Summary
פרוטוקול זה מתמקד בשימוש בציטומטריית זרימה וספירת חרוזים כדי לכמת נבגי חיידקים המסומנים באתידיום ברומיד. השיטה יעילה גם לניתוח הצימוד הקוולנטי של חלבונים על פני השטח של נבגים שלמים.
Abstract
הנבגים של Bacillus subtilis כבר הוצעו ליישומים ביוטכנולוגיים ואימונולוגיים שונים; עם זאת, יש צורך הולך וגובר בפיתוח מתודולוגיות המשפרות את הזיהוי של אנטיגנים משותקים על פני השטח של נבגים יחד עם כימות שלהם. ניתוחים מבוססי ציטומטריית זרימה הוצעו בעבר כגישות מהירות, אמינות וספציפיות לאיתור תאים מסומנים של B. subtilis. כאן אנו מציעים להשתמש בציטומטריית זרימה כדי להעריך את יעילות התצוגה של נוגדן פלואורסצנטי (FA) על פני הנבג ולכמת את מספר הנבגים באמצעות ספירת חרוזים.
לשם כך השתמשנו באתידיום ברומיד כסמן דנ"א ובנוגדן עם תווית אלופיקוציאנין (APC), שהוצמד לנבגים, כסמן פני השטח. כימות הנבגים בוצע באמצעות ספירת חרוזים, שכן טכניקה זו מדגימה דיוק גבוה בזיהוי תאים. הנבגים המסומנים נותחו באמצעות ציטומטר זרימה, שאישר את הצימוד. כתוצאה מכך, הוכח כי תיוג DNA שיפר את דיוק הכימות על ידי ציטומטריית זרימה, לזיהוי נבגים מונבטים. נצפה כי אתידיום ברומיד לא היה מסוגל לתייג נבגים רדומים; עם זאת, טכניקה זו מספקת קביעה מדויקת יותר של מספר הנבגים עם חלבון פלואורסצנטי המצומד לפני השטח שלהם, ובכך מסייעת בפיתוח מחקרים המתמקדים בשימוש בנבגים כפלטפורמה ביוטכנולוגית ביישומים שונים.
Introduction
Bacillus subtilis הוא חיידק גראם-חיובי בצורת מוט המסוגל לייצר נבגים שקטים כאשר תנאי הסביבה אינם מאפשרים צמיחת תאים1. נבגים הם צורות תאים יציבות ביותר ואלה של כמה מינים, כולל B. subtilis, נמצאים בשימוש נרחב כפרוביוטיקה לשימוש בני אדם ובעלי חיים2. בשל תכונות העמידות והבטיחות שלו, הנבג של B. subtilis, המציג חלבונים הטרולוגיים, הוצע כאדג'ובנט רירי, מערכת אספקת חיסונים, ופלטפורמת אימוביליזציה של אנזימים 3,4.
כדי להשיג נבגים מ B. subtilis, יש צורך לחשוף אותו למחסור תזונתי באמצעות מדיום תרבות מיוחד. לאחר השגת נבגים אלה וטיהורם, יש לכמת אותם כדי לשפר את יעילות הבדיקה 5,6. לפיכך, שיטות מסוימות מיושמות כדי לנתח את ריכוז הנבגים המתקבלים. ניתן להשתמש בספירת לוחות ובתא פטרוף-האוסר, הידוע גם בשם תא ספירה. האחרון פותח במקור כדי לקבוע את ריכוז תאי הדם; עם זאת, ניתן להשתמש בו בתחום המיקרוביולוגיה לספירת נבגים 7,8. למרות היותה השיטה הסטנדרטית המשמשת לספירת תאים, הקריאה מייגעת מכיוון ששיטה זו ידנית לחלוטין והדיוק שלה תלוי בניסיון של המפעיל.
