Summary
Este protocolo enfoca o uso de citometria de fluxo e contagem de esferas para quantificar esporos bacterianos marcados com brometo de etídio. O método também é eficiente para analisar o acoplamento covalente de proteínas na superfície de esporos intactos.
Abstract
Os esporos de Bacillus subtilis já foram propostos para diferentes aplicações biotecnológicas e imunológicas; No entanto, há uma necessidade crescente para o desenvolvimento de metodologias que melhorem a detecção de antígenos imobilizados na superfície de esporos juntamente com sua quantificação. Análises baseadas em citometria de fluxo têm sido previamente propostas como abordagens rápidas, confiáveis e específicas para a detecção de células marcadas de B. subtilis. Neste trabalho, propomos o uso da citometria de fluxo para avaliar a eficiência de exibição de um anticorpo fluorescente (AG) na superfície do esporo e quantificar o número de esporos usando esferas de contagem.
Para isso, utilizamos brometo de etídio como marcador de DNA e um anticorpo marcado com aloficocianina (APC), que foi acoplado aos esporos, como marcador de superfície. A quantificação dos esporos foi realizada por meio da contagem de contas, uma vez que esta técnica demonstra alta acurácia na detecção das células. Os esporos marcados foram analisados por citômetro de fluxo, que confirmou o acoplamento. Como resultado, demonstrou-se que a marcação de DNA melhorou a precisão da quantificação por citometria de fluxo, para a detecção de esporos germinados. Observou-se que o brometo de etídio não foi capaz de marcar esporos dormentes; No entanto, esta técnica fornece uma determinação mais precisa do número de esporos com proteína fluorescente acoplada à sua superfície, auxiliando assim no desenvolvimento de estudos que enfoquem o uso de esporos como plataforma biotecnológica em diferentes aplicações.
Introduction
Bacillus subtilis é uma bactéria gram-positiva, em forma de bastonete, capaz de produzir esporos quiescentes quando as condições ambientais não permitem o crescimento celular1. Os esporos são formas celulares extremamente estáveis e os de várias espécies, incluindo B. subtilis, são amplamente utilizados como probióticos para uso humano e animal2. Devido às suas propriedades de resistência e segurança, o esporo de B. subtilis, que apresenta proteínas heterólogas, tem sido proposto como adjuvante da mucosa, sistema de liberação vacinal e plataforma enzimática 3,4.
Para obter esporos de B. subtilis, é necessário expô-lo à privação de nutrientes usando um meio de cultura especial. Após a obtenção e purificação desses esporos, deve-se quantificá-los para melhorar a eficiência do teste 5,6. Assim, alguns métodos são aplicados para analisar a concentração dos esporos obtidos. A contagem de placas e uma câmara de Petroff-Hausser, também conhecida como câmara de contagem, podem ser usadas. Este último foi originalmente desenvolvido para determinar a concentração de células sanguíneas; entretanto, é possível utilizá-lo no campo da microbiologia para contagem deesporos7,8. Apesar de ser o método padrão utilizado para contagem celular, a leitura é trabalhosa, pois este método é totalmente manual e sua precisão depende da experiência do operador.
Análises baseadas em citometria de fluxo (FC) têm sido previamente propostas como abordagens rápidas, confiáveis e específicas para a detecção de células marcadas de Bacillus spp. O uso de esferas de contagem por citometria de fluxo tem garantido reprodutibilidade na contagem celular em exames de rotina (contagem absoluta de linfócitos T CD4 e CD8) e no desenvolvimento de pesquisas envolvendo partículas passíveis de serem detectadas e contadas por citometria defluxo9. Godjafrey e Alsharif sugeriram o uso de contas de contagem para quantificação de CF de esporos não marcados10. O uso da citometria de fluxo foi descrito para o monitoramento da esporulação em Bacillus spp. através da marcação do DNA dos esporos 10,11,12,13. Outro estudo utilizou a CF para avaliar a quantidade de proteínas marcadas fluorescentemente na superfície dos esporos15.
