Summary
Denne protokol fokuserer på brugen af flowcytometri og tælleperler til kvantificering af bakteriesporer mærket med ethidiumbromid. Metoden er også effektiv til at analysere den kovalente kobling af proteiner på overfladen af intakte sporer.
Abstract
Sporerne af Bacillus subtilis er allerede blevet foreslået til forskellige bioteknologiske og immunologiske anvendelser; Der er imidlertid et stigende behov for udvikling af metoder, der forbedrer påvisningen af antigener, der er immobiliseret på overfladen af sporer sammen med deres kvantificering. Flowcytometribaserede analyser er tidligere blevet foreslået som hurtige, pålidelige og specifikke tilgange til påvisning af mærkede celler af B. subtilis. Heri foreslår vi brugen af flowcytometri til at evaluere displayeffektiviteten af et fluorescerende antistof (FA) på overfladen af sporen og kvantificere antallet af sporer ved hjælp af tælleperler.
Til dette brugte vi ethidiumbromid som en DNA-markør og et allophycocyanin (APC) -mærket antistof, som var koblet til sporerne, som en overflademarkør. Kvantificeringen af sporer blev udført ved hjælp af tælleperler, da denne teknik demonstrerer høj nøjagtighed i påvisning af celler. De mærkede sporer blev analyseret ved hjælp af et flowcytometer, som bekræftede koblingen. Som et resultat blev det demonstreret, at DNA-mærkning forbedrede nøjagtigheden af kvantificering ved flowcytometri til påvisning af spirede sporer. Det blev observeret, at ethidiumbromid ikke var i stand til at mærke sovende sporer; Denne teknik giver imidlertid en mere præcis bestemmelse af antallet af sporer med fluorescerende protein koblet til deres overflade, hvilket hjælper med udviklingen af undersøgelser, der fokuserer på brugen af sporer som en bioteknologisk platform i forskellige applikationer.
Introduction
Bacillus subtilis er en stavformet, grampositiv bakterie, der er i stand til at producere hvilende sporer, når miljøforholdene ikke tillader cellevækst1. Sporer er ekstremt stabile celleformer og de af flere arter, herunder B. subtilis, er meget udbredt som probiotika til mennesker og dyrbrug 2. På grund af dets resistens og sikkerhedsegenskaber er sporen af B. subtilis, der viser heterologe proteiner, blevet foreslået som en slimhindeadjuvans, et vaccineafgivelsessystem og en enzymimmobiliseringsplatform 3,4.
For at opnå sporer fra B. subtilis er det nødvendigt at udsætte det for næringsstofmangel ved hjælp af et specielt kulturmedium. Efter opnåelse og rensning af disse sporer skal man kvantificere dem for at forbedre testeffektiviteten 5,6. Således anvendes visse metoder til at analysere koncentrationen af de opnåede sporer. Pladetælling og et Petroff-Hausser-kammer, også kendt som et tællekammer, kan bruges. Sidstnævnte blev oprindeligt udviklet til at bestemme koncentrationen af blodlegemer; Det er dog muligt at bruge det inden for mikrobiologi til sporetælling 7,8. På trods af at det er standardmetoden, der bruges til celletælling, er læsning besværlig, da denne metode er helt manuel, og dens nøjagtighed afhænger af operatørens erfaring.
Flowcytometribaserede (FC) analyser er tidligere blevet foreslået som hurtige, pålidelige og specifikke tilgange til påvisning af mærkede celler af Bacillus spp. Anvendelsen af flowcytometritælleperler har garanteret reproducerbarhed i celletælling i rutineundersøgelser (absolut antal CD4- og CD8 T-lymfocytter) og i udviklingen af forskning, der involverer partikler, der kan detekteres og tælles ved hjælp af flowcytometri9. Godjafrey og Alsharif foreslog brugen af tælleperler til FC-kvantificering af umærkede sporer10. Anvendelsen af flowcytometri blev beskrevet til monitorering af sporulation i Bacillus spp. via mærkning af spore-DNA'et 10,11,12,13. Endnu en undersøgelse brugte FC til at evaluere mængden af fluorescerende mærkede proteiner på sporeoverfladen15.
