Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von CLON-G, um die Lebensdauer der Neutrophilen auf mehr als 5 Tage zu verlängern, und bietet ein zuverlässiges Verfahren zur Beurteilung des Neutrophilentods mit Durchflusszytometrie und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie.
Abstract
Die durchschnittliche Lebensdauer eines Neutrophilen beträgt weniger als 24 h, was die Grundlagenforschung an Neutrophilen und die Anwendung von Neutrophilenstudien einschränkt. Unsere bisherigen Forschungen zeigten, dass mehrere Signalwege den spontanen Tod von Neutrophilen vermitteln könnten. Es wurde ein Cocktail entwickelt, der gleichzeitig auf diese Signalwege abzielt, Caspasen-lysosomale Membranpermeabilisierung-Oxidationsmittel-Nekroptose-Hemmung sowie Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor (CLON-G), der die Lebensdauer der Neutrophilen auf mehr als 5 Tage verlängerte, ohne die Neutrophilenfunktion signifikant zu beeinträchtigen. Gleichzeitig wurde ein zuverlässiges und stabiles Protokoll zur Beurteilung und Bewertung des Neutrophilentods entwickelt. In dieser Arbeit zeigen wir, dass CLON-G die Lebensdauer von Neutrophilen in vitro auf mehr als 5 Tage verlängern kann, und wir zeigen die Verlängerung der Lebensdauer von Neutrophilen mit FACS und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie. Dieser Bericht stellt Verfahren zur Herstellung von CLON-G vor und stellt einen in vitro Spontantodtest von Neutrophilen vor, der für die Untersuchung von Neutrophilen und für die anschließende Untersuchung des Neutrophilentods verwendet werden kann und somit eine zuverlässige Ressource für die Neutrophilengemeinschaft darstellt.
Introduction
Es ist bekannt, dass Neutrophile ein Arsenal an reichlich zytoplasmatischen Granula, Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NADPH)-Oxidase, antimikrobiellen Enzymen und verschiedenen Organellen enthalten, die sich gegen eindringende Mikroben verteidigen. Darüber hinaus sind sie sehr beweglich und die ersten Zellen, die an die Entzündungsstelle rekrutiert werden, was bedeutet, dass Neutrophile die erste Verteidigungslinie des angeborenen Immunsystems sind 1,2. Die Granulozyten-Transfusionstherapie ist daher zu einer vielversprechenden klinischen Behandlung für neutropeniebedingte Infektionen geworden, um die Immunität der neutrophilen Granulozyten vorübergehend zu stärken 3,4,5. Neuere Entdeckungen haben deutlich gezeigt, dass Neutrophile in vielen physiopathologischen Szenarien auch als vielschichtige Effektoren fungieren6. Die durchschnittliche Lebenserwartung eines Neutrophilen beträgt weniger als 24 Stunden, so dass die Grundlagenforschung an Neutrophilen und die Anwendung von Neutrophilenstudien aufgrund der Einschränkungen im Zusammenhang mit stabiler Genmanipulation und Langzeitlagerung enorm schwierig sind 7,8,9,10,11 . Es gibt einige Zelllinien, die teilweise einige neutrophile Funktionen aufweisen können, wie z. B. HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 und induzierte pluripotente Stammzellen12. Diese Zelllinien können eine effektive Genom-Editierung und Kryokonservierung erreichen. Sie unterscheiden sich jedoch immer noch recht stark von den primären Neutrophilen und können daher die Funktionen der Neutrophilen nicht originalgetreu rekapitulieren13. Daher stützt sich der größte Teil der Forschung auf diesem Gebiet immer noch auf frisch isolierte primäre Neutrophile. Das Feld beruht immer noch auf der Erzeugung teurer und zeitaufwändiger bedingter Knock-out-Mäuse, um bestimmte Genfunktionen in Neutrophilen zu untersuchen, aber derzeit gibt es keine menschlichen Modelle.
