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Biochemistry

फ्लो साइटोमेट्री में बैसिलस सबटिलिस बीजाणु गणना और लेबल विश्लेषण में सुधार

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65141
Automatic Translation
1,2, 1,3,4, 1,4, 1,4, 1,3,6, 1,9, 8, 7, 7, 7, 5, 5, 1,2,3,6
1Laboratório de diagnóstico e controle de doenças infecciosas na Amazônia, Instituto Leônidas e Maria Deane - Fiocruz Amazônia, 2Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas (UFAM), 3Programa de Pós-Graduação em Biologia da Interação Patógeno-Hospedeiro - Fiocruz Amazônia, 4Programa de Pós-graduação em Ciências Aplicadas à Hematologia PPGH-UEA/HEMOAM, 5Department of Biology, Federico II University, 6Programa de Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas (UFAM), 7Laboratório de Imunologia Celular Aplicada à saúde, Fundação Oswaldo Cruz, FIOCRUZ Rondônia, 8Centro Multiusuário para Análises de Fenômenos Biomédicos (CMABio-UEA), Universidade Estadual do Amazonas, 9Universidade Federal do Amazonas (UFAM)

Summary

यह प्रोटोकॉल प्रवाह साइटोमेट्री के उपयोग पर केंद्रित है और एथिडियम ब्रोमाइड के साथ लेबल किए गए जीवाणु बीजाणुओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए मोतियों की गिनती करता है। विधि बरकरार बीजाणुओं की सतह पर प्रोटीन के सहसंयोजक युग्मन का विश्लेषण करने के लिए भी कुशल है।

Abstract

बैसिलस सबटिलिस के बीजाणु पहले से ही विभिन्न जैव प्रौद्योगिकी और प्रतिरक्षाविज्ञानी अनुप्रयोगों के लिए प्रस्तावित किए गए हैं; हालांकि, उन पद्धतियों के विकास की बढ़ती आवश्यकता है जो बीजाणुओं की सतह पर स्थिर एंटीजन का पता लगाने में सुधार करते हैं, साथ ही उनकी मात्रा का ठहराव भी करते हैं। फ्लो साइटोमेट्री-आधारित विश्लेषण को पहले बी सबटिलिस की लेबल वाली कोशिकाओं का पता लगाने के लिए तेज, विश्वसनीय और विशिष्ट दृष्टिकोण के रूप में प्रस्तावित किया गया है। इसमें, हम बीजाणु की सतह पर एक फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी (एफए) की प्रदर्शन दक्षता का मूल्यांकन करने और गिनती मोतियों का उपयोग करके बीजाणुओं की संख्या निर्धारित करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री के उपयोग का प्रस्ताव करते हैं।

इसके लिए, हमने एथिडियम ब्रोमाइड को डीएनए मार्कर और एक एलोफिकोसायनिन (एपीसी) लेबल एंटीबॉडी के रूप में इस्तेमाल किया, जिसे सतह मार्कर के रूप में बीजाणुओं के साथ जोड़ा गया था। बीजाणुओं की मात्रा का ठहराव मोतियों की गिनती का उपयोग करके किया गया था क्योंकि यह तकनीक कोशिकाओं का पता लगाने में उच्च सटीकता प्रदर्शित करती है। लेबल बीजाणुओं का विश्लेषण एक प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके किया गया था, जिसने युग्मन की पुष्टि की। नतीजतन, यह प्रदर्शित किया गया था कि डीएनए लेबलिंग ने अंकुरित बीजाणुओं का पता लगाने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा परिमाणीकरण की सटीकता में सुधार किया है। यह देखा गया कि एथिडियम ब्रोमाइड निष्क्रिय बीजाणुओं को लेबल करने में सक्षम नहीं था; हालांकि, यह तकनीक उनकी सतह पर युग्मित फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ बीजाणुओं की संख्या का अधिक सटीक निर्धारण प्रदान करती है, इस प्रकार अध्ययन के विकास में मदद करती है जो विभिन्न अनुप्रयोगों में जैव प्रौद्योगिकी मंच के रूप में बीजाणुओं के उपयोग पर ध्यान केंद्रित करती है।

Introduction

बैसिलस सबटिलिस एक रॉड के आकार का, ग्राम-पॉजिटिव जीवाणु है जो मौन बीजाणुओं का उत्पादन करने में सक्षम होता है जब पर्यावरणीय परिस्थितियां कोशिका वृद्धि की अनुमति नहीं देती हैं1. बीजाणु अत्यंत स्थिर कोशिका रूप हैं और बी सबटिलिस सहित कई प्रजातियों के हैं, व्यापक रूप से मानव और पशु उपयोग के लिए प्रोबायोटिक्स के रूप में उपयोग किए जाते हैं2. इसके प्रतिरोध और सुरक्षा गुणों के कारण, बी सबटिलिस का बीजाणु, जो विषम प्रोटीन प्रदर्शित करता है, को म्यूकोसल सहायक, एक टीका वितरण प्रणाली और एक एंजाइम-स्थिरीकरण मंच 3,4 के रूप में प्रस्तावित किया गया है।