Denne undersøgelse søgte at anvende kommercielle tælleperler for at sikre en standard for reproducerbarhed med hensyn til begivenhedstælling ved hjælp af flowcytometri. Heri foreslår vi brugen af tælleperler til celletælling i FC for at forfine sporetælling og evaluere koblingseffektiviteten af fluorescerende mærkede antistoffer på sporeoverfladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Se materialefortegnelsen for detaljer vedrørende alle materialer, instrumenter og software, der anvendes i denne protokol.
1. Indstilling af flowcytometri
- Justering af optiske parametre for flowcytometer koblet til en computer
- Log ind på Cytometer-softwaren.
- Fra softwarearbejdsområdet skal du vælge Cytometer | Start og vent et par minutter | Ren tilstand | Sid væsker.
BEMÆRK: Luftbobler og forhindringer blev fjernet under cytometerinitieringsprocessen inden prøvetagning.
- Kvalitetskontrol
- Brug kvalitetskontrolreagenset til at justere spændingerne på fotomultiplikatorrørene og evaluere deres følsomhed.
- Forbered kvalitetskontrolreagenset i et polystyrenrør.
- For at definere basislinjen skal suspensionsperlerne fremstilles ved at tilsætte 0,5 ml fortyndingsmiddel (10 mM filtreret PBS, pH 7) og 3 dråber perler til det mærkede rør.
- Bland hætteglasset med perlen ved forsigtig invertering.
- Fra softwarearbejdsområdet skal du vælge Cytometer | CST for at oprette forbindelse til CST-grænsefladen. Vent et par minutter, og observer meddelelsen cytometer afbrudt.
- Fastgør polystyrenrøret, der indeholder kvalitetskontrolreagenset, til flowcytometersonden.
- Brug kvalitetskontrolreagenset til at justere spændingerne på fotomultiplikatorrørene og evaluere deres følsomhed.
- Verifikation af cytometerets konfiguration
- I vinduet Systemoversigt skal du kontrollere, at cytometerkonfigurationen passer til eksperimentet.
- Vælg det batch-id for opsætningsperler, der svarer til for at kontrollere, at det valgte parti-id for opsætningsperler matcher det aktuelle parti CS&T-forskningsperler.
- Kontrol af ydeevne
- Vælg indstillingen Kontroller ydeevne , og klik på Kør.
- Når præstationskontrollen er afsluttet, vises præstationsresultaterne. Se cytometerets ydeevnerapport. Klik enten på Udfør for at fuldføre ydelseskontrollen, eller fjern røret fra cytometeret, og gennemgå resultaterne i vinduet Systemoversigt .
- Overhold det endelige resultat af den morfometriske og fluorescensfølsomhedsanalyse, der vises i | Systemoversigt| Resultat af cytometerydelse| med status: BESTÅET
2. Forberedelse af sporerne
- Efter sporulation skylles sporerne 3x med ultrarent iskoldt vand ved centrifugering ved 17.949 × g i 10 min.
- Resuspender pellet opnået fra den sidste centrifugering med 10 ml ultrarent vand.
- Autoklave sporerne i 45 min ved 121 ºC til inaktivering af de vegetative celler.
BEMÆRK: Tidligere tests udført af vores gruppe, der sammenlignede forskellige inaktiveringsmetoder, viste, at betingelserne nævnt i trin 2.3 præsenterede høj effektivitet og viste ingen kolonidannelse i pletteringsanalysemetoden på LB-agarmediet.
3. Kvantificering af autoklaverede sporer ved hjælp af flowcytometri
- Der udtages 50 μL autoklaverede sporer og inkuberes dem, der er beskyttet mod lys, med ethidiumbromid (EtBr, 10 mg/ml fortyndet i vand) ved en fortyndingsfaktor på 0,05 % v/v i 30 minutter (figur 1A).