Este estudo buscou utilizar esferas de contagem comerciais para garantir um padrão de reprodutibilidade em relação à contagem de eventos por citometria de fluxo. Neste trabalho, sugerimos o uso de esferas de contagem para contagem de células em FC para refinar a enumeração de esporos e avaliar a eficiência de acoplamento de anticorpos marcados fluorescentemente na superfície dos esporos.
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Protocol
Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, instrumentos e software usados neste protocolo.
1. Configuração da citometria de fluxo
- Alinhamento dos parâmetros ópticos do citômetro de fluxo acoplado a um computador
- Faça login no software Cytometer.
- No espaço de trabalho do software, selecione Citômetro | Inicie e aguarde alguns minutos | Modo de limpeza | Sente-se fluidos.
OBS: Bolhas de ar e obstruções foram removidas durante o processo de início do citômetro, antes da aquisição da amostra.
- Controle de qualidade
- Use o reagente de controle de qualidade para ajustar as tensões dos tubos fotomultiplicadores e avaliar sua sensibilidade.
- Prepare o reagente de controle de qualidade em um tubo de poliestireno.
- Para definir a linha de base, prepare as esferas de suspensão adicionando 0,5 mL de diluente (PBS filtrado 10 mM, pH 7) e 3 gotas de esferas ao tubo marcado.
- Misture o frasco para injetáveis de contas por inversão suave.
- No espaço de trabalho do software, selecione Citômetro | CST para se conectar à interface CST. Aguarde alguns minutos e observe o citômetro de mensagem desconectado.
- Conecte o tubo de poliestireno contendo o reagente de controle de qualidade à sonda do citômetro de fluxo.
- Use o reagente de controle de qualidade para ajustar as tensões dos tubos fotomultiplicadores e avaliar sua sensibilidade.
- Verificação da configuração do citômetro
- Na janela Resumo do sistema , verifique se a configuração do citômetro é apropriada para o experimento.
- Selecione o ID do lote de contas de configuração correspondente para verificar se o ID do lote de contas de configuração selecionado corresponde ao lote atual de contas de pesquisa CS&T.
- Verificação de desempenho
- Selecione a opção Verificar desempenho e clique em Executar.
- Após a conclusão da verificação de desempenho, os resultados de desempenho serão exibidos. Veja o Relatório de Desempenho do Citômetro. Clique em Concluir para concluir a verificação de desempenho ou remova o tubo do citômetro e revise os resultados na janela Resumo do sistema .
- Observe o resultado final da análise morfométrica e de sensibilidade à fluorescência que aparecerá no | resumo do sistema| resultado do desempenho do citômetro | com o status: APROVADO
2. Preparação dos esporos
- Após a esporulação, enxaguar os esporos 3x com água gelada ultrapura por centrifugação a 17.949 × g por 10 min.
- Ressuspender o pellet obtido da última centrifugação com 10 mL de água ultrapura.
- Autoclave os esporos por 45 min a 121 ºC para inativação das células vegetativas.
OBS: Testes anteriores realizados por nosso grupo comparando diferentes métodos de inativação demonstraram que as condições citadas na etapa 2.3 apresentaram alta eficiência, não apresentando formação de colônias no método de análise de plaqueamento em meio ágar LB.
3. Quantificação de esporos autoclavados por citometria de fluxo
- Tomar 50 μL de esporos autoclavados e incubá-los protegidos da luz com brometo de etídio (EtBr, 10 mg/mL diluído em água) a um fator de diluição de 0,05% v/v por 30 min (Figura 1A).
- Lavar os esporos 3x com 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) por centrifugação a 17.949 × g por 10 min e ressuspender em 1x PBS.
- Adicionar 10 μL de contas, seguindo as recomendações do fabricante para diluição.
- Analise a amostra usando um citômetro de fluxo conforme descrito na etapa 4.
OBS: É importante ressaltar que as contas devem ser pipetadas da forma mais homogênea possível, pois foram observadas disparidades nos cálculos quando esta etapa não foi bem executada.