बी सबटिलिस से बीजाणु प्राप्त करने के लिए, एक विशेष संस्कृति माध्यम का उपयोग करके पोषक तत्वों की कमी के लिए इसे उजागर करना आवश्यक है। इन बीजाणुओं को प्राप्त करने और शुद्ध करने के बाद, परीक्षण दक्षता 5,6 में सुधार करने के लिए उन्हें निर्धारित करना चाहिए। इस प्रकार, प्राप्त बीजाणुओं की एकाग्रता का विश्लेषण करने के लिए कुछ तरीकों को लागू किया जाता है। प्लेट की गिनती और एक पेट्रोफ-हौसर कक्ष, जिसे गिनती कक्ष के रूप में भी जाना जाता है, का उपयोग किया जा सकता है। उत्तरार्द्ध मूल रूप से रक्त कोशिकाओं की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए विकसित किया गया था; हालांकि, बीजाणु गिनती 7,8 के लिए सूक्ष्म जीव विज्ञान के क्षेत्र में इसका उपयोग करना संभव है। सेल गिनती के लिए उपयोग की जाने वाली मानक विधि होने के बावजूद, पढ़ना श्रमसाध्य है क्योंकि यह विधि पूरी तरह से मैनुअल है और इसकी सटीकता ऑपरेटर के अनुभव पर निर्भर करती है।

फ्लो साइटोमेट्री-आधारित (एफसी) विश्लेषण को पहले बेसिलस एसपीपी की लेबल कोशिकाओं का पता लगाने के लिए तेज, विश्वसनीय और विशिष्ट दृष्टिकोण के रूप में प्रस्तावित किया गया है। प्रवाह cytometry मोती गिनती के उपयोग नियमित परीक्षाओं (CD4 और CD8 टी लिम्फोसाइटों की निरपेक्ष गिनती) में सेल गिनती में प्रजनन क्षमता की गारंटी दी है और पता लगाया जा रहा है और प्रवाह cytometry9 का उपयोग कर गिना जा करने में सक्षम कणों से जुड़े अनुसंधान के विकास में. Godjafrey और Alsharif unlabeled बीजाणुओं10 के एफसी परिमाणीकरण के लिए मोतियों की गिनती के उपयोग का सुझाव दिया. बैसिलस एसपीपी में स्पोरुलेशन की निगरानी के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग वर्णित किया गया था।बीजाणु डीएनए10,11,12,13 लेबल के माध्यम से। फिर भी एक अन्य अध्ययन एफसी बीजाणु सतह15 पर फ्लोरोसेंटली लेबल प्रोटीन की मात्रा का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया.

इस अध्ययन ने प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके घटना की गिनती के संबंध में प्रजनन क्षमता के मानक को सुनिश्चित करने के लिए वाणिज्यिक गिनती मोतियों का उपयोग करने की मांग की। इसमें, हम बीजाणु गणना को परिष्कृत करने और बीजाणु सतह पर फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी की युग्मन दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए एफसी में सेल गिनती के लिए मोतियों की गिनती के उपयोग का सुझाव देते हैं।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, उपकरणों और सॉफ़्टवेयर से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. फ्लो साइटोमेट्री सेटिंग