- Sporerne vaskes 3x med 1x fosfatbufret saltvand (PBS) ved centrifugering ved 17.949 × g i 10 minutter og resuspenderes i 1x PBS.
- Tilsæt 10 μL perler efter producentens anbefalinger til fortynding.
- Prøven analyseres ved hjælp af et flowcytometer som beskrevet i trin 4.
BEMÆRK: Det er vigtigt at understrege, at perlerne skal pipetteres så homogent som muligt, da der blev observeret forskelle i beregningerne, da dette trin ikke var godt udført.
4. Analyse ved hjælp af flowcytometri
- Log ind på Cytometer-softwaren.
- Fra softwarearbejdsområdet skal du vælge Cytometer | Ren tilstand | Sid væsker.
- Juster til arbejdsområdet for at bestemme analysen i flowcytometri.
- Definer portene til analyserne (figur 2).
- Definer gating-strategien baseret på partiklernes morfometriske og fluorescensegenskaber baseret på den negative kontrol (umærkede sporer).
- Hvis du vil bestemme cellemorfometri, skal du vælge Dotplot-grafik til analyser af FSC-A-parametre på x-aksen og SSC-A på y-aksen.
- For at bestemme fluorescens skal du vælge FL3 Dotplot-plots på y-aksen ved hjælp af FL5 på x-aksen og oprette portene i fire kvadranter.
- Definer portene til analyserne (figur 2).
- Brug et 12 x 75 mm proppet polystyrenrør, der indeholder umærkede prøver, der tidligere er mærket med ensfarvet EtBr, enkeltfarvet APC og flerfarvet EtBr+ APC.
- Bland røret meget forsigtigt indeholdende den negative kontrol og fastgør det til flowcytometersonden.
- Klik på Erhverv.
- Indstil lasernes effekt ved at navigere til cytometer | Parametre | FSC (375) og SSC (275).
- Indstil tærsklen til (500) cytometer | Tærskelværdi.
- For at fjerne autofluorescens skal du analysere den farvestoffri prøve, der kun indeholder sporer.
- Juster spændingerne for filterdetektorerne: FL3 (603) og FL5 (538) for at skelne mellem negative og positive populationer med hensyn til den valgte fluorescens i kontrollerne. Cytometer | Parametre.
- Cytometer | Kompensation | Indstil FL5/FL3-opsætningsforskydning til 1,0.
- Efter morfometri og fluorescerende analyse skal du konfigurere enheden til anskaffelse 30.000 hændelser | Eksperiment | Layout af eksperiment | Erhvervelse |30.000 begivenheder....
- Efter justering af parametrene skal du hente data for de prøver, der er mærket og indeholder perler i flowcytometeret.
- Sporekoncentrationen beregnes som beskrevet i fabrikantens anvisninger ved hjælp af ligning (1).
(1)
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev perlekvantificeringsmetoden sammenlignet med Petroff-Hausser-tællekammeranalysen. Desuden blev mærkning af autoklaverede sporer sammenlignet med mærkning af ikke-autoklaverede sporer.
(1)5. Estimering af proteinkoblingsindekset på en sporeoverflade ved hjælp af flowcytometri
- Der høstes ved centrifugering af 50 μL sporer (103/μL) 17,949 × g i 10 minutter, hvorefter 25 μL 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodimid (EDC) (300 mM) opslæmmes).
- Inkuber i 15 min ved stuetemperatur.
- Der tilsættes 25 μL N-hydroxysulfosuccinimid (NHS) (50 mM) til sporesuspensionen og inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter.
- Sporerne vaskes 3x med 1x PBS ved centrifugering som beskrevet i trin 5.1.
- Tilsæt fluorescerende protein og lad prøverne stå natten over ved 15 °C.
