ALA i 83,33 μL PBS for en 25 g mus).
- For hvert dyr i SDT-testgruppen injiceres den korrekte mængde opløsning af 5-ALA intraperitonealt i dyret (beregnet i trin 2.1 og 2.2).
- Lad dyrene stå i deres bure i 3 timer for at metabolisere 5-ALA.
3. Forberedelse af forudsætninger for forsøg
- Fyld et reservoir med deioniseret (DI) vand.
BEMÆRK: Den nødvendige mængde vand er baseret på antallet af mus, der blev brugt i undersøgelsen. - Fastgør Flow in og Flow out rørene til ultralyd degasser (se tabel over materialer) og tilslut afgasseren til strømmen (1 = ON, 0 = OFF).
- Placer den anden ende af flowet ind og flow ud rør ind i DI-vandbeholderen.
- Tænd for afgasseren og kør i 45 min.
- Fyld det nyligt afgassede vand til toppen af en lufttæt, forseglet beholder, der skal bruges under undersøgelsen.
- Hæld ultralydsgel (se materialetabel) i et konisk rør, og læg det derefter i en centrifuge og drej ved 160 x g i 5 minutter for at fjerne luft fra gelen.
BEMÆRK: Der kræves nok gel til at danne en klat gel på hovedet af hvert dyr.
4. MRgFUS-systemopsætning
- Tilslut MRgFUS-systemet (se materialetabellen) ved hjælp af ledningsdiagrammet som vist i figur 1 (nederste panel).
- Tilslut alle nødvendige komponenter (stationær computer, skærm, MRgFUS-platform, oscilloskop, forstærker) til strøm.
- Tilslut alle kabler til de rigtige steder.
- Tilslut den ønskede transducer til MRgFUS-platformen via BNC- og koaksialkablerne, og tilslut derefter den tilsvarende impedansmatchende boks til de korrekte ledninger.
BEMÆRK: En 515 kHz transducer blev brugt til denne undersøgelse.
- Tænd alle enheder.
- På desktopcomputerens operativsystem skal du åbne AUREUS-applikationen, som allerede er integreret i FUS-systemsoftwaren.
- Vælg Tilslut al hardware for at slutte hardwaren til systemet og kontrollere, at komponenterne kommunikerer med softwaren.
- Vælg den anvendte transducer ved at vælge rullemenuen og vælge den ønskede transducer.
5. Initialisering
- Skru bundskruen ud af fantomet og fyld hulrummet med deioniseret og afgasset vand, indtil det løber over, og udskift derefter skruen igen.
- Indsæt fantomet i dets tilsvarende MR-lejeplacering (se figur 2), og placer derefter MR-sengen i MR-holderen i dens tilsvarende slot.
- Placer MR-holderen på dens tilsvarende placering i MR-scanneren (se materialetabel). Juster holderen, så fantom-MR-sengen kan glide ind i MR-boringen uden forhindringer for at opnå et billede af fantomet i høj kvalitet. Markér denne placering, så den let kan replikeres i fremtiden.
BEMÆRK: Når denne placering er fundet, ændres placeringen ikke for resten af behandlingen. Sørg derfor for, at det er et passende sted til MR-placering af dyr, ellers skal hele registreringen gentages. - Tag en MR-scanning af fantomet ved hjælp af indstillingerne i tabel 1.
- Fjern holderen fra magnetboringen, men opbevar den på scanneren. Fjern MR-sengen, der indeholder fantomet, fra holderen, og placer derefter sengen med fantomet på MRgFUS-systemet ved at skubbe pinden i bunden ind i dens korrekte åbning.
- Sæt registreringsspidsen på de magnetiske åbninger på transducerarmen, så den peger nedad mod fantomet (se figur 2).
- På softwaren skal du vælge Vælg en ny startposition og derefter vælge Jog Mode On for at starte guidet fokuseret søgning. Når jog-tilstand er skiftet, skal du bruge tasterne venstre, højre, op, ned, side op og side ned til manuelt at flytte transducerarmen rundt i henholdsvis venstre, højre, fremad, bagud, op og ned.
- Juster markøren manuelt i alle tre dimensioner, indtil spidsen af markøren rører midten af krydsmønsteret, der ligger øverst på fantomet (se figur 2).
- Download fantom-MRI-billederne til computeren, og placer dem i en mappe i den valgte mappe, og indlæs derefter MR-billederne i softwaren ved at vælge Indlæs fantombilleder. De aksiale fantomskiver udfylder derefter skærmen på højre side. Rul gennem disse udsnit via musens rullepanel. Juster lysstyrken ved at klikke og holde på billedet og derefter flytte musen op eller ned.