  1. एक कंप्यूटर से युग्मित फ्लो साइटोमीटर के ऑप्टिकल मापदंडों का संरेखण
    1. साइटोमीटर सॉफ्टवेयर में लॉग इन करें।
    2. सॉफ़्टवेयर कार्यक्षेत्र से, चुनें साइटोमीटर | स्टार्टअप करें और कुछ मिनट प्रतीक्षा करें | स्वच्छ मोड | तरल पदार्थ बैठो।
      नोट: नमूना अधिग्रहण से पहले, साइटोमीटर दीक्षा प्रक्रिया के दौरान हवा के बुलबुले और अवरोधों को हटा दिया गया था।
  2. गुणवत्ता नियंत्रण
    1. फोटोमल्टीप्लायर ट्यूबों के वोल्टेज को समायोजित करने और उनकी संवेदनशीलता का मूल्यांकन करने के लिए गुणवत्ता नियंत्रण अभिकर्मक का उपयोग करें।
      1. एक पॉलीस्टाइनिन ट्यूब में गुणवत्ता नियंत्रण अभिकर्मक तैयार करें।
      2. आधार रेखा को परिभाषित करने के लिए, कमजोर पड़ने के 0.5 एमएल (10 मिमी फ़िल्टर्ड पीबीएस, पीएच 7) और लेबल ट्यूब के लिए मोतियों की 3 बूंदों को जोड़कर निलंबन मोती तैयार करें।
      3. कोमल उलटा द्वारा मनका शीशी मिलाएं.
    2. सॉफ़्टवेयर कार्यक्षेत्र से, चुनें साइटोमीटर | CST को CST इंटरफ़ेस से कनेक्ट करने के लिए। कुछ मिनट प्रतीक्षा करें और संदेश साइटोमीटर डिस्कनेक्ट निरीक्षण करें।
    3. फ्लो साइटोमीटर जांच के लिए गुणवत्ता नियंत्रण अभिकर्मक युक्त पॉलीस्टाइनिन ट्यूब संलग्न करें।
  3. साइटोमीटर के विन्यास का सत्यापन
    1. सिस्टम सारांश विंडो में, जांच लें कि साइटोमीटर कॉन्फ़िगरेशन प्रयोग के लिए उपयुक्त है।
    2. सेटअप मोती बैच आईडी का चयन करें सत्यापित करने के लिए इसी कि सेटअप मोती बहुत आईडी चयनित सीएस के वर्तमान लॉट से मेल खाता है&T अनुसंधान मोती.
  4. प्रदर्शन की जाँच
    1. विकल्प का चयन करें प्रदर्शन की जाँच करें और चलाएँ पर क्लिक करें।
    2. प्रदर्शन जांच पूरी होने पर, प्रदर्शन परिणाम प्रदर्शित किए जाएंगे। साइटोमीटर प्रदर्शन रिपोर्ट देखें। या तो प्रदर्शन जाँच को पूरा करने के लिए समाप्त क्लिक करें या साइटोमीटर से ट्यूब निकालें और सिस्टम सारांश विंडो में परिणामों की समीक्षा करें।
    3. मॉर्फोमेट्रिक और प्रतिदीप्ति संवेदनशीलता विश्लेषण के अंतिम परिणाम का निरीक्षण करें जो इसमें दिखाई देगा | सिस्टम सारांश| साइटोमीटर प्रदर्शन परिणाम | स्थिति के साथ: PASS

2. बीजाणुओं की तैयारी

  1. स्पोरुलेशन के बाद, 10 मिनट के लिए 17,949 ×ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा अल्ट्राप्योर बर्फ-ठंडे पानी के साथ बीजाणुओं को 3x कुल्ला।
  2. अल्ट्राप्योर पानी के 10 एमएल के साथ अंतिम सेंट्रीफ्यूजेशन से प्राप्त गोली को फिर से निलंबित करें।
  3. वनस्पति कोशिकाओं की निष्क्रियता के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए बीजाणुओं को आटोक्लेव करें।
    नोट: विभिन्न निष्क्रियता विधियों की तुलना में हमारे समूह द्वारा किए गए पिछले परीक्षणों ने प्रदर्शित किया कि चरण 2.3 में उल्लिखित शर्तों ने उच्च दक्षता प्रस्तुत की, एलबी अगर माध्यम पर चढ़ाना विश्लेषण विधि में कोई कॉलोनी गठन नहीं दिखाया।

3. फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके ऑटोक्लेव्ड बीजाणुओं की मात्रा का ठहराव

  1. आटोक्लेव्ड बीजाणुओं के 50 माइक्रोन लें और उन्हें 30 मिनट(चित्रा 1ए)के लिए 0.05% वी/वी के कमजोर पड़ने वाले कारक पर एथिडियम ब्रोमाइड (ईटीबीआर, 10 मिलीग्राम/एमएल पानी में पतला) के साथ प्रकाश से सुरक्षित करें।
  2. 10 मिनट के लिए 17,949 × ग्राम पर centrifugation द्वारा 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के साथ बीजाणुओं 3x धो लें और 1x पीबीएस में फिर से निलंबित करें।
  3. कमजोर पड़ने के लिए निर्माता की सिफारिशों के बाद, मोतियों के 10 माइक्रोन जोड़ें।
  4. चरण 4 में वर्णित प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके नमूने का विश्लेषण करें।
    नोट: यह मोती के रूप में संभव के रूप में सजातीय पाइपेट किया जाना चाहिए क्योंकि इस कदम को अच्छी तरह से निष्पादित नहीं किया गया था जब गणना में असमानताओं मनाया गया था पर जोर देना महत्वपूर्ण है.

