Summary
このプロトコルは、フローサイトメトリーとカウントビーズを使用して、エチジウムブロマイドで標識された細菌胞子を定量化することに焦点を当てています。この方法は、無傷の胞子の表面におけるタンパク質の共有結合を分析するのにも効率的です。
Abstract
枯草菌の胞子は、さまざまなバイオテクノロジーおよび免疫学的用途のためにすでに提案されています。しかし、胞子の表面に固定化された抗原の検出とその定量を改善する方法論の開発の必要性が高まっています。フローサイトメトリーベースの解析は、枯草菌の標識細胞を検出するための迅速で信頼性が高く、特異的なアプローチとして以前から提案されてきました。本研究では、フローサイトメトリーを用いて、胞子表面の蛍光抗体(FA)のディスプレイ効率を評価し、カウンティングビーズを用いて胞子の数を定量することを提案します。
このために、DNAマーカーとして臭化エチジウムを使用し、胞子に結合したアロフィコシアニン(APC)標識抗体を表面マーカーとして使用しました。胞子の定量は、細胞の検出において高い精度を示すため、計数ビーズを使用して行われました。標識された胞子をフローサイトメーターを用いて解析し、カップリングを確認しました。その結果、DNA標識により、発芽胞子の検出のためのフローサイトメトリーによる定量精度が向上することが実証されました。エチジウムブロマイドは休眠胞子を標識できないことが観察されました。しかし、この技術は、表面に蛍光タンパク質が結合した胞子の数をより正確に決定できるため、さまざまなアプリケーションにおけるバイオテクノロジープラットフォームとしての胞子の使用に焦点を当てた研究の開発に役立ちます。
Introduction
枯草菌は棒状のグラム陽性菌で、環境条件が細胞増殖を許さない場合に静止胞子を産生することができます1。胞子は非常に安定した細胞形態であり、枯草菌を含むいくつかの種の胞子は、ヒトおよび動物用のプロバイオティクスとして広く使用されています2。枯草菌の胞子は、その耐性と安全性の特性から、異種タンパク質を示し、粘膜アジュバント、ワクチン送達システム、および酵素固定化プラットフォームとして提案されている3,4。
枯草菌から胞子を得るには、特別な培地を使用して栄養遮断にさらす必要があります。これらの胞子を入手して精製した後、検査効率を向上させるためにそれらを定量化する必要があります5,6。したがって、得られた胞子の濃度を分析するために特定の方法が適用されます。プレートカウンティングと、カウンティングチャンバーとしても知られるペトロフ・ハウザーチャンバーを使用できます。後者はもともと血球の濃度を決定するために開発されました。しかし、胞子計数のための微生物学の分野でそれを使用することは可能です7,8。細胞計数に使用される標準的な方法であるにもかかわらず、この方法は完全に手作業であり、その精度はオペレーターの経験に依存するため、読み取りは面倒です。
フローサイトメトリー(FC)ベースの分析は、バチルス属菌の標識細胞を検出するための迅速で信頼性が高く、特異的なアプローチとして以前に提案されてきました。フローサイトメトリーカウンティングビーズの使用により、ルーチン検査(CD4およびCD8 Tリンパ球の絶対数)での細胞カウント、およびフローサイトメトリーを使用して検出およびカウントできる粒子を含む研究の開発における再現性が保証されています9。GodjafreyとAlsharifは、非標識胞子のFC定量化にカウントビーズの使用を提案しました10。フローサイトメトリーの使用は、バチルス属菌の胞子形成のモニタリングについて説明されています。胞子DNA10,11,12,13を標識する。さらに別の研究では、胞子表面上の蛍光標識タンパク質の量を評価するためにFCが用いられた15。
この研究では、市販のカウンティングビーズを使用して、フローサイトメトリーを使用したイベントカウンティングに関する再現性の基準を確保しようとしました。本研究では、胞子計数を精緻化し、胞子表面上の蛍光標識抗体の結合効率を評価するために、FCでの細胞計数に計数ビーズを使用することを提案します。
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Protocol
このプロトコルで使用されるすべての材料、機器、およびソフトウェアに関連する詳細については、 材料表 を参照してください。
1. フローサイトメトリーの設定
- コンピュータと結合したフローサイトメーターの光学パラメータのアライメント
- Cytometerソフトウェアにログインします。
- ソフトウェアワークスペースから、 Cytometer |起動 して数分待つ |クリーンモード |液体を座らせます。
注:気泡や障害物は、サンプル取得前のサイトメーター開始プロセス中に除去しました。
- 品質管理
- 品質管理試薬を使用して、光電子増倍管の電圧を調整し、感度を評価します。
- ポリスチレンチューブで品質管理試薬を調製します。
