枯草芽孢杆菌孢子计数和标记分析在流式细胞术中的改进

Summary

该协议侧重于使用流式细胞术和计数珠来定量用溴化乙锭标记的细菌孢子。该方法还可用于分析完整孢子表面蛋白质的共价偶联。

Abstract

枯草芽孢杆菌的孢子已被提议用于不同的生物技术和免疫学应用;然而，越来越需要开发改进固定在孢子表面的抗原及其定量的方法。基于流式细胞术的分析以前已被提出作为检测枯草芽孢杆菌标记细胞的快速、可靠和特异性方法。在此，我们建议使用流式细胞术来评估荧光抗体（FA）在孢子表面的显示效率，并使用计数珠量化孢子的数量。

为此，我们使用溴化乙锭作为 DNA 标记物，并使用与孢子偶联的别藻蓝蛋白 （APC） 标记抗体作为表面标记物。孢子的定量是使用计数珠进行的，因为该技术在细胞检测方面表现出很高的准确性。使用流式细胞仪分析标记的孢子，证实了偶联。结果表明，DNA标记提高了流式细胞术定量的准确性，用于检测萌发的孢子。据观察，溴化乙锭不能标记休眠孢子;然而，该技术可以更精确地测定荧光蛋白与其表面偶联的孢子数量，从而有助于开展专注于在不同应用中使用孢子作为生物技术平台的研究。

Introduction

枯草芽孢杆菌是一种杆状革兰氏阳性细菌，当环境条件不允许细胞生长时，能够产生静止孢子¹。孢子是极其稳定的细胞形式，包括枯草芽孢杆菌在内的几种物种的孢子被广泛用作人类和动物使用的益生菌²。由于其抗性和安全性，枯草芽孢杆菌的孢子显示异源蛋白，已被提议作为粘膜佐剂、疫苗递送系统和酶固定平台 ^3,4。

为了从枯草芽孢杆菌中获得孢子，有必要使用特殊的培养基将其暴露在营养剥夺中。在获得并纯化这些孢子后，必须对其进行定量以提高测试效率 ^5,6。因此，应用某些方法来分析所获得的孢子的浓度。可以使用平板计数和 Petroff-Hausser 室（也称为计数室）。后者最初是为了确定血细胞的浓度而开发的;但是，可以在微生物学领域将其用于孢子计数^7,8。尽管是用于细胞计数的标准方法，但读取是费力的，因为这种方法完全是手动的，其准确性取决于操作员的经验。

基于流式细胞术 （FC） 的分析先前已被提议作为检测 芽孢杆菌属标记细胞的快速、可靠和特异性方法。使用流式细胞术计数珠保证了常规检查（CD4 和 CD8 T 淋巴细胞的绝对计数）中细胞计数的可重复性，以及涉及能够使用流式细胞术检测和计数的颗粒的研究的发展⁹。Godjafrey 和 Alsharif 建议使用计数珠子对未标记的孢子进行 FC 定量¹⁰。描述了使用流式细胞术监测 芽孢杆菌属 的孢子形成。通过标记孢子^{DNA 10、11、12、13}。另一项研究使用 FC 来评估孢子表面荧光标记蛋白质的数量¹⁵。

本研究试图使用商业计数微球来确保使用流式细胞术进行事件计数的可重复性标准。在此，我们建议在FC中使用计数珠进行细胞计数，以优化孢子计数并评估荧光标记抗体在孢子表面的偶联效率。