BEMÆRK: Hvis nogen af filerne i mappen ikke er ukomprimerede DICOM-filer, kan softwaren ikke læse og importere dem, så fjern eventuelle andre filer fra den mappe. - Rul til et billede af fantomet, hvor der er en klar cirkel med tre mørke huller i hver. Klik på midten af fantomet, og en rød cirkel vises. Klik og træk i cirklen, indtil den har samme diameter og flugter med fantomets omkreds (se figur 2).
- Koordinaterne for denne position kaldes »hjemmeposition«; Gem dette ved at klikke på Angiv L/R, A/P og S/I.
- Klik på Jog Mode Off, fjern registreringstippet fra transducerarmen, og vælg derefter Afslut fokussøgning. Bekræft startpositionen for at fuldføre initialiseringssekvensen.
6. Forberedelse af dyr til SDT
- Bedøv musen ved hjælp af en isofluran-O2 gasblanding i et induktionskammer. Indstil gasstrømningshastigheden til 1,0 ml / min og fordamperen til 2,0% til anæstesiinduktion, hvilket typisk kræver 3-5 minutter i kammeret (se materialetabel).
- Vurder dyret for tilstrækkelig sedation ved at klemme tåen. Påfør en oftalmisk salve til øjnene for at undgå tørhed i hornhinderne.
BEMÆRK: Overvåg anæstesidybden under hele proceduren. - Injicer musen med 40 μL gadoliniumkontrastmiddel gennem halevenen (se materialetabel).
- Fjern hår, der blokerer hovedbunden over kraniet ved hjælp af en hårfjerningscreme og en elektronisk barbermaskine.
- Fastgør dyret til MR-lejet ved hjælp af følgende trin (se figur 3).
- Tilslut indløbsrøret i MR-lejet (figur 3A) til en kilde til isofluran til anæstesi, og indstil gasstrømningshastigheden til 1,0 ml / min og fordamperen til 2,0% til anæstesiinduktion. Tilslut udløbsrøret til en kulfilterbeholder til anæstesiabsorption.
- Anbring næsekeglestykket i dets åbning som vist i figur 3B. Skub bidstangen gennem bidestangshullerne i både næsekeglen og for enden af sengen, som vist, med bidbeskytterenden svævende over den åbne brønd i MR-sengen.
- Placer dyret på MR-sengen med ørerne på linje med de stereotaktiske ørestangshuller og lås tænderne gennem bidbeskyttelsen for at holde det på plads. Skub næsekeglen fremad, så den er over toppen af dyrets snude for at give en jævn strøm af anæstesi.
- Skub ørestængerne gennem hullerne på begge sider af MR-sengen og hæv dyrets hoved, indtil begge ørestænger kan passe ind i musens ørekanaler.
BEMÆRK: Skub ikke for langt, da dette kan beskadige dyrets trommehinder. - Sørg for, at dyret er i en behagelig position. Skru derefter de MR-kompatible skruer i ved hjælp af en fladskruetrækker for at låse begge ørestænger, næsekeglen og bidestangen i. Dette vil låse dyret på plads og forhindre enhver hovedbevægelse, indtil dyret fjernes fra sengen.
BEMÆRK: Sørg for, at der ikke er nogen forstyrrelse af dyrets placering på MR-sengen efter dette trin. Hvis dyret bevæger sig, skal hele opsætningen (trin 6.5) gentages, uanset hvor langt protokollen er. - Mens dyret venter, skal du placere MR-sengen på en varm varmepude for at opretholde kropstemperaturen.
BEMÆRK: Overvåg og vedligehold kropstemperaturen under hele proceduren.
- Isofluran tilføres kontinuerligt til dyret via rør, der er fastgjort til næsekeglerne under hele behandlingen, når dyrelejet er fastgjort på FUS-systemet ved hjælp af armaturerne på platformen.
7. MR-procedurer
- Tag MR-lejet med dyret stereotaktisk fastgjort og placer det i MR-vuggen, der tidligere var forbundet til MR-scanneren (se materialetabel), ved at placere MR-bedhullet i enden til pinden på MR-holderen, som vist i figur 3. Fastgør indløbs- og udløbsanæstesirørene til de tilsvarende rør i MR-maskinen.
- Skub MR-holderen, der indeholder dyret, ind i MR-boringen, og sørg for at holde den samme placering som hvor fantomet blev placeret.
- Udfør en lokalisering for at se placeringen af dyrehjernen og derefter en T1-vægtet MR-scanning efter kontrast, der dækker hele hjernen ved hjælp af MR-indstillingerne fra tabel 2.