Nachdem wir unsere Anstrengungen unternommen haben, um die heterogenen Prozesse zu erforschen, die am Tod von Neutrophilen beteiligt sind, und die vielfältigen Signalwege, die diese Prozesse regulieren14,15, wurde kürzlich über eine neue Behandlung namens CLON-G (Caspasen-lysosomale Membranpermeabilisation-Oxidationsmittel-Nekroptose-Hemmung plus Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor) berichtet 16. CLON-G besteht aus Q-VD-oph (Chinolyl-Valyl-O-methylaspartyl-[-2,6-difluorphenoxy]-methylketon), Hsp70 (Hitzeschockprotein 70), DFO (Deferoxamin), NAC (N-Acetylcystein), Nec-1s (Necrostatin-1s) und G-CSF (Granulozytenkolonie-stimulierender Faktor). Der Spontantod von Neutrophilen wird durch mehrere Wege vermittelt, darunter Apoptose, Nekroptose und Pyroptose. Q-VD-oph hemmt die Apoptose von Neutrophilen als Pan-Caspase-Inhibitor, indem es auf Caspase 1, Caspase 3, Caspase 8 und Caspase 9 abzielt17. Die Nekroptose der Neutrophilen ist von einem Signalweg abhängig, an dem die Rezeptor-interagierende Proteinkinase-1 (RIPK1) und das gemischte Kinase-Domänen-ähnliche Protein (MLKL) beteiligt sind18. Als RIPK1-Inhibitor hemmen Nec-1s die Nekroptose von Neutrophilen. Hsp70 und DFO können die lysosomale Membranpermeabilisierung (LMP) hemmen, was die Apoptose der neutrophilen Granulozyten19 und die Pyroptose20 induzieren könnte. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) spielen eine wichtige Rolle beim Tod von Neutrophilen, indem sie LMP19 und Apoptose21 vermitteln und Überlebenssignale22 hemmen. Als Antioxidans, das die Akkumulation von ROS reduzieren kann, verzögert NAC den Tod von Neutrophilen. Als Wachstumsfaktor aktiviert G-CSF die Überlebenssignale der neutrophilen Granulozyten und hemmt die Calpain-induzierte Apoptose23,24. Durch die gleichzeitige Ausrichtung auf mehrere spontane Todeswege der Neutrophilen kann die Lebensdauer der Neutrophilen effektiv auf mehr als 5 Tage verlängert werden, ohne ihre Funktion zu beeinträchtigen. Die CLON-G-Behandlung erweitert die Möglichkeiten der Konservierung, des Transports und der Genmanipulation von Neutrophilen, was die Forschung in der Gemeinschaft der Neutrophilen beschleunigen kann. In der Zwischenzeit können die derzeit zugelassenen Protokolle für Zelltod-Assays auf der Grundlage des Wissens über den Tod von Neutrophilen unerwartete Schäden an Neutrophilen verursachen14, so dass diese Protokolle verfeinert wurden, um für Neutrophilenstudien besser geeignet zu sein. Dieser Bericht enthält detaillierte Protokolle für die Kultivierung von Neutrophilen mit CLON-G und einen In-vitro-Zelltodtest von Maus-Neutrophilen mittels Durchflusszytometrie und Fluoreszenzbildgebung. CLON-G ist sowohl auf Maus- als auch auf menschliche Neutrophile wirksam; Die Mausproben werden hier jedoch demonstriert, um dieses Protokoll zu vereinfachen. Die Konzentration von NAC beträgt 1 mM für Maus-Neutrophile und 10 μM für humane Neutrophile. Hsp70 ist speziesspezifisch und sollte daher entsprechend der Quelle der Neutrophilen eingesetzt werden. Bei diesem Protokoll spielt es keine Rolle, ob und wie Neutrophile aus peripherem Blut oder Knochenmark isoliert werden.
Für die vorliegende Studie wurden Neutrophile aus dem Knochenmark der Maus isoliert, um genügend Neutrophile für die Experimente zu erhalten, da etwa 1 x 10 7-1,5 x 107 Neutrophile aus dem Knochenmark gewonnen werden können, während nur 1 x 10 6 Neutrophile aus dem peripheren Blut einer einzelnen 8-12 Wochen alten C57BL/6-Maus (beiderlei Geschlechts) isoliert werden können. Es wurde eine Gradientenzentrifugation durchgeführt, um eine mögliche Beschädigung und Aktivierung durch die mechanische Stimulation der FACS-Sortierung oder MACS-Sortierung zu vermeiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Das Boston Children's Hospital and State Key Laboratory of Experimental Hematology (SKLEH) Animal Care and Use Committee genehmigte und überwachte alle Verfahren. Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm der Kultivierung von Neutrophilen mit CLON-G und dem In-vitro-Todestest .
1. Verlängerung der Lebensdauer von Neutrophilen mit CLON-G
HINWEIS: Alle genannten Vorgänge und Materialien müssen steril sein. Stellen Sie sicher, dass alle Lösungen gut gemischt und gleichmäßig verteilt sind.
- Konservierung der CLON-G-Komponenten
- Lösen Sie 50 mg Q-VD-oph (siehe Materialtabelle) bis zu einer Endkonzentration von 100 mM auf, indem Sie 973,7 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzufügen, und pipettieren Sie die Flüssigkeit, bis die Mischung klar wird. 50 μl pro Röhrchen aliquotieren und bei −20 °C aufbewahren.
VORSICHT: DMSO ist eine schädliche chemische Flüssigkeit. Tragen Sie einen Laborkittel, eine Schutzbrille und eine Maske, um Hautkontakt, Augenkontakt und Einatmen zu vermeiden. - Hsp70 (siehe Materialtabelle) bei 4 °C auftauen und den Inhalt der Durchstechflasche herunterschleudern. 1 μl Hsp70 pro Röhrchen auf Eis aliquotieren und bei −80 °C haltbar machen.
