Summary
Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Verwendung von Durchflusszytometrie und Zählperlen zur Quantifizierung von Bakteriensporen, die mit Ethidiumbromid markiert sind. Die Methode ist auch effizient, um die kovalente Kopplung von Proteinen auf der Oberfläche intakter Sporen zu analysieren.
Abstract
Die Sporen von Bacillus subtilis wurden bereits für verschiedene biotechnologische und immunologische Anwendungen vorgeschlagen; Es besteht jedoch ein zunehmender Bedarf an der Entwicklung von Methoden, die den Nachweis von Antigenen, die auf der Oberfläche von Sporen immobilisiert sind, sowie deren Quantifizierung verbessern. Auf Durchflusszytometrie basierende Analysen wurden bereits als schnelle, zuverlässige und spezifische Ansätze zum Nachweis markierter Zellen von B. subtilis vorgeschlagen. In dieser Arbeit schlagen wir die Verwendung der Durchflusszytometrie vor, um die Anzeigeeffizienz eines fluoreszierenden Antikörpers (FA) auf der Oberfläche der Spore zu bewerten und die Anzahl der Sporen mit Hilfe von Zählkügelchen zu quantifizieren.
Dazu verwendeten wir Ethidiumbromid als DNA-Marker und einen Allophycocyanin (APC)-markierten Antikörper, der an die Sporen gekoppelt war, als Oberflächenmarker. Die Quantifizierung der Sporen wurde mit Hilfe von Zählkügelchen durchgeführt, da diese Technik eine hohe Genauigkeit bei der Detektion von Zellen aufweist. Die markierten Sporen wurden mit einem Durchflusszytometer analysiert, was die Kopplung bestätigte. Als Ergebnis konnte gezeigt werden, dass die DNA-Markierung die Genauigkeit der Quantifizierung mittels Durchflusszytometrie für den Nachweis von gekeimten Sporen verbessert. Es wurde beobachtet, dass Ethidiumbromid nicht in der Lage war, ruhende Sporen zu markieren; Diese Technik ermöglicht jedoch eine genauere Bestimmung der Anzahl der Sporen mit fluoreszierendem Protein, die an ihre Oberfläche gekoppelt sind, und hilft so bei der Entwicklung von Studien, die sich auf die Verwendung von Sporen als biotechnologische Plattform in verschiedenen Anwendungen konzentrieren.
Introduction
Bacillus subtilis ist ein stäbchenförmiges, grampositives Bakterium, das in der Lage ist, ruhende Sporen zu produzieren, wenn die Umweltbedingungen kein Zellwachstum zulassen1. Sporen sind extrem stabile Zellformen, und die Sporen mehrerer Arten, einschließlich B. subtilis, werden häufig als Probiotika für den menschlichen und tierischen Gebrauch verwendet2. Aufgrund ihrer Resistenz- und Sicherheitseigenschaften wurde die Spore von B. subtilis, die heterologe Proteine aufweist, als Schleimhautadjuvans, als Impfstoffverabreichungssystem und als Enzymimmobilisierungsplattform vorgeschlagen 3,4.
Um Sporen von B. subtilis zu erhalten, ist es notwendig, sie mit einem speziellen Nährmedium einem Nährstoffentzug auszusetzen. Nach der Gewinnung und Reinigung dieser Sporen müssen sie quantifiziert werden, um die Testeffizienz zu verbessern 5,6. Daher werden bestimmte Methoden angewendet, um die Konzentration der erhaltenen Sporen zu analysieren. Es kann eine Plattenzählung und eine Petroff-Hausser-Kammer, auch Zählkammer genannt, verwendet werden. Letzteres wurde ursprünglich entwickelt, um die Konzentration von Blutzellen zu bestimmen; Es ist jedoch möglich, es im Bereich der Mikrobiologie für die Sporenzählung zu verwenden 7,8. Obwohl es sich um die Standardmethode für die Zellzählung handelt, ist das Ablesen mühsam, da diese Methode vollständig manuell ist und ihre Genauigkeit von der Erfahrung des Bedieners abhängt.