BEMÆRK: Det fluorescerende protein, der blev anvendt i dette arbejde, var et APC-mærket anti-humant IL-10-antistof. Dette antistof blev brugt som en model til undersøgelse, selvom anvendelsen af andre fluorescerende molekyler er mulig, da EDC / NHS fremmer en kovalent ligering mellem -COOH og -NH2 grupper til stede i proteiner på sporeoverfladen. - Sporerne vaskes i henhold til trin 5.3.
- Der tilsættes 10 mg/ml ethidiumbromid fortyndet kl. 1:50, hvorefter det lægges på is i 1 time og beskyttes mod lys (figur 1B).
- Sporerne vaskes i henhold til trin 5.3.
- Gentag trin 4.
- For at bestemme fluorescens skal du ændre parametrene FL3 på X-aksen og FL5 på dotplotets Y-akse .
- Prøven analyseres ved hjælp af et flowcytometer med den blå laser (488 nm) ved FL3 (670 LP-filter) og den røde laser (633 nm) i FL5 (660/20-filter) som beskrevet i trin 4.
BEMÆRK: De samme prøver blev analyseret for immunfluorescens på dias under et mikroskop i et forstørrelsesområde på 1.000 x og ved hjælp af følgende filtre: FITC 480/30 nm (grøn) og TRITC 540/25 nm (rød).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I autoklaverede sporeprøver (AS) blev 2 × 103 sporer/μl og 1 × 103 sporer/μl påvist ved hjælp af henholdsvis tælleperler og Petroff-Hausser-metoden (figur 2).
Figur 1: Generel ordning for kvantificering af sporer. (A) Sporer mærket med EtBr og (B) dobbeltmærkede sporer. Forkortelser: EDC = 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid; NHS = N-hydroxysulfosuccinimid. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Morfometrisk og kvalitativ analyse af Bacillus subtilis spore og tælleperler ved hjælp af flowcytometri. Kvantificering af B. subtillis-sporer ved hjælp af tælleperler (ufortyndet prøve). Forkortelser: FSC-A = fremadrettet spredningstopareal; SSC-A = side scatter-peak område. Klik her for at se en større version af denne figur.
Ethidiumbromid (EtBr) farvning af autoklaverede sporeprøver (AS) viste højere gennemsnitlig fluorescensintensitet (MFI) end farvning af ikke-autoklaverede sporer (NAS), hvilket indikerer større farvning af genetisk materiale i den første tilstand. Derudover blev der observeret en større MFI i den EtBr-mærkede AS-population end i NAS-populationen (figur 3, top i rød og top i sort). Kontrolprøven, der ikke var mærket med EtBr, viste ikke signifikant fluorescens (figur 3, prikket top).
Figur 3: Histogram af ethidiumbromid-mærkede, autoklaverede og ikke-autoklaverede Bacillus subtillis-sporer . Peak i rød-NAS EtBr mærkning; peak i sort-AS EtBr mærkning; prikket topkontrol uden EtBr-mærkning. Forkortelser: EtBr = ethidiumbromid; NAS = ikke-autoklaverede sporer; AS = autoklaverede sporer. Klik her for at se en større version af denne figur.
I disse eksperimenter viste MFI på AS-overfladekoblingen med APC-mærket anti-humant IL-10-antistof større koblingseffektivitet sammenlignet med NAS (figur 4). Af denne grund blev de dobbeltmærkede eksperimenter udført med AS. Fire sporepopulationer blev identificeret i flowcytometrianalysen: EtBr+/FA+; EtBr+/FA-; EtBr-/FA+; EtBr-/FA-. Tilstedeværelsen af sporer, der er gennemtrængelige for molekylmarkøren EtBr, indikerer den mulige tilstedeværelse af spirede sporer i den samlede population. Dette kunne observeres efter analyse af prøven ved hjælp af fluorescensmikroskopi (hvorved det var muligt at observere EtBr/fluorescerende antimusetabel 8-mærkning og begge fluoroforer individuelt, figur 5). Brug af Wirtz-Conklin-farvningsmetoden tillod visualisering af eksistensen af sporer med permeabilitet for safranin (farvet i pink, supplerende figur S1). I den samme analyse blev sporer kun farvet med malachitgrøn observeret, hvilket indikerer uigennemtrængelighed, som rapporteret i litteraturen for sovende sporer13. Sporeanalysen ved fasekontrastmikroskopi viser et højere antal sovende sporer i AS-prøven sammenlignet med NAS (supplerende figur S2)14.