Protocol

有关本协议中使用的所有材料、仪器和软件的详细信息，请参阅 材料表 。

1. 流式细胞术设置

1. 与计算机耦合的流式细胞仪光学参数的对准
   1. 登录到流式细胞仪软件。
   2. 在软件工作区中，选择 “流式细胞仪”|”启动 并等待几分钟 |清洁模式 |静置液体。
      注意：在样品采集之前，在细胞仪启动过程中去除气泡和障碍物。
2. 质量管理
   1. 使用质控试剂调整光电倍增管的电压并评估其灵敏度。
      1. 在聚苯乙烯管中制备质量控制试剂。
      2. 为了确定基线，通过向标记的试管中加入 0.5 mL 稀释剂（10 mM 过滤的 PBS，pH 7）和 3 滴珠来制备悬浮珠。
      3. 通过轻轻倒置混合珠子瓶。
   2. 在软件工作区中，选择 “流式细胞仪”|”CST 连接到 CST 接口。等待几分钟，观察 消息 cytometer 断开连接。
   3. 将装有质控试剂的聚苯乙烯管连接到流式细胞仪探头。
3. 验证流式细胞仪的配置
   1. 在 “系统摘要” 窗口中，检查流式细胞仪配置是否适合实验。
   2. 选择相应的设置微球批次 ID，以验证所选的预设微球批次 ID 是否与当前批次的 CS&T 研究微球匹配。
4. 性能检查
   1. 选择“ 检查性能 ”选项，然后单击 “运行”。
   2. 完成性能检查后，将显示性能结果。查看 流式细胞仪性能报告。单击 “完成 ”以完成性能检查，或从流式细胞仪中取出试管并在“ 系统摘要 ”窗口中查看结果。
   3. 观察形态学和荧光灵敏度分析的最终结果，该结果将出现在 | 系统摘要| 流式细胞仪性能结果| 状态为：PASSED

2. 孢子的制备

1. 孢子形成后，用超纯冰冷水冲洗孢子3次，以17,949× g 离心10分钟。
2. 用 10 mL 超纯水重悬从上次离心中获得的沉淀。
3. 将孢子在121ºC下高压灭菌45分钟，以灭活营养细胞。
   注：我们小组先前进行的比较不同灭活方法的测试表明，步骤2.3中提到的条件表现出高效率，表明在LB琼脂培养基上的电镀分析方法中没有菌落形成。

3. 使用流式细胞术定量高压灭菌的孢子

1. 取50μL高压灭菌的孢子，并用溴化乙锭（EtBr，10mg / mL在水中稀释）以0.05%v / v的稀释因子孵育30分钟（图1A）。
2. 用1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤孢子3x，以17,949× g 离心10分钟，并重悬于1x PBS中。
3. 加入 10 μL 微珠，按照制造商的稀释建议进行。
4. 使用流式细胞仪分析样品，如步骤4所述。
   注意：需要强调的是，微珠应尽可能均匀地移液，因为当此步骤执行不充分时，在计算中观察到差异。

4. 使用流式细胞术进行分析

1. 登录到流式细胞仪软件。
2. 在软件工作区中，选择 “流式细胞仪”|”清洁模式 |静置液体。
3. 调整工作区以确定流式细胞术中的分析。
   1. 定义分析的门（图 2）。
      1. 根据基于阴性对照（未标记孢子）的颗粒的形态和荧光特性定义门控策略。
   2. 要确定细胞形态测量，请选择 点图图形 以分析 x 轴上的 FSC-A 参数和 y 轴上的 SSC-A 参数。
   3. 要确定荧光，请在 y 轴上使用 FL5 在 x 轴上选择 FL3 点图 ， 并在四个象限中创建门。
4. 使用含有未标记样品的 12 x 75 mm 塞聚苯乙烯管，先前用单色 EtBr、单色 APC 和多色 EtBr+ APC 标记。
5. 非常轻柔地混合含有阴性对照的试管，并将其连接到流式细胞仪探头上。
6. 点击 获取。
7. 通过导航到流式细胞仪 |参数 |FSC （375） 和 SSC （275）。
8. 将阈值设置为 （500） 流式细胞仪 |阈值。
9. 为了去除自发荧光，分析仅含有孢子的无染料样品。
10. 调整滤光片检测器的电压： FL3 （603） 和 FL5 （538）， 以根据对照中选择的荧光区分阴性和阳性群体。 流式细胞仪 |参数。
11. 流式细胞仪 |薪酬 | 将 FL5/FL3 设置偏移量 设置为 1.0。
12. 形态测定和荧光分析后，为采集 30,000 个事件配置设备 |实验 | 实验布局 |收购 |30,000 个事件....
13. 调整参数后，在流式细胞仪中获取标记并包含珠子的样品的数据。
14. 使用公式（1）按照制造商说明的说明计算孢子浓度。
    （1）
    注：在本研究中，将磁珠定量方法与Petroff-Hausser计数室分析进行了比较。此外，将高压灭菌孢子的标记与非高压灭菌孢子的标记进行了比较。