- Eksporter MR-scanningen som et sæt ukomprimerede DICOM-filer, én for hvert udsnit.
8. Fokuseret ultralydsbehandling (figur 4)
- Fjern dyret fra MR-holderen efter afslutningen af scanningen, og placer det på platformen ved at placere forsiden af sengen i den tilsvarende pind bag på platformen og placere bagsiden af sengen i den tilsvarende pind.
- Tilslut MR-sengens indløbsrør til en kilde til isofluran til anæstesi, og indstil gasstrømningshastigheden til 1,0 ml / min og fordamperen til 2,0% til vedligeholdelse af anæstesi. Tilslut udløbsrøret til en kulfilterbeholder til anæstesiabsorption.
- Overfør sættet af DICOM-filer til computeren og læg dem i en mappe i hovedarbejdsmappen for den aktuelle undersøgelse.
BEMÆRK: Se trin 5.9 for filkrav. - I softwaren skal du gå til hovedinitialiseringssiden og tænde Jog Mode ved at klikke på Guided Focus Finding og derefter klikke på Jog Mode On.
- Placer en klat centrifugeret ultralydgel på dyrets hoved, med nok gel til at dække hele hovedbunden over kraniet.
- Hæld DI og afgasset vand i vandbadet op til 80%, og sæt derefter vandbadet på dets tilsvarende søjler på platformen.
- Sænk vandbadet fyldt med DI-vand, indtil bundmembranen berører ultralydgelen på dyrets hoved og danner en koblingsoverflade mellem vandet og gelen. Sørg for, at ultralydgelen dækker hele dyrets hoved til vandbadet, og at der ikke er luftbobler i ultralydgelen mellem vandbadet og musens hovedbund.
- Nedsænk ultralydstransduceren i vandbadet, og sørg for, at der ikke dannes luftbobler på transduceroverfladen.
- Sænk transducerarmen ved hjælp af Jog Mode Down mod den delvist nedsænkede transducer, og kobl den til transduceren ved at justere de magnetiske åbninger med hinanden, mens transduceroverfladen forbliver nedsænket.
- Deaktiver Jog-tilstand og derefter Afslut fokuseret søgning som gjort under initialiseringstrinnet. Sørg for at bekræfte hjemmepositionen som gjort før.
- Gå til behandlingsfanen, og upload derefter de T1-vægtede MR-filer efter kontrast ved at klikke på mappeikonet øverst midt på skærmen. Vælg den mappe, der indeholder de DICOM-filer, der tidligere blev overført til computeren, og åbn dem. Dette trin skal automatisk indlæse alle DICOM-filer øverst til højre.
- Vælg derefter den korrekte behandlingstilstand på fanen Sonikeringstilstand ved at vælge enten Burst eller Continuous Wave. Hvis du er i burst-tilstand, skal du i fanen Sonikeringsindstillinger indtaste burstlængden, burstperioden og antallet af perioder. Disse parametre svarer til hver sonikeringsplacering. Hvis du er i kontinuerlig bølgetilstand, skal du kun indtaste sonikeringsvarigheden.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev kontinuerlig bølgetilstand brugt i en varighed på 120 s. - Klik på målikonet øverst midt på siden, og vælg de rigtige placeringer på den korrekte MR-skive, hvor FUS-fokusområdet skal rettes. En lys rød firkant med en rød cirkel vil være til stede, hvor der klikkes på. Der kan vælges mere end ét valg.
- Til venstre for MR-billedet er en tabel, som udfyldes med 3D-koordinaterne for de valgte fokusområder. I den sidste kolonne i tabellen skal du indtaste det effektniveau, der skal sonikeres på hvert brændpunkt, som kan beregnes separat for hver transducer, der bruges til at opnå det ønskede tryk eller intensitetsniveauer. Klik på hvert fokuspunkt i tabellen for at bekræfte, hvilket vil resultere i, at koordinaterne fremhæves, og det tilsvarende fokusområde på billedet bliver blåt.
BEMÆRK: Se transducerdatabladet for at finde ud af, hvordan du oversætter det effektniveau, der er indtastet i tabellen, til tryk eller intensitet, da disse værdier er transducerspecifikke. - Når du er tilfreds med alle fokusområder, skal du vælge Bevægelsestest. Dette vil bede softwaren om at flytte transduceren til alle fokuspunkter for at sikre, at bevægelserne er mulige. Efter bekræftelse angiver softwaren Motion Test Complete. Hvis der opstår en fejl, skal du justere fokusområderne, så de kan passe inden for transducermotorernes 3D-akser.