4. प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके विश्लेषण

  1. साइटोमीटर सॉफ्टवेयर में लॉग इन करें।
  2. सॉफ़्टवेयर कार्यक्षेत्र से, चुनें साइटोमीटर | स्वच्छ मोड | तरल पदार्थ बैठो।
  3. प्रवाह साइटोमेट्री में विश्लेषण निर्धारित करने के लिए कार्यक्षेत्र में समायोजित करें।
    1. विश्लेषण (चित्रा 2) के लिए फाटकों को परिभाषित करें।
      1. नकारात्मक नियंत्रण (अचिह्नित बीजाणुओं) के आधार पर कणों की मॉर्फोमेट्रिक और प्रतिदीप्ति विशेषताओं के आधार पर गेटिंग रणनीति को परिभाषित करें।
    2. सेल मॉर्फोमेट्री निर्धारित करने के लिए, x-अक्ष पर FSC-A पैरामीटर और y-अक्ष पर SSC-A के विश्लेषण के लिए डॉटप्लॉट ग्राफ़िक चुनें।
    3. प्रतिदीप्ति निर्धारित करने के लिए, x-अक्ष पर FL5 का उपयोग करके y-अक्ष पर FL3 डॉटप्लॉट प्लॉट चुनें और चार चतुर्थांशों में द्वार बनाएं।
  4. एक 12 x 75 मिमी stoppered polystyrene ट्यूब unlabeled नमूने युक्त का प्रयोग करें, पहले एकल रंग EtBr, एकल-रंग APC, और बहुरंगा EtBr + APC के साथ लेबल.
  5. ट्यूब को बहुत धीरे से नकारात्मक नियंत्रण युक्त मिलाएं और इसे प्रवाह साइटोमीटर जांच में संलग्न करें।
  6. एक्वायर पर क्लिक करें।
  7. साइटोमीटर पर नेविगेट करके लेज़रों की शक्ति सेट करें | पैरामीटर | एफएससी (375) और एसएससी (275)।
  8. थ्रेशोल्ड को (500) साइटोमीटर पर सेट करें | दहलीज।
  9. ऑटोफ्लोरेसेंस को हटाने के लिए, केवल बीजाणुओं वाले डाई मुक्त नमूने का विश्लेषण करें।
  10. फिल्टर डिटेक्टरों के लिए वोल्टेज समायोजित करें: FL3 (603) और FL5 (538) नियंत्रणों में चुने हुए प्रतिदीप्ति के संबंध में नकारात्मक और सकारात्मक आबादी में भेदभाव करने के लिए। साइटोमीटर | पैरामीटर।
  11. साइटोमीटर | मुआवजा | FL5/FL3 सेटअप ऑफ़सेट को 1.0 पर सेट करें।
  12. आकृति विज्ञान और फ्लोरोसेंट विश्लेषण के बाद, अधिग्रहण 30,000 घटनाओं के लिए डिवाइस को कॉन्फ़िगर करें | प्रयोग | प्रयोग लेआउट | अधिग्रहण |30,000 घटनाएँ ....
  13. मापदंडों को समायोजित करने के बाद, लेबल किए गए नमूनों के लिए डेटा प्राप्त करें और प्रवाह साइटोमीटर में मोती होते हैं।
  14. समीकरण (1) का उपयोग करके निर्माता के निर्देशों द्वारा वर्णित बीजाणु एकाग्रता की गणना करें।
    Equation 1(1)
    नोट: इस अध्ययन के लिए, मनका परिमाणीकरण विधि पेट्रोफ-हौसर गिनती कक्ष विश्लेषण की तुलना में किया गया था। इसके अलावा, ऑटोक्लेव्ड बीजाणुओं के लेबलिंग की तुलना गैर-ऑटोक्लेव्ड बीजाणुओं के लेबलिंग से की गई थी।

5. प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके एक बीजाणु सतह पर प्रोटीन युग्मन सूचकांक का अनुमान

  1. बीजाणुओं के 50 माइक्रोन (103 / μL) 17,949 × ग्राम के 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा फसल और फिर, 1-एथिल-3- (3-डाइमिथाइलैमिनोप्रोपाइल) कार्बोडाइमाइड (ईडीसी) (300 मिमी)) के 25 माइक्रोन के साथ फिर से निलंबित करें।
  2. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं.
  3. बीजाणु निलंबन में एन-हाइड्रॉक्सीसल्फोसुकिनिमाइड (एनएचएस) (50 मिमी) के 25 माइक्रोन जोड़ें और इसे 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  4. चरण 5.1 में वर्णित के रूप में centrifugation द्वारा 1x पीबीएस के साथ बीजाणुओं 3x धो लें.
  5. फ्लोरोसेंट प्रोटीन जोड़ें और 15 डिग्री सेल्सियस पर रात भर नमूने छोड़ दें।
    नोट: इस काम में इस्तेमाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन एक एपीसी लेबल विरोधी मानव आईएल -10 एंटीबॉडी था. इस एंटीबॉडी का उपयोग अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में किया गया था, हालांकि अन्य फ्लोरोसेंट अणुओं का अनुप्रयोग संभव है क्योंकि ईडीसी / एनएचएस बीजाणु सतह पर प्रोटीन में मौजूद -सीओओएच और -एनएच2 समूहों के बीच एक सहसंयोजक बंधाव को बढ़ावा देता है।
  6. चरण 5.3 के अनुसार बीजाणुओं को धो लें।
  7. 1:50 पर पतला एथिडियम ब्रोमाइड के 10 मिलीग्राम/एमएल जोड़ें, फिर बर्फ पर 1 घंटे के लिए छोड़ दें और प्रकाश(चित्रा 1बी)से संरक्षित।
  8. चरण 5.3 के अनुसार बीजाणुओं को धो लें।
  9. चरण 4 को दोहराएँ।
  10. प्रतिदीप्ति निर्धारित करने के लिए, एक्स अक्ष पर पैरामीटर FL3 और डॉटप्लॉट के Y अक्ष पर FL5 बदलें।
  11. FL3 (670 LP फिल्टर) पर नीले लेजर (488 एनएम) और FL5 (660/20 फिल्टर) में लाल लेजर (633 एनएम) के साथ एक प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग कर नमूना का विश्लेषण करें, के रूप में चरण 4 में वर्णित है.
    नोट: एक ही नमूने एक खुर्दबीन के तहत स्लाइड पर immunofluorescence के लिए विश्लेषण किया गया, 1,000 एक्स की एक बढ़ाई रेंज पर, और निम्नलिखित फिल्टर का उपयोग कर: FITC 480/30 एनएम (हरा) और TRITC 540/25 एनएम (लाल).