4. Análise por citometria de fluxo
- Faça login no software Cytometer.
- No espaço de trabalho do software, selecione Citômetro | Modo de limpeza | Sente-se fluidos.
- Ajuste ao espaço de trabalho para determinar a análise em citometria de fluxo.
- Defina as portas para as análises (Figura 2).
- Definir a estratégia de gating com base nas características morfométricas e de fluorescência das partículas com base no controle negativo (esporos não marcados).
- Para determinar a morfometria celular, escolha o gráfico Dotplot para análises dos parâmetros FSC-A no eixo x e SSC-A no eixo y.
- Para determinar a fluorescência, escolha gráficos de plotagem de pontos FL3 no eixo y usando FL5 no eixo x e crie as portas em quatro quadrantes.
- Defina as portas para as análises (Figura 2).
- Use um tubo de poliestireno com tampa de 12 x 75 mm contendo amostras não rotuladas, previamente rotuladas com EtBr, APC de cor única e APC EtBr+ multicolorido.
- Misture o tubo muito suavemente contendo o controle negativo e fixe-o à sonda do citômetro de fluxo.
- Clique em Adquirir.
- Defina a potência dos lasers navegando até o Citômetro | Parâmetros | FSC (375) e SSC (275).
- Defina o limite para (500) Citômetro | Limite.
- Para remover a autofluorescência, analise a amostra livre de corantes contendo apenas esporos.
- Ajustar as tensões dos detectores de filtro: FL3 (603) e FL5 (538) para discriminar populações negativas e positivas em relação à fluorescência escolhida nos controles. Citômetro | Parâmetros.
- Citômetro | Remuneração | Defina o deslocamento de configuração FL5/FL3 para 1.0.
- Após morfometria e análise fluorescente, configure o dispositivo para Aquisição de 30.000 eventos | Experiência | Layout do experimento | Aquisição |30.000 eventos....
- Após o ajuste dos parâmetros, adquira dados para as amostras que são rotuladas e contêm contas no citômetro de fluxo.
- Calcular a concentração de esporos conforme descrito pelas instruções do fabricante utilizando a equação (1).
(1º)
NOTA: Para este estudo, o método de quantificação de cordões foi comparado com a análise da câmara de contagem de Petroff-Hausser. Além disso, a marcação de esporos autoclavados foi comparada com a marcação de esporos não autoclavados.
(1º)5. Estimativa do índice de acoplamento de proteínas na superfície de esporos por citometria de fluxo
- Colher por centrifugação de 50 μL de esporos (103/μL) 17.949 × g por 10 min e, em seguida, ressuspender com 25 μL de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) (300 mM)).
- Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente.
- Adicionar 25 μL de N-hidroxisulfosuccinimida (NHS) (50 mM) à suspensão de esporos e incubá-la à temperatura ambiente durante 30 min.
- Lavar os esporos 3x com 1x PBS por centrifugação conforme descrito no passo 5.1.
- Adicione a proteína fluorescente e deixe as amostras durante a noite a 15 °C.
NOTA: A proteína fluorescente utilizada neste trabalho foi um anticorpo anti-IL-10 humano marcado com APC. Este anticorpo foi utilizado como modelo para estudo, embora a aplicação de outras moléculas fluorescentes seja possível, uma vez que EDC/NHS promovem uma ligação covalente entre os grupos -COOH e -NH2 presentes nas proteínas na superfície dos esporos. - Lavar os esporos de acordo com o passo 5.3.
- Adicionar 10 mg/mL de brometo de etídio diluído a 1:50, deixar por 1 h no gelo e protegido da luz (Figura 1B).
- Lavar os esporos de acordo com o passo 5.3.
- Repita a etapa 4.
- Para determinar a fluorescência, altere os parâmetros FL3 no eixo X e FL5 no eixo Y do diagrama de pontos.