ניתוחים מבוססי ציטומטריה של זרימה (FC) הוצעו בעבר כגישות מהירות, אמינות וספציפיות לזיהוי תאים מסומנים של Bacillus spp. השימוש בציטומטריית זרימה לספירת חרוזים הבטיח יכולת שחזור בספירת תאים בבדיקות שגרתיות (ספירה מוחלטת של לימפוציטים מסוג CD4 ו-CD8 T) ובפיתוח מחקר המערב חלקיקים המסוגלים לגילוי ולספירה באמצעות ציטומטריית זרימה9. גודג'פרי ואלשריף הציעו להשתמש בספירת חרוזים לכימות FC של נבגים לא מסומנים10. השימוש בציטומטריית זרימה תואר לניטור נבגים ב- Bacillus spp. באמצעות תיוג DNA של נבג 10,11,12,13. מחקר נוסף השתמש ב-FC כדי להעריך את כמות החלבונים המסומנים באופן פלואורסצנטי על פני הנבג15.
מחקר זה ביקש להשתמש בחרוזי ספירה מסחריים כדי להבטיח סטנדרט של יכולת שחזור ביחס לספירת אירועים באמצעות ציטומטריית זרימה. כאן, אנו מציעים להשתמש בספירת חרוזים לספירת תאים ב- FC כדי לחדד את ספירת הנבגים ולהעריך את יעילות הצימוד של נוגדנים המסומנים באופן פלואורסצנטי על פני הנבג.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, המכשירים והתוכנות המשמשים בפרוטוקול זה.
1. הגדרת ציטומטריית זרימה
- יישור פרמטרים אופטיים של ציטומטר זרימה המוצמד למחשב
- היכנס לתוכנת Cytometer.
- בסביבת העבודה של התוכנה, בחר Cytometer | הפעלה והמתנה של מספר דקות | מצב נקי | שב נוזלים.
הערה: בועות אוויר וחסימות הוסרו במהלך תהליך התחלת הציטומטר, לפני רכישת הדגימה.
- בקרת איכות
- השתמש בריאגנט בקרת האיכות כדי להתאים את המתחים של צינורות photomultiplier ולהעריך את רגישותם.
- הכן את מגיב בקרת האיכות בצינור פוליסטירן.
- להגדרת קו הבסיס, הכינו את חרוזי התלייה על ידי הוספת 0.5 מ"ל של מדלל (PBS מסונן 10 מ"מ, pH 7) ו -3 טיפות חרוזים לצינור המסומן.
- מערבבים את בקבוקון החרוזים בהיפוך עדין.
- בסביבת העבודה של התוכנה, בחר Cytometer | CST כדי להתחבר לממשק CST. המתינו מספר דקות ושימו לב שציטומטר ההודעה מנותק.
- חבר את צינור הפוליסטירן המכיל את מגיב בקרת האיכות לבדיקת ציטומטר הזרימה.
- השתמש בריאגנט בקרת האיכות כדי להתאים את המתחים של צינורות photomultiplier ולהעריך את רגישותם.
- אימות תצורת הציטומטר
- בחלון סיכום מערכת , בדוק שתצורת הציטומטר מתאימה לניסוי.
- בחר את מזהה אצווה חרוזי ההתקנה המתאים כדי לוודא שמזהה פריט חרוזי ההגדרה שנבחר תואם לכמות הנוכחית של חרוזי מחקר CS&T.
- בדיקת ביצועים
- בחר באפשרות בדוק ביצועים ולחץ על הפעל.
- עם השלמת בדיקת הביצועים, יוצגו תוצאות הביצועים. הצג את דוח ביצועי הציטומטר. לחץ על סיום כדי להשלים את בדיקת הביצועים או הסר את הציטומטר וסקור את התוצאות בחלון סיכום מערכת .
- שימו לב לתוצאה הסופית של ניתוח הרגישות המורפומטרית והפלואורסצנטית שתופיע ב | סיכום מערכת| תוצאת ביצועי ציטומטר| עם המצב: PASSED
2. הכנת הנבגים
- לאחר הנבגים, שטפו את הנבגים 3 פעמים במים קרים כקרח טהורים במיוחד על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 17,949 × גרם למשך 10 דקות.
- להשעות את הגלולה המתקבלת מן הצנטריפוגה האחרונה עם 10 מ"ל של מים טהורים במיוחד.
- Autoclave את הנבגים במשך 45 דקות ב 121 מעלות צלזיוס עבור inactivation של תאים צמחיים.
הערה: בדיקות קודמות שבוצעו על ידי הקבוצה שלנו שהשוו בין שיטות אינאקטיבציה שונות הראו כי התנאים שהוזכרו בשלב 2.3 הציגו יעילות גבוהה, והראו כי לא היווצרות מושבה בשיטת ניתוח הציפוי על מדיום אגר LB.