5. 使用流式细胞术估计孢子表面的蛋白质偶联指数

1. 通过离心 50 μL 孢子 （10³/μL） 17,949 × g 收获 10 分钟，然后用 25 μL 1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺 （EDC） （300 mM） 重悬）。
2. 在室温下孵育15分钟。
3. 向孢子悬浮液中加入 25 μL N-羟基磺基琥珀酰亚胺 （NHS） （50 mM），并在室温下孵育 30 分钟。
4. 如步骤5.1所述，通过离心用1x PBS洗涤孢子3x。
5. 加入荧光蛋白，将样品在15°C下放置过夜。
   注：本研究中使用的荧光蛋白是APC标记的抗人IL-10抗体。该抗体被用作研究模型，尽管其他荧光分子的应用是可能的，因为 EDC/NHS 促进孢子表面蛋白质中存在的 -COOH 和 -NH₂ 基团之间的共价连接。
6. 按照步骤5.3清洗孢子。
7. 加入10mg / mL以1：50稀释的溴化乙锭，然后在冰上放置1小时并避光（图1B）。
8. 按照步骤5.3清洗孢子。
9. 重复步骤 4。
10. 要确定荧光，请更改点图的 X 轴上的参数 FL3 和 Y 轴上的参数 FL5。
11. 如步骤4所述，使用流式细胞仪在FL3（670 LP滤光片）处使用蓝色激光（488nm）和FL5（660/20滤光片）处使用红色激光（633nm）分析样品。
    注：在显微镜下，在放大倍率为1,000 x的情况下，使用以下滤光片分析相同的样品的免疫荧光：FITC 480/30 nm（绿色）和TRITC 540/25 nm（红色）。

Representative Results

在高压灭菌孢子（AS）样品中，分别使用计数珠和Petroff-Hausser方法检测2×10³ 个孢子/μl和1×10³ 个孢子/μl（图2）。

图1：孢子定量的一般方案。（A）用EtBr标记的孢子和（B）双标记的孢子。缩写：EDC=1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺;NHS = N-羟基磺基琥珀酰亚胺。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 2：使用流式细胞术对 枯草芽孢杆 菌孢子进行形态学和定性分析并计数珠子。 使用计数珠（未稀释的样品）定量 B. subtillis 孢子。缩写：FSC-A = 前向散射峰面积;SSC-A = 侧散射峰面积。 请点击这里查看此图的较大版本.

高压灭菌孢子 （AS） 样品的溴化乙锭 （EtBr） 染色显示出比非高压灭菌孢子 （NAS） 染色更高的平均荧光强度 （MFI），因此表明在第一种条件下遗传物质染色更高。此外，在EtBr标记的AS群体中观察到的MFI高于NAS群体（图3，红色峰值和黑色峰值）。未用EtBr标记的对照样品未显示明显的荧光（图3，虚线峰）。

图 3：溴化乙锭标记、高压灭菌和非高压灭菌芽孢杆菌孢子的直方图。 红色NAS EtBr标记中的峰值;黑色 AS EtBr 标记中的峰值;没有 EtBr 标记的点状峰对照。缩写：EtBr = 溴化乙锭;NAS = 非高压灭菌孢子;AS = 高压灭菌的孢子。请点击这里查看此图的较大版本.