- Analisar a amostra utilizando um citômetro de fluxo com o laser azul (488 nm) em FL3 (filtro 670 LP) e o laser vermelho (633 nm) em FL5 (filtro 660/20), conforme descrito na etapa 4.
OBS: As mesmas amostras foram analisadas para imunofluorescência em lâminas ao microscópio, na faixa de aumento de 1.000 x, e utilizando-se os seguintes filtros: FITC 480/30 nm (verde) e TRITC 540/25 nm (vermelho).
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Representative Results
Em amostras de esporos autoclavados (AS), 2 × 103 esporos/μl e 1 ×10 3 esporos/μl foram detectados usando contagem de contas e o método de Petroff-Hausser, respectivamente (Figura 2).
Figura 1: Esquema geral de quantificação dos esporos. (A) Esporos marcados com EtBr e (B) esporos duplamente marcados. Abreviaturas: EDC = 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida; NHS = N-hidroxisulfosuccinimida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Análise morfométrica e qualitativa dos esporos de Bacillus subtilis e contagem de esferas por citometria de fluxo. Quantificação de esporos de B. subtillis utilizando contagem de esferas (amostra não diluída). Abreviações: FSC-A = área do pico de dispersão anterior; SSC-A = área do pico de dispersão lateral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A coloração com brometo de etídio (EtBr) em amostras de esporos autoclavados (AS) mostrou maior intensidade média de fluorescência (MFI) do que a coloração de esporos não autoclavados (NAS), indicando maior coloração de material genético na primeira condição. Além disso, um maior IFM foi observado na população marcada com EA marcada com EtBr do que na população com NAS (Figura 3, pico em vermelho e pico em preto). A amostra controle, não marcada com EtBr, não apresentou fluorescência significativa (Figura 3, pico pontilhado).
Figura 3: Histograma de esporos de Bacillus subtillis marcados com brometo de etídio, autoclavados e não autoclavados. Pico na marcação EtBr do NAS vermelho; pico na marcação EtBr preto-AS; controle de pico pontilhado sem marcação EtBr. Abreviações: EtBr = brometo de etídio; NAS = esporos não autoclavados; SA = esporos autoclavados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Nesses experimentos, o IFM no acoplamento de superfície do SA com o anticorpo anti-IL-10 humano marcado com APC mostrou maior eficiência de acoplamento quando comparado ao NAS (Figura 4). Por esta razão, os experimentos duplo-marcados foram realizados com EA. Quatro populações de esporos foram identificadas na análise por citometria de fluxo: EtBr+/FA+; EtBr+/FA-; EtBr-/FA+; EtBr-/FA-. A presença de esporos permeáveis ao marcador molecular EtBr indica a possível presença de esporos germinados na população total. Isso pôde ser observado após análise da amostra por microscopia de fluorescência (pela qual foi possível observar a marcação EtBr/Fluorescent Anti-mouse tabela 8 e ambos os fluoróforos individualmente, Figura 5). A utilização do método de coloração de Wirtz-Conklin permitiu visualizar a existência de esporos com permeabilidade à safranina (corada em rosa, Figura Suplementar S1). Nessa mesma análise, foram observados esporos corados apenas com verde de malaquita, indicando impermeabilidade, como relatado na literatura para esporosdormentes13. A análise de esporos por microscopia de contraste de fase apresenta maior número de esporos dormentes na amostra de EA quando comparada ao NAS (Figura Suplementar S2)14.