3. כימות של נבגים אוטוקלאביים באמצעות ציטומטריית זרימה
- קחו 50 מיקרוליטר של נבגים אוטוקלאביים ודגרו עליהם מוגנים מפני אור עם אתידיום ברומיד (EtBr, 10 מ"ג/מ"ל מדולל במים) במקדם דילול של 0.05% v/v למשך 30 דקות (איור 1A).
- יש לשטוף את הנבגים 3x במי מלח חוצצי פוספט (PBS) אחד על ידי צנטריפוגה ב-17,949 × גרם למשך 10 דקות ולהשהות מחדש ב-1x PBS.
- מוסיפים 10 μL חרוזים, בהתאם להמלצות היצרן לדילול.
- נתח את הדגימה באמצעות ציטומטר זרימה כמתואר בשלב 4.
הערה: חשוב להדגיש כי החרוזים צריכים להיות pipeted הומוגני ככל האפשר מאז פערים נצפו בחישובים כאשר שלב זה לא בוצע היטב.
4. ניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה
- היכנס לתוכנת Cytometer.
- בסביבת העבודה של התוכנה, בחר Cytometer | מצב נקי | שב נוזלים.
- התאם לסביבת העבודה כדי לקבוע את הניתוח בציטומטריית זרימה.
- הגדירו את שערי הניתוחים (איור 2).
- הגדירו את אסטרטגיית הגאטינג בהתבסס על המאפיינים המורפומטריים והפלואורסצנטיים של החלקיקים בהתבסס על הבקרה השלילית (נבגים לא מסומנים).
- לקביעת מורפומטריית תאים, בחר גרפיקת Dotplot לניתוח פרמטרי FSC-A בציר x ו- SSC-A בציר y.
- לקביעת פלואורסצנטיות, בחרו תרשימי FL3 Dotplot על ציר y באמצעות FL5 על ציר x וצרו את השערים בארבעה רבעים.
- הגדירו את שערי הניתוחים (איור 2).
- השתמש בשפופרת פוליסטירן עם פקק בגודל 12 x 75 מ"מ המכילה דגימות ללא תווית, שסומנו בעבר עם EtBr בצבע יחיד, APC בצבע יחיד ו- EtBr+ APC צבעוני.
- מערבבים את הצינור בעדינות רבה המכיל את הבקרה השלילית ומחברים אותו לבדיקת ציטומטר הזרימה.
- לחץ על Acquire.
- הגדר את עוצמת הלייזרים על-ידי ניווט אל Cytometer | פרמטרים | FSC (375) ו- SSC (275).
- הגדר את הסף ל- (500) ציטומטר | סף.
- כדי להסיר autofluorescence, לנתח את הדגימה ללא צבע המכיל רק נבגים.
- התאם את המתחים עבור גלאי המסננים: FL3 (603) ו- FL5 (538) כדי להפלות אוכלוסיות שליליות וחיוביות ביחס לפלואורסצנטיות שנבחרה בבקרות. ציטומטר | פרמטרים.
- ציטומטר | פיצוי | הגדר את הסטת ההתקנה של FL5/FL3 ל - 1.0.
- לאחר ניתוח מורפומטריה ופלורסנט, הגדר את המכשיר לרכישת 30,000 אירועים | ניסוי | פריסת ניסוי | רכישה |30,000 אירועים....
- לאחר התאמת הפרמטרים, רכוש נתונים עבור הדגימות המסומנות ומכילות חרוזים בציטומטר הזרימה.
- חישוב ריכוז הנבגים כמתואר בהוראות היצרן באמצעות משוואה (1).
(1)
הערה: במחקר זה, שיטת כימות החרוזים הושוותה לניתוח תא הספירה של פטרוף-האוזר. בנוסף, התיוג של נבגים autoclaved הושווה לתיוג של נבגים שאינם autoclaved.
(1)5. הערכת מדד צימוד החלבונים על משטח נבג באמצעות ציטומטריית זרימה
- קציר על ידי צנטריפוגה של 50 μL של נבגים (103/μL) 17,949 × גרם במשך 10 דקות ולאחר מכן, resuspend עם 25 μL של 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) (300 mM)).