在这些实验中，与NAS相比，AS表面的MFI与APC标记的抗人IL-10抗体偶联显示出更高的偶联效率（图4）。因此，双标记实验是用AS进行的。流式细胞术分析鉴定出4个孢子群：EtBr+/FA+;EtBr+/FA-;环氧乙烷-/FA+;EtBr-/FA-.对分子标记物 EtBr 可渗透的孢子的存在表明总种群中可能存在萌发孢子。这可以在使用荧光显微镜分析样品后观察到（通过荧光显微镜可以单独观察EtBr/荧光抗小鼠表8标记和两种荧光团， 图5）。使用Wirtz-Conklin染色方法可以可视化具有番红渗透性的孢子的存在（以粉红色染色， 补充图S1）。在同一分析中，观察到仅用孔雀石绿色染色的孢子，表明不渗透，如休眠孢子¹³ 的文献报道的那样。与NAS相比，相差显微镜的孢子分析显示AS样品中的休眠孢子数量更多（补充图S2）¹⁴。

图 4：高压灭菌和非高压灭菌孢子中 APC 标记的抗人 IL-10 抗体的平均荧光强度。 缩写：FA=荧光抗体;APC = 别藻蓝蛋白。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 5：用 EtBr 和荧光抗小鼠标记的孢子的免疫荧光成像。 （A） 带有 EtBr（红色）标记的遗传物质的孢子。（B）表面用荧光抗小鼠标记的孢子（绿色）。（C）双标记孢子，具有EtBr和荧光抗小鼠（橙色）。比例尺 = 10 μm。 缩写：EtBr = 溴化乙锭。 请点击这里查看此图的较大版本.

这里进行的流式细胞术分析表明，与萌发孢子 （EtBr+/FA+） 相比，FA 与休眠孢子 （EtBr-/FA+） 的偶联百分比更高。在图6A，B所示的图中，可以观察到偶联孢子和MFI百分比的增加，随着FA浓度的增加。此外，这些不与荧光蛋白（EtBr+/FA-和EtBr-/FA-）偶联的孢子种群随着FA浓度的增加而逐渐减少（补充表S1）。

图6：EtBr-/FA+和EtBr+/FA-群体的荧光偶联百分比分析和平均荧光强度。 （A） x 轴表示不同浓度的 FA，黑色 y 轴表示检测到的 MFI，红色 y 轴表示 EtBr-/FA+ 群体中 FA 标记孢子的百分比。（B） x 轴表示不同浓度的 FA，黑色 y 轴表示检测到的 MFI，红色 y 轴表示 EtBr+/FA+ 群体中 EtBr 标记的孢子和 FA 的百分比。缩写：MFI = 平均荧光强度;EtBr = 溴化乙锭;FA = 荧光抗体。 请点击这里查看此图的较大版本.

补充图S1：通过Wirtz-Conklin方法染色的 高压灭菌枯草芽孢 杆菌孢子的显微镜图像。 染成粉红色的孢子是萌发的孢子（对番红具有渗透性）。绿色是休眠的孢子（对番红不渗透）。比例尺 = 10 μm。 请点击这里下载此文件。

补充图S2：高压灭菌和非高压灭菌枯 草芽孢杆 菌孢子的相差显微镜图像比较。（甲，乙） 高压灭菌处理前后枯 草芽孢杆 菌孢子的图像。 请点击这里下载此文件。

附表S1：在流式细胞术中观察到的不同FA浓度下用荧光抗体和溴化乙锭标记或不标记或不标记的孢子百分比值。 缩写：EtBr = 溴化乙锭;FA = 荧光抗体。 请点击这里下载此文件。

Discussion

传统方法，如菌落平板计数，不仅耗时，而且需要活细胞，并且不允许对灭活^孢子进行定量5。Petroff-Hausser 室是一种替代方法，但它需要经验丰富的显微镜学家来执行。流式细胞术已被证明是实现此目的的有用替代方法。