Figura 4: Intensidade média da fluorescência dos anticorpos anti-IL-10 humana marcados com APC em esporos autoclavados e não autoclavados. Abreviações: FA = anticorpo fluorescente; APC =aloficocianina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Imagem por imunofluorescência de esporos marcados com EtBr e anti-camundongo fluorescente. (A) Esporos com material genético marcado com EtBr (vermelho). (B) Esporos com superfície marcada com anti-camundongo fluorescente (verde). (C) Esporos duplamente marcados, com EtBr e anti-camundongo fluorescente (laranja). Barra de escala = 10 μm. Abreviações: EtBr = brometo de etídio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
As análises por citometria de fluxo realizadas indicaram maior porcentagem de acoplamento dos AG aos esporos dormentes (EtBr-/FA+) quando comparados aos esporos germinados (EtBr+/FA+). No gráfico apresentado na Figura 6A,B, o aumento da porcentagem de esporos acoplados e IFM pode ser observado à medida que a concentração de AF aumenta. Além disso, as populações desses esporos que não se acoplaram à proteína fluorescente (EtBr+/FA- e EtBr-/FA-) apresentaram redução gradual com o aumento da concentração de AG (Tabela Suplementar S1).
Figura 6: Análise da porcentagem de acoplamento de fluorescência e intensidade média de fluorescência das populações EtBr-/FA+ e EtBr+/FA-. (A) O eixo x representa as diferentes concentrações de AG, o eixo y preto representa a IFM detectada e o eixo y vermelho representa a porcentagem de esporos marcados com AG da população EtBr - /FA+. (B) O eixo x representa as diferentes concentrações de AG, o eixo y preto representa a IFM detectada e o eixo y vermelho representa a porcentagem de esporos marcados com EtBr, e AG da população EtBr+/FA+. Abreviações: MFI = intensidade média da fluorescência; EtBr = brometo de etídio; AF = anticorpo fluorescente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura Suplementar S1: Imagem microscópica de esporos autoclavados de B. subtilis corados pela metodologia de Wirtz-Conklin. Os esporos corados de rosa são esporos germinados (permeáveis à safranina). Em verde são esporos dormentes (impermeáveis à safranina). Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar S2: Comparação das imagens de microscopia de contraste de fase de esporos de B. subtilis autoclavados e não autoclavados. (A,B) Imagens de esporos de B. subtilis antes e após o tratamento em autoclave. Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela Suplementar S1: Valores das porcentagens de esporos marcados, ou não, com anticorpo fluorescente e brometo de etídio, em diferentes concentrações de AG, observados em citometria de fluxo. Abreviações: EtBr = brometo de etídio; AF = anticorpo fluorescente. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Métodos tradicionais, como a contagem em placas de colônias, não só são demorados, como também necessitam de células viáveis e não permitem a quantificação de esporos inativados5. A câmara de Petroff-Hausser é uma metodologia alternativa, mas requer um microscopista experiente para realizá-la. A citometria de fluxo tem se mostrado uma alternativa útil para esse fim.
Genovese et al.12 descreveram o uso da citometria de fluxo para a quantificação de células viáveis e esporos de Bacillus sp., utilizando dois marcadores de ácidos nucleicos e alta capacidade de controle do fluxo (volume/minuto) do equipamento utilizado, o que fornece a opção de determinar a quantidade numérica a ser configurada. Nem todos os equipamentos de citometria têm controle rigoroso sobre a taxa de fluxo (volume/minutos), e alguns são ajustáveis apenas nas opções mínima, média e máxima. Nesses casos, esferas de contagem podem ser usadas para garantir a precisão da enumeração celular e a reprodutibilidade em relação a outros equipamentos de citometria de fluxo. Por meio desse método, neste estudo, foi possível calcular o número de esporos (germinados e dormentes) por mililitro nas amostras.
A população de esporos foi enumerada e analisada de acordo com os parâmetros descritos na patente de Godfrey eAlsharif10. Esses autores descrevem o uso dessa metodologia para a análise dos estádios germinativos de Bacillus spp., sem descrever o estado do esporo e utilizando marcadores comerciais de DNA de alto custo11,12,13. No trabalho aqui descrito, utilizando EA, foi possível identificar duas populações de esporos (dormentes e germinados) utilizando EtBr, que é um marcador amplamente utilizado e de fácil acesso. A identificação do estado dos esporos foi possível devido à permeabilidade dos esporos germinados ao EtBr. É importante ressaltar que a população de esporos não marcados com EtBr pode apresentar artefatos de tamanho semelhante na mesma amostra. Essa limitação pode ser atenuada lavando e filtrando os buffers usados.