Figur 4: Gennemsnitlig fluorescensintensitet af APC-mærkede anti-humane IL-10-antistoffer i autoklaverede og ikke-autoklaverede sporer. Forkortelser: FA = fluorescerende antistof; APC = allophycocyanin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Immunfluorescensbilleddannelse af sporer mærket med EtBr og fluorescerende antimus. (A) Sporer med genetisk materiale mærket med EtBr (rød). (B) Sporer med overflade mærket med fluorescerende antimus (grøn). (C) Dobbeltmærkede sporer med EtBr og fluorescerende antimus (orange). Skalabjælke = 10 μm. Forkortelser: EtBr = ethidiumbromid. Klik her for at se en større version af denne figur.
De flowcytometrianalyser, der blev udført her, indikerede en højere procentdel af kobling af FA til de sovende sporer (EtBr-/FA+) sammenlignet med spirede sporer (EtBr+/FA+). I grafen vist i figur 6A,B kan stigningen i procentdelen af koblede sporer og MFI observeres, når koncentrationen af FA stiger. Desuden viste populationerne af disse sporer, der ikke var parret med det fluorescerende protein (EtBr+/FA- og EtBr-/FA-), en gradvis reduktion med stigningen i koncentrationen af FA (supplerende tabel S1).
Figur 6: Analyse af fluorescenskoblingsprocent og gennemsnitlig fluorescensintensitet af EtBr-/FA+- og EtBr+/FA-populationer. (A) X-aksen repræsenterer de forskellige koncentrationer af FA, den sorte y-akse repræsenterer den detekterede MFI, og den røde y-akse repræsenterer procentdelen af FA-mærkede sporer fra EtBr-/FA+-populationen. (B) X-aksen repræsenterer de forskellige koncentrationer af FA, den sorte y-akse repræsenterer den detekterede MFI, og den røde y-akse repræsenterer procentdelen af EtBr-mærkede sporer og FA fra EtBr+/FA+-populationen. Forkortelser: MFI = gennemsnitlig fluorescensintensitet; EtBr = ethidiumbromid; FA = fluorescerende antistof. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur S1: Mikroskopibillede af autoklaverede B. subtilis-sporer farvet af Wirtz-Conklin-metoden. Sporer farvet pink er spirede sporer (gennemtrængelige for safranin). I grønt er sovende sporer (uigennemtrængelige for safranin). Skalabjælke = 10 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S2: Sammenligning af fasekontrastmikroskopibilleder af autoklaverede og ikke-autoklaverede B. subtilis-sporer . (A,B) Billeder af B. subtilis sporer før og efter autoklavebehandlingen. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel S1: Værdier af procentdele af sporer markeret eller ej med fluorescerende antistof og ethidiumbromid i forskellige FA-koncentrationer, observeret i flowcytometri. Forkortelser: EtBr = ethidiumbromid; FA = fluorescerende antistof. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Traditionelle metoder, såsom kimtælling af kolonier, er ikke kun tidskrævende, men har også brug for levedygtige celler og tillader ikke kvantificering af inaktiverede sporer5. Petroff-Hausser-kammeret er en alternativ metode, men det kræver en erfaren mikroskopist at udføre den. Flowcytometri har vist sig at være et nyttigt alternativ til dette formål.
Genovese et al.12 beskrev brugen af flowcytometri til kvantificering af levedygtige celler og sporer af Bacillus sp. ved hjælp af to nukleinsyremarkører og høj kontrolkapacitet for strømningshastigheden (volumen / minut) af det anvendte udstyr, hvilket giver mulighed for at bestemme den numeriske mængde, der skal konfigureres. Ikke alt cytometriudstyr har streng kontrol over strømningshastigheden (volumen / minutter), og nogle kan kun justeres i minimale, mellemstore og maksimale indstillinger. I disse tilfælde kan tælleperler bruges til at sikre nøjagtigheden af celletælling og reproducerbarhed mod andet flowcytometriudstyr. Via denne metode var det i denne undersøgelse muligt at beregne antallet af sporer (spiret og sovende) pr. milliliter i prøverne.