Durchflusszytometrie-basierte (FC) Analysen wurden bereits als schnelle, zuverlässige und spezifische Ansätze zum Nachweis markierter Zellen von Bacillus spp. vorgeschlagen. Die Verwendung von Durchflusszytometrie-Zählkügelchen hat die Reproduzierbarkeit bei der Zellzählung bei Routineuntersuchungen (absolute Zählung von CD4- und CD8-T-Lymphozyten) und bei der Entwicklung von Forschungsarbeiten mit Partikeln gewährleistet, die mit der Durchflusszytometrie nachgewiesen und gezählt werden können9. Godjafrey und Alsharif schlugen die Verwendung von Zählkügelchen zur FC-Quantifizierung von unmarkierten Sporen vor10. Der Einsatz der Durchflusszytometrie zur Überwachung der Sporulation bei Bacillus spp. durch Markierung der Sporen-DNA 10,11,12,13. In einer weiteren Studie wurde FC verwendet, um die Menge an fluoreszenzmarkierten Proteinen auf der Sporenoberfläche zu bewerten15.
Ziel dieser Studie war es, kommerzielle Zählkügelchen zu verwenden, um einen Standard der Reproduzierbarkeit in Bezug auf die Ereigniszählung mittels Durchflusszytometrie zu gewährleisten. In dieser Arbeit schlagen wir die Verwendung von Zählkügelchen für die Zellzählung in FC vor, um die Sporenzählung zu verfeinern und die Kopplungseffizienz von fluoreszenzmarkierten Antikörpern auf der Sporenoberfläche zu bewerten.
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Protocol
In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Instrumenten und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden.
1. Einstellung der Durchflusszytometrie
- Abgleich der optischen Parameter des an einen Computer gekoppelten Durchflusszytometers
- Melden Sie sich bei der Cytometer-Software an.
- Wählen Sie im Arbeitsbereich der Software die Option Zytometer | Starten und einige Minuten warten | Sauberer Modus | Flüssigkeiten im Sitzen zu sich nehmen.
HINWEIS: Luftblasen und Verstopfungen wurden während des Zytometer-Initiierungsprozesses vor der Probenaufnahme entfernt.
- Qualitätskontrolle
- Verwenden Sie das Reagenz zur Qualitätskontrolle, um die Spannungen der Photomultiplier-Röhren einzustellen und ihre Empfindlichkeit zu bewerten.
- Bereiten Sie das Reagenz für die Qualitätskontrolle in einem Styroporröhrchen vor.
- Um den Ausgangswert zu definieren, bereiten Sie die Suspensionskügelchen vor, indem Sie 0,5 ml Verdünnungsmittel (10 mM gefiltertes PBS, pH 7) und 3 Tropfen Kügelchen in das markierte Röhrchen geben.
- Mischen Sie die Durchstechflasche durch vorsichtige Umkehrung.
- Wählen Sie im Arbeitsbereich der Software die Option Zytometer | CST , um eine Verbindung zur CST-Schnittstelle herzustellen. Warten Sie einige Minuten und beobachten Sie, wie das Zytometer getrennt ist.
- Befestigen Sie das Polystyrolröhrchen mit dem Reagenz für die Qualitätskontrolle an der Durchflusszytometersonde.
- Verwenden Sie das Reagenz zur Qualitätskontrolle, um die Spannungen der Photomultiplier-Röhren einzustellen und ihre Empfindlichkeit zu bewerten.
- Überprüfung der Konfiguration des Zytometers
- Überprüfen Sie im Fenster Systemübersicht , ob die Zytometerkonfiguration für das Experiment geeignet ist.
- Wählen Sie die entsprechende Chargen-ID für Setup-Perlen aus, um zu überprüfen, ob die ausgewählte Chargen-ID der Setup-Perlen mit der aktuellen Charge der CS&T-Forschungsperlen übereinstimmt.
- Leistungsprüfung
- Wählen Sie die Option Leistung überprüfen und klicken Sie auf Ausführen.
- Nach Abschluss der Leistungsprüfung werden die Leistungsergebnisse angezeigt. Sehen Sie sich den Zytometer-Leistungsbericht an. Klicken Sie entweder auf Fertig stellen , um die Leistungsprüfung abzuschließen, oder entfernen Sie das Röhrchen aus dem Zytometer und überprüfen Sie die Ergebnisse im Fenster Systemübersicht .