- ベースラインを定義するには、0.5 mL の希釈液(10 mM ろ過 PBS、pH 7)と 3 滴のビーズを標識チューブに添加して、懸濁ビーズを調製します。
- ビーズバイアルを穏やかに反転させて混合します。
- ソフトウェアワークスペースから、 Cytometer |CST インターフェイスに接続するための CST。数分待ってから、「 サイトメーターが切断されました」というメッセージを確認します。
- 品質管理試薬の入ったポリスチレンチューブをフローサイトメータープローブに取り付けます。
- 品質管理試薬を使用して、光電子増倍管の電圧を調整し、感度を評価します。
- サイトメーターの構成の検証
- [System Summary]ウィンドウで、サイトメーターの構成が実験に適していることを確認します。
- 対応するセットアップビーズのバッチIDを選択して、選択したセットアップビーズのロットIDがCS&T研究ビーズの現在のロットと一致することを確認します。
- 性能チェック
- 「 パフォーマンスの確認 」オプションを選択し、「 実行」をクリックします。
- 性能チェックが完了すると、性能結果が表示されます。 サイトメーターのパフォーマンスレポートをご覧ください。 Finish をクリックしてパフォーマンスチェックを完了するか、サイトメーターからチューブを取り外して、 System Summary ウィンドウで結果を確認します。
- 形態測定および蛍光感度分析の最終結果を観察します。 | システム概要| サイトメーターの性能結果| ステータス: PASSED
2.胞子の準備
- 胞子形成後、17,949 × g で10分間遠心分離することにより、胞子を超純度氷冷水で3回すすぎます。
- 最後の遠心分離で得られたペレットを10mLの超純水で再懸濁します。
- 栄養細胞の不活化のために121ºCで45分間胞子をオートクレーブします。
注:異なる不活化方法を比較した私たちのグループが実施した以前の試験では、ステップ2.3で述べた条件が高い効率を示し、LB寒天培地のめっき分析法ではコロニー形成がないことを示しました。
3. フローサイトメトリーを用いたオートクレーブ滅菌胞子の定量
- オートクレーブ処理した胞子 50 μL を採取し、臭化エチジウム(EtBr、水で希釈した 10 mg/mL)と希釈係数 0.05% v/v で 30 分間、光から保護してインキュベートします(図 1A)。
- 胞子を1x リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で17,949 × g で10分間遠心分離して3回洗浄し、1x PBSに再懸濁します。
- 希釈に関するメーカーの推奨に従って、10 μLのビーズを加えます。
- ステップ4で説明したフローサイトメーターを使用してサンプルを分析します。
注:このステップがうまく実行されなかった場合、計算で不均衡が観察されたため、ビーズはできるだけ均一にピペッティングする必要があることを強調することが重要です。
4. フローサイトメトリーによる解析
- Cytometerソフトウェアにログインします。
- ソフトウェアワークスペースから、 Cytometer |クリーンモード |液体を座らせます。
- ワークスペースに合わせて調整し、フローサイトメトリーでの解析を決定します。
- 解析のゲートを定義します(図 2)。
- ネガティブコントロール(マークされていない胞子)に基づく粒子の形態測定および蛍光特性に基づいてゲーティング戦略を定義します。
- 細胞形態測定を決定するには、x軸にFSC-Aパラメータ、y軸にSSC-Aパラメータの分析にドットプロットグラフィックを選択します。
- 蛍光を決定するには、 X 軸に FL5 を使用して、Y 軸に FL3 ドットプロット プロット を選択し 、4 象限でゲートを作成します。
- 解析のゲートを定義します(図 2)。
- 単色EtBr、単色APC、および多色EtBr+ APCで以前に標識された標識のないサンプルを含む12 x 75 mmストッパー付きポリスチレンチューブを使用します。
- ネガティブコントロールの入ったチューブを非常に穏やかに混合し、フローサイトメータープローブに取り付けます。
- [ 取得] をクリックします。
- レーザーの出力を設定するには、Cytometer |パラメータ |FSC(375)およびSSC(275)。
- 閾値を(500) Cytometer |しきい値。
- 自家蛍光を除去するには、胞子のみを含む無染料サンプルを分析します。
- フィルター検出器の電圧( FL3(603) および FL5(538) )を調整して、コントロールで選択した蛍光に関して陰性および陽性の集団を区別します。 サイトメーター |パラメーター。
- サイトメーター |報酬 |FL5/FL3 設定オフセットを 1.0 に設定します。
- 形態測定と蛍光分析の後、Acquisition 30,000 events |実験 | 実験レイアウト |獲得|30,000イベント....