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Representative Results

ऑटोक्लेव्ड बीजाणु (एएस) नमूनों में, क्रमशः गिनती मोतियों और पेट्रोफ-हॉसर विधि का उपयोग करके 2 × 103 बीजाणु/μl और 1 × 103 बीजाणु/μl का पता लगाया गया था(चित्र 2)।

Figure 1
चित्रा 1: बीजाणुओं की मात्रा का ठहराव की सामान्य योजना। (ए) EtBr और (B) डबल-लेबल वाले बीजाणुओं के साथ लेबल किए गए बीजाणु। संक्षिप्ताक्षर: ईडीसी = 1-एथिल-3- (3-डाइमिथाइलैमिनोप्रोपाइल) कार्बोडाइमाइड; एनएचएस = एन-हाइड्रॉक्सीसल्फोसुकिनिमाइड। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके बैसिलस सबटिलिस बीजाणु और गिनती मोतियों का मॉर्फोमेट्रिक और गुणात्मक विश्लेषण। गिनती मोतियों (undiluted नमूना) का उपयोग कर बी subtillis बीजाणुओं की मात्रा का ठहराव. संक्षिप्ताक्षर: FSC-A = आगे बिखराव-शिखर क्षेत्र; SSC-A = साइड स्कैटर-पीक क्षेत्र। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

ऑटोक्लेव्ड बीजाणु (एएस) नमूनों के एथिडियम ब्रोमाइड (ईटीबीआर) धुंधला होने से गैर-ऑटोक्लेव्ड बीजाणुओं (एनएएस) के धुंधला होने की तुलना में उच्च औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) दिखाई दी, इस प्रकार पहली स्थिति में आनुवंशिक सामग्री के अधिक धुंधला होने का संकेत मिलता है। इसके अलावा, एनएएस आबादी (चित्रा 3, लाल रंग में चोटी और काले रंग में शिखर) की तुलना में ईटीबीआर-लेबल एएस जनसंख्या में एक बड़ा एमएफआई देखा गया था। नियंत्रण नमूना, EtBr के साथ लेबल नहीं, महत्वपूर्ण प्रतिदीप्ति (चित्रा 3, बिंदीदार चोटी) नहीं दिखाया.

Figure 3
चित्रा 3: एथिडियम ब्रोमाइड-लेबल, ऑटोक्लेव, और गैर-ऑटोक्लेव्ड बेसिलस सबटिलिस बीजाणुओं का हिस्टोग्राम। लाल-NAS EtBr लेबलिंग में शिखर; ब्लैक-एएस ईटीबीआर लेबलिंग में शिखर; EtBr लेबलिंग के बिना बिंदीदार पीक-कंट्रोल। संक्षिप्ताक्षर: EtBr = एथिडियम ब्रोमाइड; NAS = गैर-ऑटोक्लेव्ड बीजाणु; AS = ऑटोक्लेव्ड बीजाणु। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