HINWEIS: Hsp70 ist ein Protein; Eine ultrakalte Lagerung ist notwendig, um es stabil zu halten. Vermeiden Sie den Frost-Tau-Zyklus. - 1 mg DFO (siehe Materialtabelle) mit 7,61 ml RPMI 1640 auflösen, um einen Vorrat von 200 μM zu erhalten. Aliquot 500 μl pro Röhrchen und bei −20 °C aufbewahren.
- Lösen Sie 0,1 g NAC (siehe Materialtabelle) mit 2,5 ml RPMI 1640 in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen auf und stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7-7,4 ein. Fügen Sie RPMI 1640 zu einem Endvolumen von 3,06 ml hinzu, um ein 200-mM-NAC-Material herzustellen. Filtern Sie es mit einer 0,2 μm Filtereinheit. 500 μl pro Röhrchen aliquotieren und bei −20 °C aufbewahren.
HINWEIS: Das Auflösen von NAC in dieser hohen Konzentration ist nicht einfach, und Vortexing kann helfen, es aufzulösen. Phenolrot in RPMI 1640 ist ein perfekter Indikator für den pH-Wert; wenn die NAC gerade aufgelöst ist, ist die Farbe gelblich; Passen Sie es an, bis es rosa wird. NAC-Stammlösungen sind bis zu 1 Monat bei −20 °C stabil. - Lösen Sie 10 mg Nec-1s ( siehe Materialtabelle) auf 20 mM mit 1,8 ml DMSO auf und pipettieren Sie die Mischung, bis sie klar wird. 50 μl pro Röhrchen aliquotieren und bei −20 °C aufbewahren. Vor Licht schützen.
- 250 μg G-CSF (siehe Materialtabelle) werden mit 1,25 ml RPMI 1640 auf 200 μg/ml gelöst. 50 μl pro Röhrchen aliquotieren und bei 4 °C aufbewahren.
- Lösen Sie 50 mg Q-VD-oph (siehe Materialtabelle) bis zu einer Endkonzentration von 100 mM auf, indem Sie 973,7 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzufügen, und pipettieren Sie die Flüssigkeit, bis die Mischung klar wird. 50 μl pro Röhrchen aliquotieren und bei −20 °C aufbewahren.
- Herstellung von 2x CLON-G Nährmedium
- Bereiten Sie das Grundmedium vor. Geben Sie 39,5 ml RPMI 1640, 10 ml fötales Kälberserum (FBS) und 0,5 ml Pen-Streptokokken (Antibiotika) in ein 50-ml-Röhrchen, um RPMI 1640 mit 20 % FBS und 1 % PS als Basismedium herzustellen.
HINWEIS: Diese hohe FBS-Konzentration wird verwendet, um die verlängerte Kultur von Neutrophilen zu gewährleisten, die länger als 5 Tage dauern kann. Wenn die Kultivierungszeit 1-2 Tage beträgt, sind 10%-15% FBS ausreichend. - Tauen Sie alle Stammlösungen der CLON-G-Komponenten auf Eis auf.
- Verdünnen Sie 1 μl Hsp70 auf 20 μM durch Zugabe von 606 μl des Basismediums. Verdünnen Sie 1 μl von 200 μg/mL G-CSF auf 20 μg/ml durch Zugabe von 9 μl des Basismediums.
- Geben Sie 976 μl Basismedium in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie 1 μl Q-VD-oph (100 mM), 10 μl DFO (200 μM), 1 μl Hsp70 (20 μM), 10 μl NAC (200 mM), 1 μl Nec-1s (20 mM) und 1 μl G-CSF (20 μg/ml) hinzu, um 1 ml 2x CLON-G-Medium herzustellen.
HINWEIS: Das 2x CLON-G Medium sollte sofort nach der Zubereitung verwendet werden. Man kann das 2x CLON-G bei 4 °C zwischenlagern. Übrig gebliebene 20 μM Hsp70 müssen verworfen werden.
- Bereiten Sie das Grundmedium vor. Geben Sie 39,5 ml RPMI 1640, 10 ml fötales Kälberserum (FBS) und 0,5 ml Pen-Streptokokken (Antibiotika) in ein 50-ml-Röhrchen, um RPMI 1640 mit 20 % FBS und 1 % PS als Basismedium herzustellen.
- Kultur der neutrophilen Granulozyten
- Isolierung von Mausneutrophilen durch Gradientenzentrifugation im Anschluss an einen früheren Bericht25. Resuspendieren Sie die isolierten Maus-Neutrophilen im Basismedium (1 Million Zellen/100 μL).
Anmerkungen: Vermeiden Sie es, die Neutrophilen zu aktivieren, indem Sie sie vorsichtig behandeln. Vermeiden Sie Schaumbildung während des gesamten Prozesses. - Geben Sie 500 μl 2x CLON-G-Medium, 400 μl des Basismediums und 100 μl der Zellsuspension auf 24-Well-Kulturplatten ohne Gewebe (siehe Materialtabelle) und pipettieren Sie vorsichtig drei- bis viermal.