- パラメータを調整した後、フローサイトメーターで標識され、ビーズを含むサンプルのデータを取得します。
- 式(1)を使用して、製造元の指示に記載されているように胞子濃度を計算します。
(1)
注:この研究では、ビーズの定量法をPetroff-Hausser計数チャンバー分析と比較しました。さらに、オートクレーブ処理した胞子の標識を、オートクレーブ処理していない胞子の標識と比較しました。
(1)5. フローサイトメトリーを用いた胞子表面のタンパク質カップリング指数の推定
- 胞子50μL(103/μL)17,949 ×gを10分間遠心分離して回収し、その後、25μLの1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)(300 mM))で再懸濁する。
- 室温で15分間インキュベートします。
- 胞子懸濁液に25 μLの N-ヒドロキシスルホコハク酸イミド(NHS)(50 mM)を加え、室温で30分間インキュベートします。
- ステップ5.1で説明したように、胞子を1x PBSで遠心分離により3回洗浄します。
- 蛍光タンパク質を添加し、サンプルを15°Cで一晩放置します。
注:本研究で使用した蛍光タンパク質は、APC標識抗ヒトIL-10抗体です。この抗体は研究のモデルとして使用されましたが、EDC/NHSは胞子表面のタンパク質に存在する-COOH基と-NH2 基の間の共有結合ライゲーションを促進するため、他の蛍光分子の適用が可能です。 - ステップ5.3に従って胞子を洗います。
- 1:50 に希釈した 10 mg/mL のエチジウムブロマイドを加え、氷上に 1 時間放置し、光から保護します(図 1B)。
- ステップ5.3に従って胞子を洗います。
- 手順 4 を繰り返します。
- 蛍光を測定するには、ドットプロットのX軸のパラメータFL3とY軸のFL5を変更します。
- ステップ4で説明したように、FL3(670 LPフィルター)で青色レーザー(488 nm)とFL5(660/20フィルター)で赤色レーザー(633 nm)を備えたフローサイトメーターを使用してサンプルを分析します。
注:同じサンプルを、FITC 480/30 nm(緑)およびTRITC 540/25 nm(赤)のフィルターを使用して、顕微鏡下で1,000倍の倍率範囲でスライドの免疫蛍光分析を行いました。
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Representative Results
オートクレーブ滅菌した胞子(AS)サンプルでは、計数ビーズとPetroff-Hausser法を用いて、それぞれ2 × 103 胞子/μlおよび1 × 103 胞子/μlを検出しました(図2)。
図1:胞子の定量化の一般的なスキーム。(A)EtBrで標識された胞子と(B)二重標識された胞子。略語:EDC = 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド;NHS = N-ヒドロキシスルホスクシンイミド。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:フローサイトメトリーを用いた 枯草菌 の胞子とカウントビーズの形態測定および定性分析。 カウンティングビーズ(原液サンプル)を用いた B. subtillis 胞子の定量。略語: FSC-A = 前方散乱ピーク面積;SSC-A = 側方散乱光-ピーク面積。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
オートクレーブ処理した胞子(AS)サンプルのエチジウムブロマイド(EtBr)染色は、オートクレーブ処理していない胞子(NAS)の染色よりも高い平均蛍光強度(MFI)を示し、最初の条件では遺伝物質の染色が大きいことを示しています。さらに、EtBr標識AS集団では、NAS集団よりも高いMFIが観察されました(図3、赤のピークと黒のピーク)。EtBr で標識していないコントロールサンプルでは、有意な蛍光は見られませんでした(図 3、点線のピーク)。
図3:エチジウムブロマイド標識、オートクレーブ、および非オートクレーブ処理された 枯草菌 胞子のヒストグラム。 red-NAS EtBrラベリングのピーク。黒色-AS EtBr標識のピーク。EtBr標識なしの点線ピークコントロール。略語:EtBr =エチジウムブロマイド;NAS = 非オートクレーブ胞子;AS = オートクレーブ滅菌された胞子。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
これらの実験では、APC標識抗ヒトIL-10抗体とAS表面のMFIカップリングは、NASと比較してより高いカップリング効率を示しました(図4)。このため、二重標識実験はASで行いました。フローサイトメトリー解析で4つの胞子集団が同定されました:EtBr+/FA+;EtBr+/FA-;EtBr-/FA+;EtBr-/FA-です。分子マーカーEtBrに透過性である胞子の存在は、全集団における発芽胞子の存在の可能性を示す。これは、蛍光顕微鏡を用いてサンプルを分析した後に観察できました(これにより、EtBr/Fluorescent Anti-mouse table 8標識と両方の蛍光色素を個別に観察することができました、 図5)。Wirtz-Conklin染色法を用いることで、サフラニンを透過する胞子の存在を可視化することができました(ピンク色に染色、 補足図S1)。この同じ分析では、マラカイトグリーンのみで染色された胞子が観察され、休眠胞子の文献で報告されているように、不浸透性を示しました13。位相差顕微鏡による胞子分析では、NASと比較してAS試料中の休眠胞子の数が多くなります(補足図S2)14。