- יש לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- הוסף 25 μL של N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) (50 mM) לתרחיף הנבג ודגור אותו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
- שטפו את הנבגים 3x עם 1x PBS באמצעות צנטריפוגה כמתואר בשלב 5.1.
- מוסיפים חלבון פלואורסצנטי ומשאירים את הדגימות למשך הלילה ב-15°C (75 °F).
הערה: החלבון הפלואורסצנטי ששימש בעבודה זו היה נוגדן IL-10 אנטי-אנושי שכותרתו APC. נוגדן זה שימש כמודל למחקר, אם כי יישום של מולקולות פלואורסצנטיות אחרות אפשרי מכיוון ש- EDC/NHS מקדם קשירה קוולנטית בין קבוצות -COOH ו- NH2 הקיימות בחלבונים על פני הנבג. - יש לשטוף את הנבגים לפי שלב 5.3.
- הוסיפו 10 מ"ג/מ"ל של אתידיום ברומיד מדולל ב-1:50, ואז השאירו שעה אחת על קרח ומוגנים מפני אור (איור 1B).
- יש לשטוף את הנבגים לפי שלב 5.3.
- חזור על שלב 4.
- כדי לקבוע פלואורסצנטיות, שנה את הפרמטרים FL3 בציר X ו- FL5 בציר Y של dotplot.
- נתח את הדגימה באמצעות ציטומטר זרימה עם הלייזר הכחול (488 ננומטר) ב- FL3 (מסנן 670 LP) והלייזר האדום (633 ננומטר) ב- FL5 (מסנן 660/20), כמתואר בשלב 4.
הערה: אותן דגימות נותחו עבור immunofluorescence על שקופיות תחת מיקרוסקופ, בטווח הגדלה של 1,000 x, ובאמצעות המסננים הבאים: FITC 480/30 nm (ירוק) ו- TRITC 540/25 nm (אדום).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בדגימות נבגים אוטוקלאביים (AS), 2 × 103 נבגים/μl ו-1 × 103 נבגים/μl זוהו באמצעות ספירת חרוזים ושיטת Petroff-Hausser, בהתאמה (איור 2).
איור 1: סכמה כללית לכימות נבגים. (A) נבגים המסומנים ב-EtBr ו-(B) נבגים בעלי תווית כפולה. קיצורים: EDC = 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide; NHS = N-hydroxysulfosuccinimide. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ניתוח מורפומטרי ואיכותי של נבג Bacillus subtilis וספירת חרוזים באמצעות ציטומטריית זרימה. כימות נבגי B. subtillis באמצעות ספירת חרוזים (מדגם לא מדולל). קיצורים: FSC-A = אזור פיזור-שיא קדמי; SSC-A = אזור פיזור-שיא צד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
צביעת Ethidium bromide (EtBr) של דגימות נבג אוטוקלאבד (AS) הראתה עוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת גבוהה יותר (MFI) מאשר צביעה של נבגים לא אוטוקלאביים (NAS), ובכך הצביעה על צביעה גדולה יותר של חומר גנטי במצב הראשון. נוסף על כך, נצפה MFI גדול יותר באוכלוסיית ה-EtBr המסומנת כ-AS מאשר באוכלוסיית NAS (איור 3, שיא באדום ושיא בשחור). דגימת הביקורת, שלא סומנה ב-EtBr, לא הראתה פלואורסצנטיות משמעותית (איור 3, שיא מנוקד).