HINWEIS: Hohe Konzentrationen der Komponenten im 2x CLON-G-Medium können die Neutrophilen schädigen; Vermeiden Sie es, sie ohne das Basismedium zu addieren. Die nicht gewebekulturierte Kulturplatte ist notwendig, um eine Adhäsion von Neutrophilen zu vermeiden. - Legen Sie die Kulturplatte glatt in einen Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2 .
HINWEIS: Es ist nicht erforderlich, das Zellmedium innerhalb von 7 Tagen auszutauschen. Die Endkonzentrationen der CLON-G-Zusammensetzung betragen 50 μM Q-VD-Oph, 1 μM DFO, 10 pM Hsp70, 1 mM NAC, 10 μM Nec-1 s und 10 ng/mL G-CSF. - Färben Sie die kultivierten Neutrophilen mit Wright-Giemsa-Compound-Färbung (siehe Materialtabelle) und analysieren Sie sie mit einem Lichtmikroskop (Abbildung 2A-D). Alternativ kann mit APC-CD11b- und PE-Cy7-Ly6G-Antikörpern gefärbt und mit Durchflusszytometrie (Abbildung 2E-I) analysiert werden, wie zuvor beschrieben26.
- Isolierung von Mausneutrophilen durch Gradientenzentrifugation im Anschluss an einen früheren Bericht25. Resuspendieren Sie die isolierten Maus-Neutrophilen im Basismedium (1 Million Zellen/100 μL).
2. In-vitro-Spontantodtest von Neutrophilen
- Durchflusszytometrische Analyse
- Kultivieren Sie isolierte Neutrophile in einer Dichte von 1 Million Zellen/ml im Basismedium bei 37 °C und 5 % CO2. Die 24-Well-Kulturplatte ist nicht gewebekultiviert. Fügen Sie 1 ml Zellmedium pro Vertiefung hinzu.
- Lösen Sie 1 g CaCl2 mit 45 ml Kochsalzlösung auf, um 200 mMCaCl2 herzustellen. Filtern Sie es mit einer 0,2 μm Filtereinheit. Bei 4 °C haltbar machen.
- Bereiten Sie die Färbemischung vor. Geben Sie 7 μl Kochsalzlösung pro Probe in ein 1,5-ml-Röhrchen und fügen Sie 0,4 mg/ml FITC-Annexin-V, 0,5 mg/ml Propidiumiodid (PI) und 200 mM CaCl2-Lösungzu je 1 μl pro Probe hinzu. Gut mischen. Verwenden Sie die Lösung sofort nach der Zubereitung.
- Pipettieren Sie das Zellmedium vorsichtig fünf- bis siebenmal, um es gut zu mischen, und übertragen Sie anschließend 100 μl zu den gewünschten Zeitpunkten in ein Durchflusszytometrieröhrchen.
Anmerkungen: Vermeiden Sie Schaumbildung während des gesamten Vorganges. - Vortex-Zählperlen (siehe Materialtabelle), um sie gut zu mischen. 10 μl der gut gemischten Zählkügelchen werden in dasselbe Durchflusszytometrieröhrchen wie in Schritt 2.1.4 pipettiert.
- Die vorbereitete Färbemischung (Schritt 2.1.3) wird mit 10 μl in das Durchflusszytometrieröhrchen gegeben. Bei Raumtemperatur 5 Minuten vor Licht geschützt inkubieren.
- Geben Sie 100 μl Kochsalzlösung in das Röhrchen und mischen Sie es gut, um eine gleichmäßige Verteilung der Zählperlen und -zellen zu gewährleisten.
- Führen Sie eine durchflusszytometrische Analyse des Zellmediums durch. Sammeln Sie die Zellen mit einer niedrigen Rate von ~400 Ereignissen/s. Gate der APC-PE-Cy7-Zellen zu FSC-A und SSC-A und die intakten Zellen mit mittleren FSC-A- und SSC-A-Positionen zum FITC-Annexin-V und PE-PI; die Annexin-V−PI−-Population wird als gesunde Zellen klassifiziert.
HINWEIS: Die folgenden Gleichungen bestimmen die Gesamtzahl der gesunden Zellen pro Probe und die Lebensfähigkeit der neutrophilen Granulozyten:
Gesamtzahl gesunder Zellen pro Probe27 = (1.000/Anzahl der zählenden Kügelchen) × Anzahl der Annexin-V−PI− Populationen × 10
Lebensfähigkeit der Neutrophilen = Gesamtzahl der gesunden Zellen zum angegebenen Zeitpunkt/Gesamtzahl der gesunden Zellen zum Zeitpunkt Null
- Fluoreszenz-Bild-Assay
- Kultivieren Sie isolierte Neutrophile in einer Dichte von 1 Million Zellen/ml im Basismedium bei 37 °C und 5 % CO 2 in einer konfokalen Platte mit2 ml Zellmedium pro Platte.