A análise por citometria de fluxo de amostras de EA marcadas com EtBr, juntamente com AG, aqui descrita, também permitiu a qualificação e quantificação do acoplamento de proteínas fluorescentes (FPC). A análise de amostras fluorescentemente marcadas e acopladas deve ser realizada imediatamente para evitar a perda de emissão de fluorescência. Além disso, foi possível inferir se a morfologia e a concentração da população de esporos foram afetadas pelo procedimento de conjugação, dando uma compreensão global do processo, o que não é obtido quando se utiliza o método dot-blot. Isticato et al.15 também analisaram a FPC na superfície dos esporos e demonstraram sua viabilidade confirmando-a por imunofluorescência e citometria de fluxo, dependendo do tipo de proteína utilizada para acoplamento. Neste trabalho, observou-se que o uso de AS11 é preferível para acoplamento, uma vez que o processo de autoclavagem é importante para a inativação de proteases que podem degradar a proteína a ser acoplada. É importante ressaltar que as técnicas aqui descritas foram realizadas utilizando apenas a cepa KO7 de B. subtilis , sendo a aplicação em outras cepas ainda a serem testadas.
Não há relatos na literatura que comparem a capacidade de acoplamento dos esporos de acordo com seu estágio. Nos experimentos aqui apresentados, observou-se maior porcentagem de esporos dormentes acoplados a AG (EtBr-/FA+)16. Em contraste, os esporos germinados (EtBr+/FA+), apesar de sua menor porcentagem, apresentaram maior IFM do que o observado nos esporos dormentes. Novos estudos precisam ser realizados para avaliar esse comportamento para maiores concentrações de AG (ponto de saturação) em outros Bacillus spp.
Para aplicações futuras, o método aqui apresentado poderá ser utilizado em estudos sobre o uso de esporos de B. subtilis como adjuvante vacinal, avaliando o acoplamento de um antígeno alvo inicialmente marcado por fluorescência. Após a determinação da concentração de saturação, o valor detectado pode ser aplicado ao antígeno alvo para uso em imunizações.
Assim, este trabalho apresenta um método prático e sensível para a enumeração de esporos germinados e dormentes e a análise do acoplamento de proteínas fluorescentes de esporos de Bacillus subtilis por citometria de fluxo. O uso de contas de contagem como parâmetro de quantificação, além da marcação de esporos EtBr, permite uma contagem refinada de esporos germinados e a determinação da porcentagem de acoplamento de proteínas fluorescentes. Esse método deve auxiliar no desenvolvimento de estudos que enfoquem o uso de esporos como adjuvante.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Este estudo foi financiado em parte pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Código 001; Governo do Estado do Amazonas com recursos da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Os autores agradecem ao Programa de Desenvolvimento Tecnológico em Ferramentas para a Saúde PDTIS-FIOCRUZ pela utilização de suas instalações.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (N-hydroxysuccinimide) (NHS) | Sigma | 130672 | |
| Anti-human fluorescent antibody | BioLegend | 501410 | APC anti-human IL-10 |
| Anti-mouse fluorescent antibody | Thermo Scientific | A32723 | Alexa Fluor Plus 488 |
| BD FACSCanto II | BD | Flow cytometer | |
| BD FACSDiva Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva software v 6.x) | BD | 642412 | Quality control reagent |
| BD FACSDiva Software v. 6.1.3 | BD | 643629 | Software |
| Centrifuge MegaFuge 8R | Thermo Scientific | 75007213 | |
| Counting Beads | BD | 340334 | TruCount Tubes |
| Eclipse 80i | Nikon | Fluorescent Microsope | |
| Ethidium Bromide | Ludwig Biotec | ||
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Plastic Microtubes | Eppendorf | ||
| Polystyrene tube | Falcon | 352008 | 5 mL polystyrene tube, 12 x 75 mm, without lid, non-sterile |
References
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