図4:オートクレーブおよび非オートクレーブ処理された胞子におけるAPC標識抗ヒトIL-10抗体の平均蛍光強度。 略語:FA = 蛍光抗体;APC =アロフィコシアニン。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:EtBrおよび蛍光抗マウスで標識した胞子の免疫蛍光イメージング。 (A)EtBr(赤)でマークされた遺伝物質を含む胞子。(B)表面に蛍光抗マウス(緑色)で標識された胞子。(C)EtBrと蛍光抗マウス(オレンジ色)を有する二重標識胞子。スケールバー = 10 μm。 略語: EtBr = ethidium bromide. この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
ここで実施したフローサイトメトリー解析では、発芽胞子(EtBr+/FA+)と比較して、FAと休眠胞子(EtBr-/FA+)の結合率が高いことが示されました。 図6A、Bに示すグラフでは、FAの濃度が高くなるにつれて、胞子とMFIの結合率の増加が観察できます。また、蛍光タンパク質と結合しないこれらの胞子(EtBr+/FA-およびEtBr-/FA-)の個体群は、FA濃度の増加に伴って緩やかな減少を示した(付表S1)。
図6:EtBr-/FA+およびEtBr+/FA-集団の蛍光カップリング率分析と平均蛍光強度。 (A)x軸はFAの異なる濃度を表し、黒色のy軸は検出されたMFIを表し、赤色のy軸はEtBr-/FA+集団からのFA標識胞子の割合を表します。(B)x軸はFAの異なる濃度を表し、黒のy軸は検出されたMFIを表し、赤のy軸はEtBr+/FA+集団からのEtBr標識胞子およびFAの割合を表します。略語:MFI =平均蛍光強度;EtBr = エチジウムブロマイド;FA = 蛍光抗体。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
補足図S1:Wirtz-Conklin法で染色した枯 草菌 胞子の顕微鏡画像。 ピンク色に染色された胞子は、発芽した胞子(サフラニンを透過性)です。緑色は休眠中の胞子(サフラニンを通さない)です。スケールバー = 10 μm. このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S2:枯 草菌 胞子と非オートクレーブ菌の位相差顕微鏡画像の比較。(A,B) 枯 草菌 の胞子の画像(オートクレーブ処理前後) このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表S1:フローサイトメトリーで観察された、異なるFA濃度で、蛍光抗体および臭化エチジウムでマークされた胞子の割合 、またはマークされていない胞子の割合の値。略語:EtBr =エチジウムブロマイド;FA = 蛍光抗体。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
コロニーのプレートカウントなどの従来の方法は、時間がかかるだけでなく、生細胞も必要であり、不活化胞子の定量は不可能です5。ペトロフ・ハウザーチャンバーは別の方法論ですが、それを実行するには経験豊富な顕微鏡技師が必要です。フローサイトメトリーは、この目的に有用な代替手段であることが証明されています。
Genovese et al.12 は、2 つの核酸マーカーと、使用する機器の流量 (体積/分) の高い制御能力を使用して、 Bacillus sp. の生細胞および胞子を定量するためのフローサイトメトリーの使用について説明しました。すべてのサイトメトリー機器が流量(容量/分)を厳密に制御できるわけではなく、最小、中、および最大のオプションでのみ調整できるものもあります。このような場合、カウンティングビーズを使用して、細胞計数の精度と他のフローサイトメトリー装置に対する再現性を確保することができます。この方法により、本研究では、サンプル中の1ミリリットルあたりの胞子数(発芽および休眠)を計算することができました。
胞子集団を列挙し、GodfreyおよびAlsharifの特許10に記載されているパラメータに従って分析した。これらの著者らは、胞子の状態を記述することなく、高価な市販のDNAマーカーを使用することなく、バチルス属菌の発芽段階の分析にこの方法論を使用することを説明しています11,12,13。本稿で記載した研究では、ASを用いて、広く使用され、容易に入手できるマーカーであるEtBrを用いて、2つの胞子集団(休眠中および発芽中)を同定することが可能であった。胞子状態の同定は、発芽した胞子のEtBrへの透過性により可能であった。EtBrで標識されていない胞子の集団は、同じサンプルに同様のサイズのアーチファクトを示す可能性があることを強調することが重要です。この制限は、使用するバッファーを洗浄してろ過することで軽減できます。