HINWEIS: Ein konfokales Fluoreszenzmikroskop hat die beste Bildqualität, aber jedes Fluoreszenzmikroskop mit 488/561/DIC-Kanälen ist ausreichend, um dieses Experiment zu unterstützen. - Nehmen Sie den Teller zum angegebenen Zeitpunkt vorsichtig heraus. Jeweils 10 μl 0,4 mg/ml FITC-Annexin-V, 0,5 mg/ml PI und 200 mMCaCl2 gleichmäßig auf die Platte geben. Bei Raumtemperatur 5 min färben.
Anmerkungen: Vermeiden Sie Schütteln während des gesamten Vorganges. Fügen Sie die Färbemittel gleichmäßig und vorsichtig hinzu. - Nehmen Sie Fluoreszenzbilder an 488 (Annexin-V)/561 (PI)/DIC-Kanälen mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop mit einer 20-fach-Objektivlinse auf (siehe Materialtabelle). Stellen Sie die Belichtungszeit des Kanals 488 auf 500 ms, des Kanals 561 auf 200 ms und des DIC-Kanals auf 100 ms ein. Wählen Sie 5-10 zufällige Bereiche für jede Platte aus. Die Zelltypen sind in unserem bereits veröffentlichten Bericht14 definiert.
- Kultivieren Sie isolierte Neutrophile in einer Dichte von 1 Million Zellen/ml im Basismedium bei 37 °C und 5 % CO 2 in einer konfokalen Platte mit2 ml Zellmedium pro Platte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die Wright-Giemsa-gefärbte Morphologie (Abbildung 2A-D) und die FACS-Phänotypen (Abbildung 2E-J) der mit CLON-G behandelten Neutrophilen wurden nicht beeinflusst. Die Viabilität der mit CLON-G behandelten Neutrophilen nach 24 h betrug etwa 90%+, basierend auf der durchflusszytometrischen Analyse (Abbildung 3) und den Fluoreszenzbild-Assays (Abbildung 4). Eine geringere Viabilität könnte durch unsachgemäße Lagerung, falsche Konzentrationen der CLON-G-Komponenten oder schlechte Qualität der isolierten Neutrophilen resultieren. Die durchflusszytometrische Analyse der unbehandelten Neutrophilen, die 24 h lang mit dem Basismedium kultiviert wurden, zeigte, dass diese Neutrophilen eine Annexin-V-positive Population aufwiesen (Abbildung 3B). Der Verlust dieser Population könnte auf Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) im Zellmedium zurückzuführen sein. Die Fluoreszenzbilder der Neutrophilen, die mit dem Basismedium für 24 h kultiviert wurden, sollten gepuffte Zellen enthalten (weißer Pfeil in Abbildung 4A). Der Verlust von gepufften Zellen kann durch Schütteln oder Pipettieren der konfokalen Platte entstehen.
Abbildung 1: Flussdiagramm der Kultivierung von Neutrophilen mit CLON-G und dem in vitro Todestest. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Morphologie und Phänotypen der CLON-G-behandelten Maus-Neutrophilen. Die Zellen wurden nach der Kultivierung mit Wright-Giemsa-Compound-Färbung (A-D) gefärbt und mikroskopisch mit einer 40-fachen Objektivlinse oder (E-I) mit APC-CD11b- und PE-Cy7-Ly6G-Antikörpern gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert. (J) Die Verhältnisse der CD11b+- und Ly6G+-Zellen zu den angegebenen Zeitpunkten wurden statistisch analysiert. Der Maßstabsbalken beträgt 10 μm. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD von drei Experimenten dargestellt. ns = kein statistisch signifikanter Unterschied zur entsprechenden Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Durchflusszytometrische Analyse von CLON-G-behandelten Knochenmark-Neutrophilen der Maus . (A) Gating-Strategie, (B) repräsentative Ergebnisse und (C) die Lebensfähigkeit der Neutrophilen nach 24-stündiger Kultivierung. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD von drei Experimenten dargestellt. **P < 0,001 im Vergleich zur entsprechenden Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse für den Tod von Neutrophilen basierend auf dem Fluoreszenzbild-Assay. Absterben der Neutrophilen nach Kultivierung mit (A) basischem Medium für 24 h oder CLON-G für (B) 24 h, (C) 3 Tage oder (D) 5 Tage. Nach der Kultivierung wurden die Zellen mit FITC-Annexin-V (grün) und PI (rot) gefärbt und mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie beurteilt. Der Maßstabsbalken beträgt 40 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neutrophile Granulozyten spielen eine wichtige Rolle bei der angeborenen und adaptiven Immunität, und ihre Homöostase ist streng reguliert. Neutrophile Granulozyten sind die am häufigsten vorkommenden Leukozyten im peripheren Blut des Menschen und haben einen robusten und schnellen Umsatz. Ein gesunder Erwachsener kann täglich 1 x 109 Neutrophile/kg aus dem Knochenmark freisetzen28. Das Absterben der Neutrophilen ist daher zu einem der rätselhaften Rätsel auf diesem Gebiet geworden, und es wurden große Anstrengungen unternommen, um sie besser zu verstehen. Caspase 29,30,31,32, LMP 33, ROS21,22,33, Nekrose 34,35,36,37 und Nekropotose 18,38 sind nachweislich an diesen heterogenen Prozessen beteiligt. GM-CSF 24 und G-CSF23 können die Lebensdauer der neutrophilen Granulozyten bei unterdrückten Funktionen auf etwa24h verlängern. CLON-G zielt auf alle bekannten Mechanismen des spontanen Todes von Neutrophilen ab. Unseres Wissens nach bietet CLON-G derzeit die längste Verlängerung der Lebensdauer der neutrophilen Granulozyten in vitro, ohne die Funktion zu beeinträchtigen.