- Når du er klar, skal du vælge Begin Sonication for at starte sonikeringsprotokollen, flytte transduceren og anvende de korrekte FUS-parametre på hvert valgt fokusområde.
- Når sonikeringsprotokollen er færdig, skal du frakoble transduceren fra transducerarmen, fjerne vandbadet fra platformen og tørre ultralydgelen fra dyrets hovedbund.
- Skru bid- og ørestængerne af, fjern dyret fra MR-sengen, og læg derefter dyret på en varm pude, indtil dyret vågner op fra anæstesi. På dette tidspunkt skal du returnere dyret til sit bur.
- For efterfølgende dyr gentages den samme protokol, startende fra afsnit 6.
- Når de ønskede dyr er behandlet, rengøres alle overflader, der berøres af dyr, med 70% ethanol (se materialetabel).
- Afslut softwaren, og luk derefter ned og sluk for hvert udstyr.
9. Trin efter behandling
- In vivo imaging system (IVIS) protokol fra afsnit 1 gentages for bioluminescens, der måler 24 timer efter behandling. For at analysere behandlingseffektiviteten skal du sammenligne bioluminescensregistreringerne før og efter behandlingen for at bestemme væksthastigheden for både behandlede og ubehandlede grupper.
- Udfør opfølgende MR-scanninger med de samme indstillinger fra trin 6.4. Ved hjælp af kontrastforstærkede scanninger skal du sammenligne den gennemsnitlige gråtoneintensitet i tumorregionen eller beregne det samlede volumen, der er dækket af kontrastmidlet for at bestemme forskelle i tumorvolumen før og efter behandling.
Representative Results
Tumorstørrelse falder hos dyr behandlet med SDT 24 timer efter behandling.
På dagen for SDT-behandling var det oprindelige gennemsnitlige bioluminescenssignal for kontrol- og behandlingsgrupperne (N = 4 hver) henholdsvis 2,0 x 10 6 ± 3,1 x 10 6 og 2,3 x 10 6± 1,3 x 10 6 p/s/cm2/sr. De gennemsnitlige bioluminescensværdier svarende til tumorstørrelse før behandling mellem de to grupper var ikke statistisk signifikante (p = 0,89). Det gennemsnitlige bioluminescenssignal for behandlingsgruppen var 3,57 x 10 6 ± 2,3 x 10 6 24 timer efter SDT, mens kontrolgruppens bioluminescerende signal blev øget til 5,5 x 10 6± 8,2 x 10 6 p / s / cm2 / sr. Som vist i figur 5 svarer dette til en vækstrate på henholdsvis 83,4% ± 78% og 172% ± 34%, forudsat eksponentiel vækst (p = 0,08). Af de fire behandlede dyr havde tre lavere vækstrater efter behandling sammenlignet med kontrollerne. Der var en outlier i behandlingsgruppen, der viste sammenlignelig vækst med kontrollerne, hvilket skævede afvigelserne.
Derudover gennemgik dyrene efterfølgende kontrastforstærket MR-billeddannelse dagen efter behandling til sammenligning af tumoren før og efter behandling. Den gennemsnitlige gråtoneintensitet af kontrastmiddel i tumorer blev udført på tværs af hver MR-skive for hvert dyr for at måle, hvor meget kontrastmiddel der kom ind i tumorer efter behandling, som et skøn over tumorstørrelse. Forbehandling var den gennemsnitlige tumorgråtoneintensitet mellem kontrol- og behandlede grupper ens. I gennemsnit steg denne gråtoneintensitet i kontrolgruppen til en større størrelse end i behandlede grupper, selvom dette ikke var signifikant (p = 0,47). Disse data fremgår af tabel 2. Den store variabilitet af disse resultater skyldes potentielt, at MRI'er kun blev taget 24 timer efter behandling, på hvilket tidspunkt SDT's terapeutiske potentiale kun begynder at forekomme. Alligevel viser figur 6 et eksempel på læsionerne skabt af SDT.