इन प्रयोगों में, एपीसी-लेबल एंटी-ह्यूमन आईएल-10 एंटीबॉडी के साथ एएस सतह युग्मन पर एमएफआई ने एनएएस(चित्रा 4)की तुलना में अधिक युग्मन दक्षता दिखाई। इस कारण से, डबल लेबल प्रयोगों के रूप में के साथ प्रदर्शन किया गया. प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण में चार बीजाणु आबादी की पहचान की गई: ईटीबीआर + / ईटीबीआर+/एफए-; ईटीबीआर-/एफए+; ईटीबीआर-/एफए-। आणविक मार्कर EtBr के लिए पारगम्य बीजाणुओं की उपस्थिति कुल आबादी में अंकुरित बीजाणुओं की संभावित उपस्थिति को इंगित करती है। यह प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (जिसके द्वारा यह EtBr/फ्लोरोसेंट विरोधी माउस तालिका 8 लेबलिंग और दोनों फ्लोरोफोर्स व्यक्तिगत रूप से, चित्रा 5 का निरीक्षण करने के लिए संभव था का उपयोग नमूना के विश्लेषण के बाद मनाया जा सकता है). Wirtz-Conklin धुंधला विधि का उपयोग करने से सैफ्रानिन के लिए पारगम्यता के साथ बीजाणुओं के अस्तित्व के दृश्य की अनुमति मिली (गुलाबी, पूरक चित्रा S1 में दाग)। इसी विश्लेषण में, केवल मैलाकाइट हरे रंग के साथ दाग बीजाणुओं मनाया गया, अभेद्यता का संकेत, के रूप में निष्क्रिय बीजाणुओं13 के लिए साहित्य में सूचना दी. चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा बीजाणु विश्लेषण एनएएस (पूरक चित्रा एस 2)14की तुलना में एएस नमूने में निष्क्रिय बीजाणुओं की एक उच्च संख्या प्रस्तुत करता है।

Figure 4
चित्रा 4: ऑटोक्लेव्ड और गैर-ऑटोक्लेव्ड बीजाणुओं में एपीसी-लेबल वाले एंटी-ह्यूमन आईएल -10 एंटीबॉडी की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता। संक्षिप्ताक्षर: एफए = फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी; एपीसी = एलोफाइकोसायनिन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: EtBr और फ्लोरोसेंट एंटी-माउस के साथ लेबल किए गए बीजाणुओं की इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग। (ए) ईटीबीआर (लाल) के साथ चिह्नित आनुवंशिक सामग्री के साथ बीजाणु। (बी) फ्लोरोसेंट एंटी-माउस (हरा) के साथ लेबल की गई सतह के साथ बीजाणु। (सी) डबल-लेबल बीजाणु, EtBr और फ्लोरोसेंट एंटी-माउस (नारंगी) के साथ। स्केल बार = 10 माइक्रोन। संक्षिप्ताक्षर: EtBr = एथिडियम ब्रोमाइड। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

यहां किए गए प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण ने अंकुरित बीजाणुओं (ईटीबीआर + / एफए +) की तुलना में एफए के युग्मन के उच्च प्रतिशत को निष्क्रिय बीजाणुओं (ईटीबीआर / एफए +) का संकेत दिया। चित्रा 6 ए, बी में दिखाए गए ग्राफ में, युग्मित बीजाणुओं और एमएफआई के प्रतिशत में वृद्धि देखी जा सकती है क्योंकि एफए की एकाग्रता बढ़ जाती है। इसके अलावा, इन बीजाणुओं की आबादी जो फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EtBr+/FA- और EtBr-/FA-) के साथ नहीं जुड़ी, FA (पूरक तालिका S1) की एकाग्रता में वृद्धि के साथ क्रमिक कमी दिखाई दी।

Figure 6
चित्रा 6: प्रतिदीप्ति युग्मन प्रतिशत विश्लेषण और ईटीबीआर / एफए + और ईटीबीआर + / एफए- आबादी की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता। (ए) एक्स-अक्ष एफए की विभिन्न सांद्रता का प्रतिनिधित्व करता है, काला वाई-अक्ष पता लगाए गए एमएफआई का प्रतिनिधित्व करता है, और लाल वाई-अक्ष ईटीबीआर - / एफए + आबादी से एफए-लेबल बीजाणुओं के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है। (बी) एक्स-अक्ष एफए की विभिन्न सांद्रता का प्रतिनिधित्व करता है, काला वाई-अक्ष पता लगाए गए एमएफआई का प्रतिनिधित्व करता है, और लाल वाई-अक्ष ईटीबीआर+/एफए + आबादी से ईटीबीआर-लेबल वाले बीजाणुओं और एफए के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है। संक्षिप्ताक्षर: एमएफआई = मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता; EtBr = एथिडियम ब्रोमाइड; एफए = फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा एस 1: ऑटोक्लेव्ड बी सबटिलिस बीजाणुओं की माइक्रोस्कोपी छवि विर्ट्ज़-कोंक्लिन पद्धति द्वारा दाग दी गई। गुलाबी रंग के बीजाणु अंकुरित बीजाणु (सफ्रानिन के लिए पारगम्य) होते हैं। हरे रंग में निष्क्रिय बीजाणु (सफ्रानिन के लिए अभेद्य) होते हैं। स्केल बार = 10 माइक्रोन. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा एस 2: ऑटोक्लेव्ड और गैर-ऑटोक्लेव्ड बी सबटिलिस बीजाणुओं की चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी छवियों की तुलना। (ए, बी) "आटोक्लेव उपचार से पहले और बाद में बी सबटिलिस बीजाणुओं की छवियां". कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका एस 1: फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी और एथिडियम ब्रोमाइड के साथ चिह्नित बीजाणुओं के प्रतिशत के मूल्य, विभिन्न एफए सांद्रता में, प्रवाह साइटोमेट्री में मनाया जाता है। संक्षिप्ताक्षर: EtBr = एथिडियम ब्रोमाइड; एफए = फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