Um die besten Ergebnisse bei der Kultivierung von Neutrophilen mit CLON-G zu erzielen, müssen mehrere Vorbehalte berücksichtigt werden. Durch unser vorheriges pharmakologisches Screening16 wurde betont, dass genaue Konzentrationen der CLON-G-Komponenten der Schlüssel zum Erfolg sind und dass man daher versuchen sollte, Fehler bei der Zubereitung zu vermeiden und sie richtig zu konservieren. In Bezug auf die Manipulation und Reinigung der Neutrophilen ist es einfach, die Neutrophilen zu aktivieren und abzutöten; Daher sollten sie während des gesamten Prozesses schonend behandelt und nach der Isolierung kultiviert werden. Sie reagieren empfindlich auf die Zellkonzentration, den Zustand der Kulturplatte, die Temperatur und den pH-Wert. Man muss vorsichtig sein, wenn man dieses Protokoll ändert. In Bezug auf den In-vitro-Todestest haben frühere Ergebnisse gezeigt, dass spontan tote Neutrophile zu aufgeblähten Zellen anschwellen, die durch mechanische Kraft nicht tolerierbar sind; Das Abschleudern, Pipettieren und Waschen würde die Anzahl der Neutrophilen reduzieren, und das Ersetzen des Standard-Bindungspuffers durch eine CaCl2-Lösung kann diesen Prozess vereinfachen und die genaue Darstellung der Neutrophilen gewährleisten14. Diskrepanzen zwischen den technischen Duplikaten im selben Experiment könnten durch Schaumbildung während der Operation entstehen. Unterschiede zwischen unabhängigen Experimenten könnten auf Variationen in der Reinheit und Frische der Neutrophilen zurückzuführensein 39.
CLON-G kombiniert bekannte Signalwege und entsprechende hemmende Chemikalien, um den spontanen Tod der neutrophilen Granulozyten zu verhindern. Die Kernfrage dieses Feldes bleibt jedoch nach den komplizierten Signalwegen, die den Tod von Neutrophilen vermitteln, da diese noch nicht vollständig verstanden sind. Der Tod von CLON-G-behandelten Neutrophilen ist unvermeidlich. CLON-G hat also noch Luft nach oben. Was die Bestandteile von CLON-G betrifft, so sind klinisch applizierte Medikamente die beste Wahl, um die Möglichkeit der klinischen Anwendung von CLON-G-behandelten Neutrophilen zu erweitern. Q-VD-oph und Rec-1 sind jedoch nur für die Forschung bestimmt, und klinische Studien, die sich auf sie konzentrieren, sind derzeit nicht verfügbar. Daher sind alternative Verbindungen für die klinische Anwendung notwendig.
Durch die Verlängerung der Lebensdauer der Neutrophilen auf mehr als 5 Tage bei intakten Funktionen kann CLON-G endlose Möglichkeiten für die Neutrophilenforschung eröffnen. Mit diesem erweiterten Zeitfenster können Beobachtung, Genmanipulation, Langzeitlagerung, Transport und Kryokonservierung auf der Grundlage von CLON-G entwickelt werden. Die Arbeits-, Zeit- und Geldkosten würden erheblich reduziert, was die Eintrittsbarrieren für neue Forscher senken würde. CLON-G kann auch klinische Anwendungen für Neutrophile wie die Granulozyten-Transfusionstherapie fördern. Neutropenische Infektionen nach Chemotherapie sind eine der Haupttodesursachen bei Patienten, die an Krebs und hämatopoetischen Malignomen leiden 40,41,42,43,44. Die Granulozytentransfusionstherapie, die ein großes Potenzial als alternative Therapie zur Unterstützung dieser Patienten hat, ist durch die kurze Lebensdauer der Neutrophilen stark eingeschränkt45. Der derzeitige Prozessablauf für die Granulozytentransfusion dauert länger als die Lebensdauer eines Neutrophilen, was dazu führt, dass transfundierte Neutrophile ihre Wirksamkeit als Immunzelle der ersten Wahl verlieren. Die CLON-G-Behandlung bietet genügend Zeit für die Vorbereitung von Granulozytentransfusionen, die das Potenzial haben, unzählige Leben von neutropenisch infizierten Patienten zu retten und den übermäßigen Einsatz von Antibiotika einzudämmen. Gleichzeitig kann das vorliegende Protokoll für den Neutrophilen-Todestest den Status der Neutrophilen genau nachweisen und die Replizierbarkeit der experimentellen Ergebnisse verbessern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass die Forschung ohne Interessenkonflikte durchgeführt wurde.