Figur 1: Opsætning af FUS-system. (Øverst) MRgFUS System med mærkede komponenter. (Forside) 1. Platform. 2. Akset motoriseret transducerarm. 3. FUS-transducer. 4. Vandbad. 5. MR seng. 6. Skærm. 7. Transducerimpedans matchende boks. 8. Effektforstærker boks. 9. Funktion generator. 10. Funktionsgenerator kanal 1 BNC-port. 11. Stationær computer. (Nederst) MRgFUS-system med farvekodede ledningsskemaer med følgende forbindelser. (Tilbage) 1. Netledninger. 2. Overvåg HDMI til desktop HDMI. 3. Port B USB B til desktop USB A. 4. Oscilloskop LAN ethernet til desktop ethernet. 5. Motion interface ethernet til desktop ethernet. 6. Oscilloskop aux ind / ud BNC til AWG input BNC. 7. Oscilloskop kanal 1 (Front) BNC til SYNC BNC. 8. Matchende boksudgang BNC til RF-indgang koaksial. 9. RF-udgang koaksial til matchende bokskoaksial. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Fantomregistrering. (A) Systemopsætning og software under fantomregistrering. (B) Skærmbillede af fantomregistreringsskærmen, hvor den røde cirkel er den valgte omkreds af det aksiale tværsnit. (C) Fantomer placeret på MR-sengen, set ovenfra. (D) Set fra siden af fantomet, hvor den røde linje er i den aksiale skive, der svarer til cirklen i C. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Anbringelse af dyr. (A) MR-seng og vugge, med forskellige dele mærket: 1. MR-vugge. 2. Stereotaktisk MR-seng. 3. Ørestænger. 4. Bidestang. 5. Næsekegle. 6. MR seng peg hul. 7. Isofluranbedøvelsesrør. (B) Illustration, der repræsenterer placeringen af musen på MR-lejet og placeringen på holderen, med RF-spolen (orange) (illustration ændret ved hjælp af Biorender 2022-skabelon). (C) Illustration, der repræsenterer placeringen af musen på MR-lejet under en FUS-behandling (illustration ændret ved hjælp af Biorender 2022-skabelon). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Valg af fokuspunkt. Eksempel på valg af sonikeringspunkt i et enkelt dyr. Hver kolonne repræsenterer et T1-vægtet MR-udsnit efter kontrast, hvor hvert udsnit er 0,5 mm i proksimal (skive 1) til distal (skive 5) retning. Tumorgrænsen blev manuelt segmenteret og er skitseret i rødt (række 1), og de tilsvarende sonikeringssteder (række 2) er repræsenteret af en lysegrøn firkant (fokal max center) og blå cirkel (halv max fokal omkreds). Hver placering blev sonikeret i 2 minutter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Vækstrate efter SDT. Væksthastigheden af GBM-tumorer fra præ- til 24 timer efter SDT-behandling hos behandlede og ubehandlede (kontrol) dyr med intrakranielle M59-tumorer baseret på den målte luminescens. Fejlbjælker angiver standardafvigelse. En to-prøve elevs T-test blev udført for at bestemme betydningen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: SDT genereret læsion. Pre- og post-kontrast forbedrer T1-vægtede MR-scanninger fra en dyremodel med en repræsentativ aksial skive, der viser en læsion i tumoren skabt af SDT. (Venstre) MR-scanning taget før SDT-behandling, med tumoren skitseret med rødt. (Midten) Valg af FUS brændpunkt, hvor det maksimale tryk repræsenteres af lyseblå cirkler, og de halvmaksimale trykområder repræsenteres af blå cirkler. (Højre) Post-SDT MR-scanninger, hvor tumoren er skitseret med rødt. SDT-skabte læsioner og sprøjtehullet til implantation vises. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Sekvens | T1 |
| Gentagelsestid | 3000 ms |
| Ekko tid | 30 ms |
| Udsnit tykkelse | 0,5 mm |
| Antal udsnit | 25 |
| Pixelafstand | 0,187 mm x 0,187 mm |
| Erhvervelse matrix | 133 x 133 |
| Gennemsnit | 4 |
Tabel 1: MR-indstillinger.
| Kontrol | SDT Gruppen | P-værdi | |
| Forbehandling | 7,49 x 10 3 ± 2,2 x 103 | 7,48 x 10 3 ± 1 x 103 | 0.99 |
| Efterbehandling | 8,79 x 103 ± 7,7 x 102 | 7,95 x 10 3 ± 1,1 x 103 | 0.33 |
| Procentvis forskel | 16% ± 16% | 7% ± 12% | 0.47 |
Tabel 2: Forstærket T1-vægtet MR-gråtoner efter kontrast.
Discussion
Nye terapeutiske og effektive behandlingsmuligheder er nødvendige for patienter med GBM. Denne protokol har skitseret en præklinisk FUS-medieret behandling af GBM, der i øjeblikket gennemgår omfattende undersøgelser til klinisk oversættelse. Selvom SDT har et spændende potentiale, er der stadig meget at forstå og optimere i den prækliniske kontekst.