Sporepopulationen blev optalt og analyseret i henhold til parametrene beskrevet i Godfrey og Alsharifs patent10. Disse forfattere beskriver brugen af denne metode til analyse af spiringsstadierne af Bacillus spp. uden at beskrive sporens tilstand og ved hjælp af dyre kommercielle DNA-markører 11,12,13. I det her beskrevne arbejde ved hjælp af AS var det muligt at identificere to populationer af sporer (sovende og spirede) ved hjælp af EtBr, som er en meget anvendt og let tilgængelig markør. Identifikationen af sporetilstanden var mulig på grund af permeabiliteten af de spirede sporer til EtBr. Det er vigtigt at fremhæve, at populationen af sporer, der ikke er mærket med EtBr, kan præsentere artefakter af samme størrelse i samme prøve. Denne begrænsning kan afhjælpes ved at vaske og filtrere de anvendte buffere.
Flowcytometrianalysen af EtBr-mærkede AS-prøver kombineret med FA beskrevet her tillod også kvalifikation og kvantificering af fluorescerende proteinkobling (FPC). Analyse af fluorescerende mærkede og koblede prøver bør udføres straks for at undgå tab af fluorescensemission. Desuden var det muligt at udlede, om sporepopulationens morfologi og koncentration blev påvirket af konjugationsproceduren, hvilket giver en samlet forståelse af processen, som ikke opnås ved anvendelse af dot-blot-metoden. Isticato et al.15 analyserede også FPC på sporeoverfladen og demonstrerede dens levedygtighed ved at bekræfte den med immunofluorescens og flowcytometri, afhængigt af hvilken type protein der anvendes til kobling. Heri blev det observeret, at brugen af AS11 foretrækkes til kobling, da autoklaveringsprocessen er vigtig for inaktivering af proteaser, der kan nedbryde proteinet, der skal kobles. Det er vigtigt at påpege, at de her beskrevne teknikker kun blev udført ved hjælp af B. subtilis KO7-stammen, mens anvendelsen i andre stammer stadig skal testes.
Der er ingen rapporter i litteraturen, der sammenligner sporernes koblingskapacitet i henhold til deres stadium. I de eksperimenter, der præsenteres her, blev der observeret en højere procentdel af sovende sporer kombineret med FA (EtBr-/FA+)16. I modsætning hertil viste spirede sporer (EtBr+/FA+) på trods af deres lavere procentdel en højere MFI end det, der blev observeret i de sovende sporer. Yderligere undersøgelser skal udføres for at evaluere denne adfærd for højere koncentrationer af FA (mætningspunkt) i andre Bacillus spp.
Til fremtidige anvendelser kan den metode, der præsenteres her, anvendes i undersøgelser af brugen af B. subtilis-sporer som vaccineadjuvans, der evaluerer koblingen af et målantigen, der oprindeligt blev mærket med fluorescens. Efter bestemmelse af den mættende koncentration kan den detekterede værdi påføres målantigenet til brug i immuniseringer.