Acknowledgments
Dieses Projekt wurde vom Haihe Laboratory of Cell Ecosystem Innovation Fund (22HHXBSS00036, 22HHXBSS00019), dem Innovationsfonds für medizinische Wissenschaften der Chinesischen Akademie der Medizinischen Wissenschaften (CAMS) (2021-I2M-1-040,2022-I2M-JB-015), dem Sonderforschungsfonds für zentrale Universitäten, dem Peking Union Medical College (3332022062) und dem Science and Technology Support Program der Provinz Sichuan (NO. 2021YJ0480) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm syringe filter | Pall Corporation | 4612 | Filtrate prepared CLON-G components. |
| 1.5 mL micro centrifuge tube | LABSELECT | MCT-001-150 | Lab consumable. |
| 15 mL Centrifuge Tubes | LABSELECT | CT-002-15 | Lab consumable. |
| 24 well cell culture plate | Falcon | 351147 | Neutrophil culture plate. |
| 50 mL Centrifuge Tubes | LABSELECT | CT-002-50 | Lab consumable. |
| BD LSRII | BD | Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death. | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | C4901 | Assitant of Annexin-V binding to phosphatidylserine. |
| Confocal microscope | Perkinelmer | UltraVIEW VOX | Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death. |
| Confocal plate | NEST | 801001-20mm | Lab consumable for fluorescent image assay. |
| Counting beads | Thermo Fisher | C36950 | Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death. |
| DFO | Sigma Aldrich | D9533 | Component of CLON-G. LMP inhibitor. |
| Dimethyl sulfoxide ( DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10099141C | Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply. |
| FITC-Annexin-V | BD | 51-65874X | Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel. |
| Hsp70 | Abcam | ab113187 | Component of CLON-G. LMP inhibitor. |
| NAC | Sigma Aldrich | A9165 | Component of CLON-G. Antioxidant. |
| Nec-1s | EMD Millipore | 852391-15-2 | Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor. |
| Penicillin-Streptomycin Solution (PS) | Gibco | 15070063 | Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination. |
| Propidium Iodide (PI) | BioLegend | 421301 | For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane. |
| Q-VD-oph | Selleck chem | S7311 | Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor. |
| Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF) | Chugai Pharma China | GRANOCYTE | Component of CLON-G. Promote neutrophil survival through Akt pathway. |
| Round-Bottom Polystyrene Tubes | Falcon | 100-0102 | Lab consumable for flow cytometry analysis. |
| RPMI1640 | Gibco | C11875500BT | Component of neutrophil culture basic medium. |
| Saline | LEAGENE | R00641 | Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death. |
| Sodium hydroxide (NaOH) | FENG CHUAN | 13-011-00029 | pH adjustion for NAC. |
| Wright-Giemsa Stain Solution | Solarbio | G1020 | Neutrophil cytospin staining. |
References
- Segal, A. W.
- Rosales, C. Neutrophil: A cell with many roles in inflammation or several cell types. Frontiers in Physiology. 9, 113 (2018).
- Chung, S., Armstrong-Scott, O., Charlewood, R. Therapeutic granulocyte infusion for patients with severe neutropaenia and neutrophilic dysfunction: New Zealand experience. Vox Sanguinis. 117 (2), 220-226 (2021).
- Zhou, B., et al. Clinical outcome of granulocyte transfusion therapy for the treatment of refractory infection in neutropenic patients with hematological diseases. Annals of Hematology. 97 (11), 2061-2070 (2018).
- Covas, D. T., et al. Granulocyte transfusion combined with granulocyte colony stimulating factor in severe infection patients with severe aplastic anemia: A single center experience from China. PLoS One. 9 (2), e88148 (2014).
- Tecchio, C., Cassatella, M. A. Uncovering the multifaceted roles played by neutrophils in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Cellular & Molecular Immunology. 18 (4), 905-918 (2021).
- Lahoz-Beneytez, J., et al. Human neutrophil kinetics: Modeling of stable isotope labeling data supports short blood neutrophil half-lives. Blood. 127 (26), 3431-3438 (2016).
- Pillay, J., et al. In vivo labeling with 2H2O reveals a human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 116 (4), 625-627 (2010).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Tofts, P. S., Chevassut, T., Cutajar, M., Dowell, N. G., Peters, A. M. Doubts concerning the recently reported human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 117 (22), 6050-6052 (2011).