कालोनियों की प्लेट गिनती जैसे पारंपरिक तरीके, न केवल समय लेने वाली हैं, बल्कि व्यवहार्य कोशिकाओं की भी आवश्यकता होती है और निष्क्रिय बीजाणुओं की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति नहीं देते हैं5. पेट्रोफ-हॉसर कक्ष एक वैकल्पिक पद्धति है, लेकिन इसे करने के लिए एक अनुभवी माइक्रोस्कोपिस्ट की आवश्यकता होती है। फ्लो साइटोमेट्री इस उद्देश्य के लिए एक उपयोगी विकल्प साबित हुआ है।

जेनोविस एट अल 12 ने दो न्यूक्लिक एसिड मार्करों और उपयोग किए गए उपकरणों की प्रवाह दर (मात्रा / मिनट) की उच्च नियंत्रण क्षमता का उपयोग करके बैसिलस एसपी के व्यवहार्य कोशिकाओं और बीजाणुओं की मात्रा का ठहराव के लिए प्रवाह साइटोमेट्री के उपयोग का वर्णन किया, जो संख्यात्मक मात्रा निर्धारित करने का विकल्प प्रदान करता है। सभी साइटोमेट्री उपकरणों का प्रवाह दर (मात्रा/मिनट) पर सख्त नियंत्रण नहीं होता है, और कुछ केवल न्यूनतम, मध्यम और अधिकतम विकल्पों में समायोज्य होते हैं। इन मामलों में, मोतियों की गिनती अन्य प्रवाह साइटोमेट्री उपकरण के खिलाफ सेल गणना और प्रजनन क्षमता की सटीकता सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस पद्धति के माध्यम से, इस अध्ययन में, नमूनों में प्रति मिलीलीटर बीजाणुओं (अंकुरित और निष्क्रिय) की संख्या की गणना करना संभव था।

बीजाणुओं की आबादी की गणना और विश्लेषण गॉडफ्रे और अलशरीफ के पेटेंट10 में वर्णित मापदंडों के अनुसार किया गया था। ये लेखक बीजाणु की स्थिति का वर्णन किए बिना और उच्च लागत वाले वाणिज्यिक डीएनए मार्करों 11,12,13का उपयोग किए बिना बैसिलस एसपीपी के अंकुरण चरणों के विश्लेषण के लिए इस पद्धति के उपयोग का वर्णन करते हैं। यहां वर्णित कार्य में, एएस का उपयोग करके, ईटीबीआर का उपयोग करके बीजाणुओं (निष्क्रिय और अंकुरित) की दो आबादी की पहचान करना संभव था, जो व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला और आसानी से सुलभ मार्कर है। बीजाणु अवस्था की पहचान EtBr के अंकुरित बीजाणुओं की पारगम्यता के कारण संभव थी। यह उजागर करना महत्वपूर्ण है कि EtBr के साथ लेबल नहीं किए गए बीजाणुओं की आबादी एक ही नमूने में समान आकार की कलाकृतियों को प्रस्तुत कर सकती है। इस सीमा को उपयोग किए गए बफ़र्स को धोने और फ़िल्टर करके कम किया जा सकता है।

यहां वर्णित एफए के साथ युग्मित ईटीबीआर-लेबल वाले एएस नमूनों के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण ने फ्लोरोसेंट प्रोटीन युग्मन (एफपीसी) की योग्यता और मात्रा का ठहराव के लिए भी अनुमति दी। फ्लोरोसेंटली लेबल और युग्मित नमूनों का विश्लेषण प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के नुकसान से बचने के लिए तुरंत किया जाना चाहिए। इसके अलावा, यह अनुमान लगाना संभव था कि क्या बीजाणु जनसंख्या आकृति विज्ञान और एकाग्रता संयुग्मन प्रक्रिया से प्रभावित थे, प्रक्रिया की समग्र समझ देते हुए, जो डॉट-ब्लॉट विधि का उपयोग करते समय प्राप्त नहीं होती है। Isticato et al.15 ने बीजाणु सतह पर FPC का भी विश्लेषण किया और युग्मन के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन के प्रकार के आधार पर, इम्यूनोफ्लोरेसेंस और फ्लो साइटोमेट्री के साथ इसकी पुष्टि करके इसकी व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया। इसमें, यह देखा गया कि एएस11 का उपयोग युग्मन के लिए बेहतर है क्योंकि ऑटोक्लेविंग प्रक्रिया प्रोटीज की निष्क्रियता के लिए महत्वपूर्ण है जो प्रोटीन को युग्मित करने के लिए नीचा दिखा सकती है। यह इंगित करना महत्वपूर्ण है कि यहां वर्णित तकनीकों को केवल बी का उपयोग करके किया गया था। सबटिलिस KO7 तनाव, अन्य उपभेदों में आवेदन के साथ अभी भी परीक्षण किया जाना है।