Genovese等人¹² 描述了使用流式细胞术对 芽孢杆菌 的活细胞和孢子进行定量分析，使用两种核酸标记物和所用设备的流速（体积/分钟）的高控制能力，这提供了确定要配置的数值量的选项。并非所有流式细胞仪设备都对流速（体积/分钟）有严格的控制，有些只能在最小、中和最大选项中进行调节。在这些情况下，计数微球可用于确保细胞计数的准确性和与其他流式细胞术设备的可重复性。通过这种方法，在这项研究中，可以计算样品中每毫升的孢子（萌发和休眠）的数量。

根据 Godfrey 和 Alsharif 的专利¹⁰ 中描述的参数对孢子种群进行计数和分析。这些作者描述了使用这种方法来分析芽孢杆菌属的萌发阶段，但没有描述孢子的状态，并使用了高成本的商业DNA标记11,12,13。在这里描述的工作中，使用AS，可以使用EtBr鉴定两个孢子种群（休眠和萌发），EtBr是一种广泛使用且易于获得的标记。由于萌发孢子对 EtBr 的渗透性，孢子状态的鉴定是可能的。需要强调的是，未用 EtBr 标记的孢子群可能在同一样品中呈现相似大小的伪影。可以通过清洗和过滤所使用的缓冲液来缓解这种限制。

流式细胞术分析EtBr标记的AS样品与本文所述的FA偶联也允许荧光蛋白偶联（FPC）的鉴定和定量。应立即对荧光标记和偶联样品进行分析，以避免荧光发射损失。此外，可以推断孢子种群形态和浓度是否受到结合程序的影响，从而全面了解该过程，这在使用斑点印迹法时无法获得。Isticato等人¹⁵ 还分析了孢子表面的FPC，并通过免疫荧光和流式细胞术确认其活力，具体取决于用于偶联的蛋白质类型。在此，观察到使用AS¹¹ 是偶联的优选，因为高压灭菌过程对于可能降解待偶联蛋白质的蛋白酶的失活很重要。需要指出的是，这里描述的技术仅使用 枯草芽孢杆菌 KO7 菌株进行，在其他菌株中的应用仍有待测试。

文献中没有根据孢子的阶段比较孢子偶联能力的报道。在此介绍的实验中，观察到与FA偶联的休眠孢子百分比更高（EtBr-/FA+）¹⁶。相比之下，萌发孢子（EtBr+/FA+）尽管百分比较低，但显示出比休眠孢子中观察到的更高的MFI。需要进行进一步的研究来评估其他 芽孢杆菌 属中较高浓度的 FA（饱和点）的这种行为。

对于未来的应用，这里介绍的方法可用于使用 枯草芽孢杆 菌孢子作为疫苗佐剂的研究，评估最初通过荧光标记的靶抗原的偶联。确定饱和浓度后，可将检测值应用于靶抗原以用于免疫接种。

因此，本文提出了一种实用且灵敏的方法，用于使用流式细胞术计数萌发和休眠孢子以及分析 枯草芽孢 杆菌孢子的荧光蛋白偶联。除了 EtBr 孢子标记外，使用计数珠作为定量参数，可以对萌发孢子进行精细计数并测定荧光蛋白偶联的百分比。这种方法应该有助于开展专注于使用孢子作为佐剂的研究。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(N-hydroxysuccinimide) (NHS)	Sigma	130672
Anti-human fluorescent antibody	BioLegend	501410	APC anti-human IL-10
Anti-mouse fluorescent antibody	Thermo Scientific	A32723	Alexa Fluor Plus 488
BD FACSCanto II	BD		Flow cytometer
BD FACSDiva Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva software v 6.x)	BD	642412	Quality control reagent
BD FACSDiva Software v. 6.1.3	BD	643629	Software
Centrifuge MegaFuge 8R	Thermo Scientific	75007213
Counting Beads	BD	340334	TruCount Tubes
Eclipse 80i	Nikon		Fluorescent Microsope
Ethidium Bromide	Ludwig Biotec
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	A4503
Plastic Microtubes	Eppendorf
Polystyrene tube	Falcon	352008	5 mL polystyrene tube, 12 x 75 mm, without lid, non-sterile