ここで説明するFAと組み合わせたEtBr標識ASサンプルのフローサイトメトリー分析により、蛍光タンパク質カップリング(FPC)の定性評価と定量も可能になりました。蛍光標識および結合サンプルの分析は、蛍光発光の損失を避けるために直ちに実施する必要があります。さらに、胞子集団の形態と濃度が結合手順によって影響を受けるかどうかを推測することができ、ドットブロット法では得られないプロセスの全体的な理解を得ることができました。また、Isticatoら15 は、胞子表面のFPCを分析し、カップリングに使用されるタンパク質の種類に応じて、免疫蛍光法とフローサイトメトリーで確認することで、その生存率を実証しました。本明細書において、オートクレーブプロセスは、結合するタンパク質を分解し得るプロテアーゼの不活性化にとって重要であるため、AS11 の使用が結合に好ましいことが観察された。ここで説明する手法は、 枯草菌 KO7株のみを使用して実施され、他の菌株への適用はまだテストされていないことを指摘することが重要です。
胞子の結合能力を段階に応じて比較した文献の報告はありません。ここで紹介した実験では、FAと結合した休眠胞子の割合が高いことが観察されました(EtBr-/FA+)16。対照的に、発芽胞子(EtBr+/FA+)は、その割合が低いにもかかわらず、休眠胞子で観察されたものよりも高いMFIを示しました。他の バチルス 属菌のFA(飽和点)の濃度が高い場合、この挙動を評価するには、さらなる研究を実施する必要があります。
将来的には、枯 草菌 の胞子をワクチンのアジュバントとして使用する研究に、最初に蛍光で標識された標的抗原の結合を評価するために、ここで紹介する方法が利用できる可能性があります。飽和濃度を決定した後、検出された値を免疫に使用するための標的抗原に適用することができます。
したがって、この論文では、フローサイトメトリーを使用して、発芽胞子と休眠胞子の計数と枯 草菌 胞子の蛍光タンパク質カップリングの分析のための実用的で高感度な方法を紹介します。EtBr胞子標識に加えて、定量のためのパラメータとして計数ビーズを使用することで、発芽胞子の精緻な計数と蛍光タンパク質カップリングのパーセンテージ測定が可能になります。この方法は、アジュバントとしての胞子の使用に焦点を当てた研究の開発に役立つはずです。
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Disclosures
著者には開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001 によって部分的に資金提供されました。Governo do Estado do Amazonas Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAMのリソースを使用。Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).著者らは、PDTIS-FIOCRUZの施設を利用したPDTIS-FIOCRUZの技術開発プログラムに感謝する。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (N-hydroxysuccinimide) (NHS) | Sigma | 130672 | |
| Anti-human fluorescent antibody | BioLegend | 501410 | APC anti-human IL-10 |
| Anti-mouse fluorescent antibody | Thermo Scientific | A32723 | Alexa Fluor Plus 488 |
| BD FACSCanto II | BD | Flow cytometer | |
| BD FACSDiva Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva software v 6.x) | BD | 642412 | Quality control reagent |
| BD FACSDiva Software v. 6.1.3 | BD | 643629 | Software |
| Centrifuge MegaFuge 8R | Thermo Scientific | 75007213 | |
| Counting Beads | BD | 340334 | TruCount Tubes |
| Eclipse 80i | Nikon | Fluorescent Microsope | |
| Ethidium Bromide | Ludwig Biotec | ||
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Plastic Microtubes | Eppendorf | ||
| Polystyrene tube | Falcon | 352008 | 5 mL polystyrene tube, 12 x 75 mm, without lid, non-sterile |
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