En af de vigtigste komponenter i denne protokol er at udnytte MR-vejledt FUS til at målrette tumoren for maksimal effekt. Ved hjælp af et fantom, kan der oprettes et 3D-koordinatrum, hvor hver pixel af aksiale MR-skiver kan tildeles en koordinat. Derefter informerer en simpel procedure for valg af sonikeringssted på MR-billedet transduceren, hvor den skal sigte. Det anvendte prækliniske FUS-system er meget alsidigt og anvendeligt, når det er nødvendigt at målrette steder med specifik patologi, såsom en tumor, herunder dybere siddende tumorer, som ville være svære at målrette mod uden billeddannelsesbekræftelse. Ved hjælp af gadolinium som kontrastmiddel er der klar visualisering af tumoren, så brugeren kan træffe informerede beslutninger, når han vælger mål. Fordelen, som SDT har i forhold til mange andre behandlinger, er, at det er en tumorspecifik terapi. FUS med lav intensitet bør kun målrette tumorvævet, mens det sunde hjerneparenkym forbliver relativt uberørt 3,8.
Resultaterne af dette eksperiment fremhæver, hvordan fordelene ved denne protokol kan føre til terapeutiske resultater, der ligner andre fund i litteraturen for SDT. Figur 5 viser, at der inden for så lidt som 24 timer efter behandlingsdagen var en opbremsning af tumorvæksten i den behandlede kohorte. Selvom det er ubetydeligt ved hjælp af denne lille prøvestørrelse, kan signifikans resultere i et større antal dyr. Denne forsinkelse i tumorvækst svarer til det, der blev vist i det banebrydende papir om dette emne af Wu et al. (2019), som udviste langsommere tumorvækst over tid hos behandlede dyr samt øgede overlevelsestider9.
Overvejelser, der blev gjort ved udformningen af denne protokol, omfattede dyrestamme, tumortype og valg af sonosensibiliserende middel. Athymiske nøgne mus blev valgt til denne protokol af flere grunde. For det første er den nøgne mus lettere at sonikere, da manglen på hår forhindrer enhver dæmpning. Manglen på et immunsystem muliggør også implantation af patientafledte xenotransplantater (PDX'er), så tumormodellen ligner den kliniske situation mere. Ulempen ved at bruge en athymisk model er, at immunsystemet ikke kan karakteriseres, så noget SDT-genereret immunrespons måles ikke i disse undersøgelser10. Den valgte tumorlinje er en aggressiv og hurtigt voksende PDX-linje. Behandlingstidspunktet er meget vigtigt, fordi etableringen af tumoren skal verificeres, men tumorbyrden bør ikke fylde kraniale halvkuglen. Forskellige cellelinjer kræver forskellige inkubationstider for at opnå en tumor af optimal størrelse til prækliniske eksperimenter. I denne protokol blev 5-ALA anvendt som sonosensibilisator på grund af dets præferenceoptagelse i GBM-tumorer, hvilket er blevet bekræftet in vitro for denne cellelinje i tidligere forsøg (upublicerede data). Andre sonosensibilisatorer kan erstattes og testes for at bestemme den forbindelse, der er bedst egnet til effektivitet og sikkerhed. Endelig blev behandlingen påbegyndt 3 timer efter 5-ALA injektion, da tidligere litteratur har vist, at dette er det optimale tidspunkt med den injektionsdosis5.
De FUS-parametre, der er valgt i denne protokol (10 W/cm2 i 2 minutter ved 515 kHz på hvert målsted) blev besluttet på baggrund af en gennemgang af tidligere litteratur og indledende eksperimenter 4,9. Et gitter af sonikeringspunkter, der dækker hele tumoren, blev valgt for at generere ROS-effekten gennem hele tumoren. Den intensitet, der anvendes her, er højere end andre publikationer, men på kort tid forventes dette ikke at føre til nogen negative temperaturrelaterede virkninger, da intensiteter op til 25 W/cm2 med succes er blevet anvendt i en musemodel uden signifikante bivirkninger11. Det er vigtigt, at der ikke er offentliggjort noget standardiseret eller optimeret sæt FUS-parametre i litteraturen. Derfor kan de specifikke værdier, der rapporteres her, justeres for at bestemme det optimale sæt parametre, hvilket fører til maksimal reduktion af tumorvæv, samtidig med at sikkerheden opretholdes. Derudover, da forskellige cellelinjer har varierende niveauer af vaskularisering og hypoxi, kan denne behandling muligvis justeres. Vi har vist samlet nedsat tumorvækst (figur 5) inden for 24 timer efter SDT-behandling, selvom parametrene skal optimeres, og flere dyr skal testes for at bestemme den maksimale effekt af denne behandling. MR-scanninger efter behandling viser ingen forekomst af læsioner skabt af FUS-behandling i sundt væv, med effekten lokaliseret til tumorvæv (figur 6). Der er også mulighed for at kombinere SDT med andre FUS-teknikker, såsom forbigående permeabilisering af blod-hjerne-barrieren, for at maksimere 5-ALA-optagelsen i tumor12. Denne protokol kan suppleres yderligere ved at udføre forskellige histologiteknikker for at kontrollere sikkerhed og effektivitet på strukturelt niveau. En hæmatoxylin og eosin (H & E) plet kan udføres for at kontrollere for strukturel eller tumorskade13, mens en terminal deoxynukleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL) plet kan udføres for at kontrollere for cellulær apoptose14. Uanset hvad præsenterer denne protokol en sikker og tumorspecifik behandling, hvor ændringer er mærkbare selv 24 timer efter behandling, hvilket fremgår ved at sammenligne væksthastigheden for tumorer behandlet med SDT og ubehandlede tumorer samt sammenligne tumorskiver før og efter sonikering.