Således præsenterer dette papir en praktisk og følsom metode til tælling af spirede og sovende sporer og analyse af fluorescerende proteinkobling af Bacillus subtilis-sporer ved hjælp af flowcytometri. Anvendelsen af tælleperler som en parameter til kvantificering ud over EtBr-sporemærkningen tillader en raffineret tælling af spirede sporer og den procentvise bestemmelse af fluorescerende proteinkobling. Denne metode skal hjælpe med udviklingen af undersøgelser, der fokuserer på brugen af sporer som adjuvans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev delvis finansieret af Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001; Governo do Estado do Amazonas med ressourcer fra Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Forfatterne takker programmet for teknologisk udvikling i værktøjer til sundhed PDTIS-FIOCRUZ for brug af dets faciliteter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (N-hydroxysuccinimide) (NHS) | Sigma | 130672 | |
| Anti-human fluorescent antibody | BioLegend | 501410 | APC anti-human IL-10 |
| Anti-mouse fluorescent antibody | Thermo Scientific | A32723 | Alexa Fluor Plus 488 |
| BD FACSCanto II | BD | Flow cytometer | |
| BD FACSDiva Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva software v 6.x) | BD | 642412 | Quality control reagent |
| BD FACSDiva Software v. 6.1.3 | BD | 643629 | Software |
| Centrifuge MegaFuge 8R | Thermo Scientific | 75007213 | |
| Counting Beads | BD | 340334 | TruCount Tubes |
| Eclipse 80i | Nikon | Fluorescent Microsope | |
| Ethidium Bromide | Ludwig Biotec | ||
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Plastic Microtubes | Eppendorf | ||
| Polystyrene tube | Falcon | 352008 | 5 mL polystyrene tube, 12 x 75 mm, without lid, non-sterile |
References
- McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis endospore: assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews. Microbiology. 11 (1), 33-44 (2013).
- Cutting, S. M.
- Ricca, E., Baccigalupi, L., Cangiano, G., De Felice, M., Isticato, R. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).
- Falahati-Pour, S. K., Lotfi, A. S., Ahmadian, G., Baghizadeh, A. Covalent immobilization of recombinant organophosphorus hydrolase on spores of Bacillus subtilis. Journal of Applied Microbiology. 118 (4), 976-988 (2015).
- Harrold, Z., Hertel, M., Gorman-Lewis, D. Optimizing Bacillus subtilis spore isolation and quantifying spore harvest purity. Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 325-329 (2011).
- Nicholson, W. L., Setlow, P. Sporulation, germination and outgrowth. Molecular biological methods for Bacillus. , John Wiley and Sons, Chichester, UK. (1990).
- Mora-Uribe, P., et al. Characterization of the adherence of Clostridium difficile spores: the integrity of the outermost layer affects adherence properties of spores of the epidemic strain R20291 to components of the intestinal mucosa. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 99 (2016).
- Paidhungat, M., Setlow, P. Role of ger proteins in nutrient and nonnutrient triggering of spore germination in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 182 (9), 2513-2519 (2000).
- Schnizlein-Bick, C., Spritzler, J., Wilkening, C., Nicholson, J., O'Gorman, M. Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Site Investigators and The NIAID DAIDS New Technologies Evaluation Group. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 7 (3), 336-343 (2000).
- Rapid enumeration of viable spores by flow cytometry. US Patent. Godfrey, A., Alsharif, R. , US20040023319A1 https://patentimages.storage.googleapis.com/fa/3c/dc/9e08d9ecd1b315/US20040023319A1.pdf (2003).
- Karava, M., Bracharz, F., Kabisch, J. Quantification and isolation of Bacillus subtilis spores using cell sorting and automated gating. PLoS ONE. 14 (7), e021989 (2019).
- Genovese, M., Poulain, E., Doppler, F., Toussaint, R., Boyer, M. Bacillus spore enumeration using flow cytometry: A proof of concept for probiotic application. Journal of Microbiological Methods. 190, 106336 (2021).
- Trunet, C., Ngo, H., Coroller, L. Quantifying permeabilization and activity recovery of Bacillus spores in adverse conditions for growth. Food Microbiology. 81, 115-120 (2019).
- Tehri, N., Kumar, N., Raghu, H., Vashishth, A.
- Isticato, R., Ricca, E., Baccigalupi, L. Spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens. Journal of Visualized Experiments. 145, e59102 (2019).
- Song, M., et al. Killed Bacillus subtilis spores as a mucosal adjuvant for an H5N1 vaccine. Vaccine. 30 (22), 3266-3277 (2012).