- Beobachten Sie das Endergebnis der morphometrischen und Fluoreszenzsensitivitätsanalyse, das in der | Systemzusammenfassung| Zytometerleistungsergebnis | mit dem Status BESTANDEN angezeigt wird
2. Vorbereitung der Sporen
- Nach der Sporulation die Sporen 3x mit hochreinem eiskaltem Wasser durch Zentrifugation bei 17.949 × g für 10 min abspülen.
- Resuspendieren Sie das bei der letzten Zentrifugation erhaltene Pellet mit 10 ml Reinstwasser.
- Autoklavieren Sie die Sporen 45 Minuten lang bei 121 ºC, um die vegetativen Zellen zu inaktivieren.
ANMERKUNG: Frühere Tests, die von unserer Gruppe durchgeführt wurden, bei denen verschiedene Inaktivierungsmethoden verglichen wurden, zeigten, dass die in Schritt 2.3 genannten Bedingungen eine hohe Effizienz aufwiesen und keine Koloniebildung in der Plattierungsanalysemethode auf dem LB-Agar-Medium zeigten.
3. Quantifizierung autoklavierter Sporen mittels Durchflusszytometrie
- Nehmen Sie 50 μl autoklavierte Sporen und inkubieren Sie sie lichtgeschützt mit Ethidiumbromid (EtBr, 10 mg/ml in Wasser verdünnt) bei einem Verdünnungsfaktor von 0,05 % v/v für 30 Minuten (Abbildung 1A).
- Waschen Sie die Sporen 3x mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch Zentrifugation bei 17.949 × g für 10 min und resuspendieren Sie in 1x PBS.
- Fügen Sie 10 μl Kügelchen hinzu und befolgen Sie dabei die Verdünnungsempfehlungen des Herstellers.
- Analysieren Sie die Probe mit einem Durchflusszytometer, wie in Schritt 4 beschrieben.
HINWEIS: Es ist wichtig zu betonen, dass die Kügelchen so homogen wie möglich pipettiert werden sollten, da bei den Berechnungen Unterschiede beobachtet wurden, wenn dieser Schritt nicht gut ausgeführt wurde.
4. Analyse mittels Durchflusszytometrie
- Melden Sie sich bei der Cytometer-Software an.
- Wählen Sie im Arbeitsbereich der Software die Option Zytometer | Sauberer Modus | Flüssigkeiten im Sitzen zu sich nehmen.
- Passen Sie den Arbeitsbereich an, um die Analyse in der Durchflusszytometrie zu bestimmen.
- Definieren Sie die Gates für die Analysen (Abbildung 2).
- Definieren Sie die Gating-Strategie basierend auf den morphometrischen und Fluoreszenzeigenschaften der Partikel auf der Grundlage der Negativkontrolle (unmarkierte Sporen).
- Um die Zellmorphometrie zu bestimmen, wählen Sie Dotplot-Grafik für Analysen der FSC-A-Parameter auf der x-Achse und SSC-A auf der y-Achse.
- Um die Fluoreszenz zu bestimmen, wählen Sie FL3 Dotplot-Diagramme auf der y-Achse mit FL5 auf der x-Achse und erstellen Sie die Gates in vier Quadranten.
- Definieren Sie die Gates für die Analysen (Abbildung 2).
- Verwenden Sie ein 12 x 75 mm Polystyrolröhrchen mit Stopfen und unmarkierten Proben, die zuvor mit einfarbigem EtBr, einfarbigem APC und mehrfarbigem EtBr+ APC gekennzeichnet waren.
- Mischen Sie das Röhrchen mit der Negativkontrolle sehr vorsichtig und befestigen Sie es an der Durchflusszytometersonde.
- Klicken Sie auf Erwerben.
- Stellen Sie die Leistung der Laser ein, indem Sie zu Zytometer | Parameter | FSC (375) und SSC (275).
- Stellen Sie den Schwellenwert auf (500) ein Zytometer | Schwellenwert.
- Um die Autofluoreszenz zu entfernen, analysieren Sie die farbstofffreie Probe, die nur Sporen enthält.
- Passen Sie die Spannungen für die Filterdetektoren FL3 (603) und FL5 (538) an, um negative und positive Populationen in Bezug auf die gewählte Fluoreszenz in den Kontrollen zu unterscheiden. Zytometer | Parameter.
- Zytometer | Schadenersatz | Stellen Sie den FL5/FL3-Setup-Offset auf 1,0 ein.