Med enhver protokol er der altid ulemper eller begrænsninger, der skal vejes. Hovedbegrænsningen i den nuværende protokol er tid og omkostninger. I mellemtiden er en af fordelene ved denne protokol dens automatiserede fokuserede mål. For at opnå denne fokuserede procedure skal der tages MR-scanninger for hvert enkelt dyr for at sikre, at målretningen af tumoren er korrekt, en proces, der kan være både tidskrævende og dyr. Afhængigt af antallet af ønskede fokuspunkter kan den tid, der bruges til at udføre denne protokol, desuden være timer for selv nogle få dyr, hvilket resulterer i lave forsøgsdyr. På trods af disse ulemper forbliver denne målrettede ikke-invasive protokol en mulig præference sammenlignet med åbne kirurgiske muligheder.
Afslutningsvis viste denne protokol SDT-behandlingens evne til at mindske tumorvækst i hjernen inden for 24 timer efter behandlingen, samtidig med at der opretholdes sundt neuralt væv i en præklinisk musemodel. Undersøgelser af effektiviteten af SDT og optimering af de forskellige parametre for at øge ROS-produktionen er nødvendige for at gøre denne behandling klinisk egnet. Nye muligheder bør undersøges for anvendelse af SDT som en ikke-invasiv terapeutisk model.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at forskningen blev udført i mangel af kommercielle eller finansielle forbindelser, der kunne fortolkes som en potentiel interessekonflikt. Amir Manbachi underviser og rådgiver for BK Medical (GE Healthcare), Neurosonics Medical og er opfinder på en række patentanmeldte FUS-teknologier. Betty Tyler har forskningsmidler fra NIH og er medejer af Accelerating Combination Therapies*. Ashvattha Therapeutics Inc. har også licenseret et af hendes patenter, og hun er aktionær for Peabody Pharmaceuticals (*inkluderer egenkapital eller optioner).
Acknowledgments
Forfatterne anerkender finansieringsstøtte fra National Science Foundation (NSF) STTR Phase 1 Award (#: 1938939), af ASME Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Award (#: N660012024075) og Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research's (ICTR's) Clinical Research Scholars Program (KL2), administreret af National Institutes of Health (NIH) National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS). Cellerne blev købt fra og leveret af Mayo Foundation for Medical Education and Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| 1 mL Syringes | BD | 309597 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton Company | 49AL65 | |
| 10 µL Pipette tips | USAScientific | ||
| 1000 mL Flask | Corning | MP-34514-25 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | CLS430791 | |
| 200 Proof ethanol | PharmCo | 111000200 | |
| 5 mL pipettes | Falcon | 357543 | |
| 50 mL Conical tubes | Corning | 430290 | |
| 500 mL filter | Corning | 431097 | |
| 5-Aminolevulinic acid hydrochloride | Research Products International | A11250 | |
| 7T PET-MR system | Bruker | Biospec 70/30 | |
| Aluminum foil | Reynolds Brand | ||
| Amplifier | FUS Instruments | 2175 | |
| Athymic nude mice | Charles River Laboratories | Strain Code 490 | |
| Bone drill | Foredom | HP4-917 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004261 | |
| Charcoal isoflourane waste container | Patterson scientific | 78909457 | |
| Computer | FUS Instruments | 2269 | |
| Cover glass | Fisherbrand | 12-545J | |
| Desktop monitor | ASUS | VZ239H | |
| D-Luciferin | Gold Biotechnology | LUCK-1G | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Electronic shaver | Wahl | 93235-002 | |
| Eppendorf tubes | Posi-Click | 1149K01 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Formalin | Thermo Fisher Scientific | SF100-20 | |
| Function generator | Siglent | QS0201X-E01B | |
| Gadolinium contrast agent (Gadavist) | McKesson Corporation | 2068062 | |
| Gauze | Henry Schein | 101-4336 | |
| Heat lamp | |||
| Heat pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-12 | |