साहित्य में ऐसी कोई रिपोर्ट नहीं है जो बीजाणुओं की युग्मन क्षमता की तुलना उनके चरण के अनुसार करती है। यहाँ प्रस्तुत प्रयोगों में, एफए के साथ युग्मित निष्क्रिय बीजाणुओं का एक उच्च प्रतिशत (ईटीबीआर / एफए +)16मनाया गया था. इसके विपरीत, अंकुरित बीजाणुओं (EtBr+/FA+), उनके कम प्रतिशत के बावजूद, निष्क्रिय बीजाणुओं में जो देखा गया था, उसकी तुलना में अधिक MFI दिखाया गया। अन्य बेसिलस एसपीपी में एफए (संतृप्ति बिंदु) की उच्च सांद्रता के लिए इस व्यवहार का मूल्यांकन करने के लिए आगे के अध्ययन किए जाने की आवश्यकता है।

भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए, यहां प्रस्तुत विधि का उपयोग बी सबटिलिस बीजाणुओं के उपयोग पर अध्ययन में एक टीका सहायक के रूप में किया जा सकता है, जो शुरू में प्रतिदीप्ति द्वारा लेबल किए गए लक्ष्य प्रतिजन के युग्मन का मूल्यांकन करता है। संतृप्त एकाग्रता का निर्धारण करने के बाद, पता चला मूल्य टीकाकरण में उपयोग के लिए लक्ष्य प्रतिजन पर लागू किया जा सकता है।

इस प्रकार, यह पत्र अंकुरित और निष्क्रिय बीजाणुओं की गणना और प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके बैसिलस सबटिलिस बीजाणुओं के फ्लोरोसेंट प्रोटीन युग्मन के विश्लेषण के लिए एक व्यावहारिक और संवेदनशील विधि प्रस्तुत करता है। EtBr बीजाणु लेबलिंग के अलावा, परिमाणीकरण के लिए एक पैरामीटर के रूप में मोतियों की गिनती का उपयोग, अंकुरित बीजाणुओं की एक परिष्कृत गिनती और फ्लोरोसेंट प्रोटीन युग्मन के प्रतिशत निर्धारण की अनुमति देता है। इस पद्धति को उन अध्ययनों के विकास में मदद करनी चाहिए जो एक सहायक के रूप में बीजाणुओं के उपयोग पर ध्यान केंद्रित करते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001 द्वारा वित्तपोषित किया गया था; Governo do Estado do Amazonas Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM के संसाधनों के साथ; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). लेखक अपनी सुविधाओं के उपयोग के लिए स्वास्थ्य PDTIS-FIOCRUZ के लिए उपकरण में तकनीकी विकास के लिए कार्यक्रम का धन्यवाद करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(N-hydroxysuccinimide) (NHS) Sigma 130672
Anti-human fluorescent antibody BioLegend 501410 APC anti-human IL-10
Anti-mouse fluorescent antibody Thermo Scientific A32723 Alexa Fluor Plus 488
BD FACSCanto II  BD Flow cytometer
BD FACSDiva Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva software v 6.x) BD 642412 Quality control reagent
BD FACSDiva Software v. 6.1.3 BD 643629 Software
Centrifuge MegaFuge 8R Thermo Scientific 75007213
Counting Beads BD 340334 TruCount Tubes
Eclipse 80i Nikon Fluorescent Microsope
Ethidium Bromide Ludwig Biotec
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich A4503
Plastic Microtubes Eppendorf
Polystyrene tube Falcon 352008 5 mL polystyrene tube, 12 x 75 mm, without lid, non-sterile

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References

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जैव रसायन अंक 196 फ्लो साइटोमेट्री एंटीजन का पता लगाना बीजाणुओं की मात्रा का ठहराव फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी मोतियों की गिनती एथिडियम ब्रोमाइड एलोफिकोसायनिन-लेबल एंटीबॉडी डीएनए मार्कर सतह मार्कर फ्लो साइटोमीटर मात्रा का ठहराव की सटीकता
फ्लो साइटोमेट्री में <em>बैसिलस सबटिलिस</em> बीजाणु गणना और लेबल विश्लेषण में सुधार
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Alves, K. C., Chaves, Y. O.,… More

Alves, K. C., Chaves, Y. O., Almeida, M. E., Vasconcelos, M. G., Nogueira, P. A., Melo, J., Marques, J., Zuliani, J. P., Boeno, C. N., Paloschi, M. V., Isticato, R., Ricca, E., Mariúba, L. A. Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (196), e65141, doi:10.3791/65141 (2023).

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