- Konfigurieren Sie das Gerät nach der Morphometrie und Fluoreszenzanalyse für die Erfassung von 30.000 Ereignissen | Experimentieren | Versuchsanordnung | Akquisition |30.000 Veranstaltungen....
- Nachdem Sie die Parameter angepasst haben, erfassen Sie Daten für die Proben, die markiert sind und Kügelchen im Durchflusszytometer enthalten.
- Berechnen Sie die Sporenkonzentration gemäß den Anweisungen des Herstellers anhand von Gleichung (1).
(1)
ANMERKUNG: Für diese Studie wurde die Methode zur Quantifizierung der Kügelchen mit der Petroff-Hausser-Zählkammeranalyse verglichen. Darüber hinaus wurde die Markierung von autoklavierten Sporen mit der Markierung von nicht autoklavierten Sporen verglichen.
(1)5. Abschätzung des Proteinkopplungsindex auf einer Sporenoberfläche mittels Durchflusszytometrie
- Ernte durch Zentrifugieren von 50 μl Sporen (103/μl) 17.949 × g für 10 min und dann Resuspendierung mit 25 μl 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) (300 mM)).
- 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
- 25 μl N-Hydroxysulfosuccinimid (NHS) (50 mM) zur Sporensuspension geben und bei Raumtemperatur 30 min inkubieren.
- Waschen Sie die Sporen 3x mit 1x PBS durch Zentrifugieren, wie in Schritt 5.1 beschrieben.
- Fügen Sie fluoreszierendes Protein hinzu und lassen Sie die Proben über Nacht bei 15 °C stehen.
HINWEIS: Das fluoreszierende Protein, das in dieser Arbeit verwendet wurde, war ein APC-markierter Anti-Human-IL-10-Antikörper. Dieser Antikörper wurde als Modell für die Studie verwendet, obwohl die Anwendung anderer fluoreszierender Moleküle möglich ist, da EDC/NHS eine kovalente Ligation zwischen -COOH- und -NH2-Gruppen fördern, die in Proteinen auf der Sporenoberfläche vorhanden sind. - Waschen Sie die Sporen gemäß Schritt 5.3.
- 10 mg/ml Ethidiumbromid in einer Verdünnung von 1:50 zugeben und 1 Stunde auf Eis und vor Licht geschützt stehen lassen (Abbildung 1B).
- Waschen Sie die Sporen gemäß Schritt 5.3.
- Wiederholen Sie Schritt 4.
- Um die Fluoreszenz zu bestimmen, ändern Sie die Parameter FL3 auf der X-Achse und FL5 auf der Y-Achse des Punktdiagramms.
- Analysieren Sie die Probe mit einem Durchflusszytometer mit dem blauen Laser (488 nm) bei FL3 (670 LP-Filter) und dem roten Laser (633 nm) bei FL5 (660/20-Filter), wie in Schritt 4 beschrieben.
HINWEIS: Dieselben Proben wurden auf Objektträgern unter einem Mikroskop bei einem Vergrößerungsbereich von 1.000-fach und mit den folgenden Filtern auf Immunfluoreszenz analysiert: FITC 480/30 nm (grün) und TRITC 540/25 nm (rot).
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Representative Results
In autoklavierten Sporenproben (AS) wurden 2 × 103 Sporen/μl und 1 × 103 Sporen/μl mit Hilfe von Zählkügelchen bzw. der Petroff-Hausser-Methode nachgewiesen (Abbildung 2).
Abbildung 1: Allgemeines Schema zur Quantifizierung von Sporen. (A) Sporen, die mit EtBr markiert sind, und (B) doppelt markierte Sporen. Abkürzungen: EDC = 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid; NHS = N-Hydroxysulfosuccinimid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Morphometrische und qualitative Analyse von Bacillus subtilis-Sporen und Zählkügelchen mittels Durchflusszytometrie. Quantifizierung von B. subtillis-Sporen mittels Zählperlen (unverdünnte Probe). Abkürzungen: FSC-A = Vorwärts-Scatter-Peak-Fläche; SSC-A = seitliche Streupeakfläche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die Ethidiumbromid (EtBr)-Färbung von autoklavierten Sporen (AS)-Proben zeigte eine höhere mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) als die Färbung von nicht autoklavierten Sporen (NAS), was auf eine stärkere Färbung des genetischen Materials in der ersten Bedingung hindeutet. Darüber hinaus wurde in der EtBr-markierten AS-Population ein größerer MFI beobachtet als in der NAS-Population (Abbildung 3, Peak in Rot und Peak in Schwarz). Die Kontrollprobe, die nicht mit EtBr markiert war, zeigte keine signifikante Fluoreszenz (Abbildung 3, gepunkteter Peak).