- McDonald, J. U., et al. In vivo functional analysis and genetic modification of in vitro-derived mouse neutrophils. FASEB Journal. 25 (6), 1972-1982 (2011).
- Pedruzzi, E., Fay, M., Elbim, C., Gaudry, M., Gougerot-Pocidalo, M. -A. Differentiation of PLB-985 myeloid cells into mature neutrophils, shown by degranulation of terminally differentiated compartments in response to N-formyl peptide and priming of superoxide anion production by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. British Journal of Haematology. 117 (3), 719-726 (2002).
- Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: Cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
- Teng, Y., Luo, H. R., Kambara, H.
- Luo, H. R., Loison, F. Constitutive neutrophil apoptosis: Mechanisms and regulation. American Journal of Hematology. 83 (4), 288-295 (2008).
- Fan, Y., et al. Targeting multiple cell death pathways extends the shelf life and preserves the function of human and mouse neutrophils for transfusion. Science Translational Medicine. 13 (604), (2021).
- Caserta, T. M. Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties. Apoptosis. 8, 345-352 (2003).
- Wang, X., Yousefi, S., Simon, H. U.
- Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
- Kambara, H., et al. Gasdermin D exerts anti-inflammatory effects by promoting neutrophil death. Cell Reports. 22 (11), 2924-2936 (2018).
- Zhu, D., et al. Deactivation of phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate/Akt signaling mediates neutrophil spontaneous death. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (40), 14836-14841 (2006).
- Xu, Y., Loison, F., Luo, H. R. Neutrophil spontaneous death is mediated by down-regulation of autocrine signaling through GPCR, PI3Kgamma, ROS, and actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 2950-2955 (2010).
- van Raam, B. J., Drewniak, A., Groenewold, V., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor delays neutrophil apoptosis by inhibition of calpains upstream of caspase-3. Blood. 112 (5), 2046-2054 (2008).
- Klein, J. B., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor delays neutrophil constitutive apoptosis through phosphoinositide 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase pathways. Journal of Immunology. 164 (8), 4286-4291 (2000).
- Fan, Y., et al. Targeting multiple cell death pathways extends the shelf life and preserves the function of human and mouse neutrophils for transfusion. Science Translational Medicine. 13 (604), (2021).
- Xie, X., et al. Single-cell transcriptome profiling reveals neutrophil heterogeneity in homeostasis and infection. Nature Immunology. 21 (9), 1119-1133 (2020).
- Cosimo, E., et al. Inhibition of NF-kappaB-mediated signaling by the cyclin-dependent kinase inhibitor CR8 overcomes prosurvival stimuli to induce apoptosis in chronic lymphocytic leukemia cells. Clinical Cancer Research. 19 (9), 2393-2405 (2013).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Porter, A. G., Jänicke, R. U.
- Scheel-Toellner, D., et al. Clustering of death receptors in lipid rafts initiates neutrophil spontaneous apoptosis. Biochemical Society Transactions. 32, 679-681 (2004).
- Geering, B., Simon, H. U. Peculiarities of cell death mechanisms in neutrophils. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1457-1469 (2011).
- Gabelloni, M. L., Trevani, A. S., Sabatté, J., Geffner, J. Mechanisms regulating neutrophil survival and cell death. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 423-437 (2013).
- Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
- Cho, Y. S., et al. Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation. Cell. 137 (6), 1112-1123 (2009).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
- Zhang, D. -W., et al. RIP3, an energy metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from apoptosis to necrosis. Science. 325 (5938), 332-336 (2009).
- Wang, X., He, Z., Liu, H., Yousefi, S., Simon, H. -U. Neutrophil necroptosis is triggered by ligation of adhesion molecules following GM-CSF priming. Journal of Immunology. 197 (10), 4090-4100 (2016).
- Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837 (2021).
- George, B., Bhattacharya, S. Infections in hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) patients. Contemporary Bone Marrow Transplantation. Chandy, M., Radhakrishnan, V. S., Sukumaran, R. , Springer. Cham, Switzerland. (2020).
- Lucena, C. M., et al. Pulmonary complications in hematopoietic SCT: A prospective study. Bone Marrow Transplant. 49 (10), 1293-1299 (2014).
- Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: A global perspective. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (10), 1143-1238 (2009).
- Wingard, J. R., Hiemenz, J. W., Jantz, M. A. How I manage pulmonary nodular lesions and nodular infiltrates in patients with hematologic malignancies or undergoing hematopoietic cell transplantation. Blood. 120 (9), 1791-1800 (2012).
- Wingard, J. R., Hsu, J., Hiemenz, J. W. Hematopoietic stem cell transplantation: An overview of infection risks and epidemiology. Infectious Disease Clinics of North America. 24 (2), 257-272 (2010).
- Netelenbos, T., et al. The burden of invasive infections in neutropenic patients: incidence, outcomes, and use of granulocyte transfusions. Transfusion. 59 (1), 160-168 (2019).