| Induction chamber | Patterson scientific | 78933388 | |
| Isofluorane vaporizer | Patterson scientific | 78916954 | |
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| Isoflurane system | Patterson Scientific | 78935903 | |
| IVIS spectrum | Perkin Elmer | 124262 | |
| Lightfield microscope | BioTek | Cytation 5 | |
| Nair | Church and Dwight Co. | 42010553 | |
| Ophthalmic ointment | Puralube vet ointment | ||
| P-20 pippette | Rainin | 17008650 | |
| Patient derived xenographs | Mayo Clinic | M59 | |
| Penicillin/Streptomyosin | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 70-011-069 | |
| Pippetter | Drummond | 4-000-101 | |
| Povidone-iodine | Covetrus | PI050CV | |
| RK-50 MRgFUS system | FUS Instruments | 2182 | |
| Scale | |||
| Scalpel blade | Covetrus | 7319 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Screwdriver set | Jakemy | JM-8160 | |
| Skin marker | Time Out | D538,851 | |
| Staple remover | MikRon | ACR9MM | |
| Stapler | MikRon | ACA9MM | |
| Staples | Clay Adams | 427631 | |
| Stereotactic frame | Kopf Instruments | 5000 | |
| Stereotactic MRI prototype plastic imaging fixture | FUS Instruments | ||
| T-25 culture flask | Corning | 430641U | |
| Transducer and matching box | FUS Instruments | T515H750-118 | |
| Ultrasonic degasser | FUS Instruments | 2259 | |
| Ultrasound gel | ParkerLabs | 01-08 | |
| Water bath | FUS Instruments | ||
| Xylazine | Covetrus | 1XYL006 |
References
- Tan, A. C., et al. Management of glioblastoma: State of the art and future directions. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 70 (4), 299-312 (2020).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. The New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- McHale, A. P., Callan, J. F., Nomikou, N., Fowley, C., Callan, B. Sonodynamic therapy: concept, mechanism and application to cancer treatment. Advances in Experimental Medicine and Biology. 880, 429-450 (2016).
- Ohmura, T., et al. Sonodynamic therapy with 5-aminolevulinic acid and focused ultrasound for deep-seated intracranial glioma in rat. Anticancer Research. 31 (7), 2527-2533 (2011).
- Shono, K., et al. Elevated cellular PpIX potentiates sonodynamic therapy in a mouse glioma stem cell-bearing glioma model by downregulating the Akt/NF-κB/MDR1 pathway. Scientific Reports. 11 (1), 15105 (2021).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), e1986 (2010).
- Poussard, A., et al. In vivo imaging systems (IVIS) detection of a neuro-invasive encephalitic virus. Journal of Visualized Experiments. (70), e4429 (2012).
- Borah, B. M., et al. Sonodynamic therapy in combination with photodynamic therapy shows enhanced long-term cure of brain tumor. Scientific Reports. 10 (1), 21791 (2020).
- Wu, S. -K., Santos, M. A., Marcus, S. L., Hynynen, K. MR-guided focused ultrasound facilitates sonodynamic therapy with 5-Aminolevulinic acid in a rat glioma model. Scientific Reports. 9 (1), 10465 (2019).
- Zhang, Q., et al. Sonodynamic therapy-assisted immunotherapy: A novel modality for cancer treatment. Cancer Science. 109 (5), 1330-1345 (2018).
- Nonaka, M., et al. Sonodynamic therapy consisting of focused ultrasound and a photosensitizer causes a selective antitumor effect in a rat intracranial glioma model. Anticancer Research. 29 (3), 943-950 (2009).
- Pi, Z., et al. Sonodynamic therapy on intracranial glioblastoma xenografts using sinoporphyrin sodium delivered by ultrasound with microbubbles. Annals of Biomedical Engineering. 47 (2), 549-562 (2019).
- Rodgers, G., et al. Virtual histology of an entire mouse brain from formalin fixation to paraffin embedding. Part 1: Data acquisition, anatomical feature segmentation, tracking global volume and density changes. Journal of Neuroscience Methods. 364, 109354 (2021).
- Chimata, A. V., Deshpande, P., Mehta, A. S., Singh, A. Protocol to study cell death using TUNEL assay in Drosophila imaginal discs. STAR Protocols. 3 (1), 101140 (2022).