Abbildung 3: Histogramm von Ethidiumbromid-markierten, autoklavierten und nicht autoklavierten Bacillus subtillis-Sporen . Peak bei der Red-NAS-EtBr-Kennzeichnung; Peak in der Black-AS-EtBr-Markierung; gepunktete Peak-Kontrolle ohne EtBr-Markierung. Abkürzungen: EtBr = Ethidiumbromid; NAS = nicht autoklavierte Sporen; AS = autoklavierte Sporen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
In diesen Experimenten zeigte MFI auf der AS-Oberflächenkopplung mit APC-markiertem Anti-Human-IL-10-Antikörper im Vergleich zu NAS eine höhere Kopplungseffizienz (Abbildung 4). Aus diesem Grund wurden die doppelmarkierten Experimente mit AS durchgeführt. In der durchflusszytometrischen Analyse wurden vier Sporenpopulationen identifiziert: EtBr+/FA+; EtBr+/FA-; EtBr-/FA+; EtBr-/FA-. Das Vorhandensein von Sporen, die für den molekularen Marker EtBr durchlässig sind, weist auf das mögliche Vorhandensein von gekeimten Sporen in der Gesamtpopulation hin. Dies konnte nach der Analyse der Probe mittels Fluoreszenzmikroskopie beobachtet werden (mit der es möglich war, die EtBr/Fluoreszenz-Anti-Maus-Tabelle 8-Markierung und beide Fluorophore einzeln zu beobachten, Abbildung 5). Mit der Wirtz-Conklin-Färbemethode konnte das Vorhandensein von Sporen mit Permeabilität für Safranin (rosa gefärbt, Ergänzende Abbildung S1) sichtbar gemacht werden. In derselben Analyse wurden Sporen beobachtet, die nur mit Malachitgrün gefärbt waren, was auf eine Undurchlässigkeit hindeutet, wie in der Literatur für ruhende Sporen berichtetwird 13. Die Sporenanalyse mittels Phasenkontrastmikroskopie zeigt im Vergleich zur NAS eine höhere Anzahl ruhender Sporen in der AS-Probe (Ergänzende Abbildung S2)14.
Abbildung 4: Mittlere Fluoreszenzintensität von APC-markierten antihumanen IL-10-Antikörpern in autoklavierten und nicht autoklavierten Sporen. Abkürzungen: FA = fluoreszierender Antikörper; APC =Allophycocyanin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Immunfluoreszenz-Bildgebung von Sporen, die mit EtBr und fluoreszierender Anti-Maus markiert sind. (A) Sporen mit genetischem Material, das mit EtBr markiert ist (rot). (B) Sporen mit einer Oberfläche, die mit fluoreszierendem Anti-Maus-Mittel (grün) markiert ist. (C) Doppelt markierte Sporen mit EtBr und fluoreszierendem Anti-Maus-Polymer (orange). Maßstabsbalken = 10 μm. Abkürzungen: EtBr = Ethidiumbromid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die hier durchgeführten durchflusszytometrischen Analysen zeigten einen höheren Prozentsatz der Kopplung des FA an die ruhenden Sporen (EtBr-/FA+) im Vergleich zu gekeimten Sporen (EtBr+/FA+). In der in Abbildung 6A,B gezeigten Grafik kann der Anstieg des Prozentsatzes von gekoppelten Sporen und MFI beobachtet werden, wenn die Konzentration von FA zunimmt. Darüber hinaus zeigten die Populationen dieser Sporen, die nicht mit dem fluoreszierenden Protein koppelten (EtBr+/FA- und EtBr-/FA-), eine allmähliche Reduktion mit zunehmender FA-Konzentration (Ergänzungstabelle S1).
Abbildung 6: Analyse des Fluoreszenzkopplungsprozentsatzes und der mittleren Fluoreszenzintensität von EtBr-/FA+- und EtBr+/FA-Populationen. (A) Die x-Achse stellt die verschiedenen Konzentrationen des FA dar, die schwarze y-Achse den detektierten MFI und die rote y-Achse den Prozentsatz der FA-markierten Sporen aus der EtBr - /FA+-Population. (B) Die x-Achse stellt die verschiedenen FA-Konzentrationen dar, die schwarze y-Achse den nachgewiesenen MFI und die rote y-Achse den Prozentsatz der EtBr+/FA+-Population der EtBr+/FA+-Population. Abkürzungen: MFI = mittlere Fluoreszenzintensität; EtBr = Ethidiumbromid; FA = fluoreszierender Antikörper. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung S1: Mikroskopische Aufnahme von autoklavierten B. subtilis-Sporen , gefärbt mit der Wirtz-Conklin-Methode. Rosa gefärbte Sporen sind gekeimte Sporen (durchlässig für Safranin). In Grün befinden sich ruhende Sporen (undurchlässig für Safranin). Maßstabsleiste = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S2: Vergleich von Phasenkontrastmikroskopie-Aufnahmen von autoklavierten und nicht autoklavierten B. subtilis-Sporen . (A,B) Bilder von B. subtilis-Sporen vor und nach der Autoklavenbehandlung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle S1: Werte des Prozentsatzes der Sporen, die mit fluoreszierenden Antikörpern und Ethidiumbromid markiert sind oder nicht, in unterschiedlichen FA-Konzentrationen, beobachtet in der Durchflusszytometrie. Abkürzungen: EtBr = Ethidiumbromid; FA = fluoreszierender Antikörper. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Herkömmliche Methoden, wie z.B. die Plattenzählung von Kolonien, sind nicht nur zeitaufwändig, sondern benötigen auch lebensfähige Zellen und erlauben keine Quantifizierung von inaktivierten Sporen5. Die Petroff-Hausser-Kammer ist eine alternative Methode, aber sie erfordert einen erfahrenen Mikroskopiker, um sie durchzuführen. Die Durchflusszytometrie hat sich hierfür als sinnvolle Alternative erwiesen.
Genovese et al.12 beschrieben die Verwendung der Durchflusszytometrie zur Quantifizierung lebensfähiger Zellen und Sporen von Bacillus sp. unter Verwendung von zwei Nukleinsäuremarkern und einer hohen Kontrollkapazität der Flussrate (Volumen/Minute) der verwendeten Geräte, die die Möglichkeit bietet, die zu konfigurierende numerische Menge zu bestimmen. Nicht alle Zytometriegeräte haben eine strikte Kontrolle über die Durchflussrate (Volumen/Minuten), und einige sind nur in den Optionen Minimum, Mittel und Maximum einstellbar. In diesen Fällen können Zählkügelchen verwendet werden, um die Genauigkeit der Zellzählung und Reproduzierbarkeit gegenüber anderen Durchflusszytometriegeräten sicherzustellen. Mit dieser Methode war es in dieser Studie möglich, die Anzahl der Sporen (gekeimt und ruhend) pro Milliliter in den Proben zu berechnen.
Die Sporenpopulation wurde nach den in Godfrey und Alsharifs Patent10 beschriebenen Parametern gezählt und analysiert. Diese Autoren beschreiben die Verwendung dieser Methodik für die Analyse der Keimstadien von Bacillus spp., ohne den Zustand der Spore zu beschreiben und teure kommerzielle DNA-Marker zu verwenden 11,12,13. In der hier beschriebenen Arbeit war es möglich, mit Hilfe von AS zwei Populationen von Sporen (ruhende und gekeimte) mit Hilfe von EtBr, einem weit verbreiteten und leicht zugänglichen Marker, zu identifizieren. Die Identifizierung des Sporenzustandes war aufgrund der Permeabilität der gekeimten Sporen für das EtBr möglich. Es ist wichtig zu betonen, dass die Population von Sporen, die nicht mit EtBr markiert sind, Artefakte ähnlicher Größe in derselben Probe aufweisen kann. Diese Einschränkung kann durch Waschen und Filtern der verwendeten Puffer gemildert werden.
Die hier beschriebene durchflusszytometrische Analyse von EtBr-markierten AS-Proben in Verbindung mit FA ermöglichte auch die Qualifizierung und Quantifizierung der fluoreszierenden Proteinkopplung (FPC). Die Analyse von fluoreszenzmarkierten und gekoppelten Proben sollte sofort durchgeführt werden, um einen Verlust der Fluoreszenzemission zu vermeiden. Darüber hinaus konnte abgeleitet werden, ob die Morphologie und Konzentration der Sporenpopulation durch das Konjugationsverfahren beeinflusst wurde, was zu einem Gesamtverständnis des Prozesses führte, das bei der Verwendung der Dot-Blot-Methode nicht erreicht wird. Isticato et al.15 analysierten FPC auch auf der Sporenoberfläche und demonstrierten seine Lebensfähigkeit, indem sie es mit Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie bestätigten, abhängig von der Art des Proteins, das für die Kopplung verwendet wird. Hierin wurde beobachtet, dass die Verwendung von AS11 für die Kopplung bevorzugt ist, da der Autoklavierprozess für die Inaktivierung von Proteasen wichtig ist, die das zu koppelnde Protein abbauen können. Es ist wichtig darauf hinzuweisen, dass die hier beschriebenen Techniken nur mit dem Stamm B. subtilis KO7 durchgeführt wurden, wobei die Anwendung in anderen Stämmen noch getestet werden muss.
In der Literatur gibt es keine Berichte, die die Kopplungsfähigkeit von Sporen nach ihrem Stadium vergleichen. In den hier vorgestellten Experimenten wurde ein höherer Prozentsatz an ruhenden Sporen in Verbindung mit FA beobachtet (EtBr-/FA+)16. Im Gegensatz dazu zeigten gekeimte Sporen (EtBr+/FA+) trotz ihres geringeren Anteils einen höheren MFI als die ruhenden Sporen. Weitere Studien müssen durchgeführt werden, um dieses Verhalten für höhere Konzentrationen von FA (Sättigungspunkt) in anderen Bacillus spp. zu bewerten.
Für zukünftige Anwendungen könnte die hier vorgestellte Methode in Studien zur Verwendung von B. subtilis-Sporen als Impfstoff-Adjuvans verwendet werden, um die Kopplung eines Zielantigens zu evaluieren, das zunächst durch Fluoreszenz markiert wurde. Nach der Bestimmung der Sättigungskonzentration kann der detektierte Wert auf das Zielantigen für die Verwendung in Immunisierungen angewendet werden.
Daher wird in dieser Arbeit eine praktische und sensitive Methode zur Zählung von gekeimten und ruhenden Sporen und zur Analyse der fluoreszierenden Proteinkopplung von Bacillus subtilis-Sporen mittels Durchflusszytometrie vorgestellt. Die Verwendung von Zählkügelchen als Parameter für die Quantifizierung ermöglicht neben der EtBr-Sporenmarkierung eine verfeinerte Zählung der gekeimten Sporen und die prozentuale Bestimmung der fluoreszierenden Proteinkopplung. Diese Methode soll bei der Entwicklung von Studien helfen, die sich auf die Verwendung von Sporen als Adjuvans konzentrieren.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Studie wurde zum Teil durch den Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001 finanziert; Governo do Estado do Amazonas mit Mitteln der Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Die Autoren danken dem Programm für die technologische Entwicklung von Instrumenten für die Gesundheit PDTIS-FIOCRUZ für die Nutzung seiner Einrichtungen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (N-hydroxysuccinimide) (NHS) | Sigma | 130672 | |
| Anti-human fluorescent antibody | BioLegend | 501410 | APC anti-human IL-10 |
| Anti-mouse fluorescent antibody | Thermo Scientific | A32723 | Alexa Fluor Plus 488 |
| BD FACSCanto II | BD | Flow cytometer | |
| BD FACSDiva Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva software v 6.x) | BD | 642412 | Quality control reagent |
| BD FACSDiva Software v. 6.1.3 | BD | 643629 | Software |
| Centrifuge MegaFuge 8R | Thermo Scientific | 75007213 | |
| Counting Beads | BD | 340334 | TruCount Tubes |
| Eclipse 80i | Nikon | Fluorescent Microsope | |
| Ethidium Bromide | Ludwig Biotec | ||
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Plastic Microtubes | Eppendorf | ||
| Polystyrene tube | Falcon | 352008 | 5 mL polystyrene tube, 12 x 75 mm, without lid, non-sterile |
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