איור 3: היסטוגרמה של נבגי Bacillus subtillis עם תווית אתידיום ברומיד, אוטוקלאבד ולא אוטוקלאב. שיא בתיוג אדום-NAS EtBr; שיא בתיוג שחור-AS EtBr; בקרת שיא מנוקדת ללא תיוג EtBr. קיצורים: EtBr = אתידיום ברומיד; NAS = נבגים לא אוטוקלאביים; AS = נבגים אוטוקלאביים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
בניסויים האלה, MFI על צימוד פני השטח של AS עם נוגדן IL-10 אנטי-אנושי שכותרתו APC הראה יעילות צימוד גבוהה יותר בהשוואה ל-NAS (איור 4). מסיבה זו, הניסויים עם התיוג הכפול בוצעו עם AS. ארבע אוכלוסיות נבגים זוהו בניתוח ציטומטריית הזרימה: EtBr+/FA+; EtBr+/FA-; EtBr-/FA+; EtBr-/FA-. נוכחותם של נבגים חדירים לסמן המולקולרי EtBr מצביעה על נוכחות אפשרית של נבגים מונבטים בכלל האוכלוסייה. ניתן היה לראות זאת לאחר ניתוח הדגימה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (שבאמצעותו ניתן היה לצפות בתיוג EtBr/Fluorescent Anti-mouse Table 8 ובשני הפלואורופורים בנפרד, איור 5). השימוש בשיטת הצביעה של וירץ-קונקלין איפשר הדמיה של קיומם של נבגים בעלי חדירות לספרנין (מוכתמים בוורוד, איור משלים S1). באותו ניתוח נצפו נבגים מוכתמים רק בירוק מלכיט, דבר המעיד על אטימות, כפי שדווח בספרות לנבגים רדומים13. ניתוח הנבגים באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה מציג מספר גבוה יותר של נבגים רדומים בדגימת AS בהשוואה ל-NAS (איור משלים S2)14.
איור 4: עוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת של נוגדנים אנטי-אנושיים IL-10 המסומנים ב-APC בנבגים אוטוקלאביים ולא אוטוקלאביים. קיצורים: FA = נוגדן פלואורסצנטי; APC = allophycocyanin. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הדמיה אימונופלואורסצנטית של נבגים המסומנים ב-EtBr ואנטי-עכבר פלואורסצנטי. (A) נבגים עם חומר גנטי המסומן ב-EtBr (אדום). (B) נבגים עם משטח מסומן באנטי-עכבר פלואורסצנטי (ירוק). (C) נבגים בעלי תווית כפולה, עם EtBr ואנטי-עכבר פלואורסצנטי (כתום). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. קיצורים: EtBr = אתידיום ברומיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
ניתוחי ציטומטריית הזרימה שבוצעו כאן הצביעו על אחוז גבוה יותר של צימוד של FA לנבגים הרדומים (EtBr-/FA+) בהשוואה לנבגים שנבטו (EtBr+/FA+). בגרף המוצג באיור 6A,B, ניתן לראות את העלייה באחוז הנבגים המצומדים וה-MFI ככל שריכוז ה-FA עולה. בנוסף, אוכלוסיות הנבגים שלא התאימו לחלבון הפלואורסצנטי (EtBr+/FA- ו-EtBr-/FA-) הראו ירידה הדרגתית עם העלייה בריכוז FA (טבלה משלימה S1).
איור 6: ניתוח אחוזי צימוד פלואורסצנטי ועוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת של אוכלוסיות EtBr-/FA+ ו-EtBr+/FA. (A) ציר ה-x מייצג את הריכוזים השונים של ה-FA, ציר ה-y השחור מייצג את ה-MFI שזוהה, וציר ה-y האדום מייצג את אחוז הנבגים המסומנים ב-FA מאוכלוסיית EtBr - /FA+. (B) ציר ה-x מייצג את הריכוזים השונים של FA, ציר ה-y השחור מייצג את ה-MFI שזוהה, וציר ה-y האדום מייצג את אחוז הנבגים וה-FA המסומנים ב-EtBr מאוכלוסיית EtBr+/FA+. קיצורים: MFI = עוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת; EtBr = אתידיום ברומיד; FA = נוגדן פלואורסצנטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים S1: תמונה מיקרוסקופית של נבגי B. subtilis אוטוקלאביים מוכתמים במתודולוגיית וירץ-קונקלין. נבגים מוכתמים בוורוד הם נבגים מונבטים (חדירים לספרנין). בירוק הם נבגים רדומים (בלתי חדירים לספרנין). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
איור משלים S2: השוואה בין תמונות במיקרוסקופ ניגודיות פאזה של נבגי B. subtilis אוטוקלאביים ולא אוטוקלאביים. (א,ב) תמונות של נבגי B. subtilis לפני ואחרי הטיפול האוטוקלאבי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה S1: ערכים של אחוזי הנבגים המסומנים, או לא, עם נוגדנים פלואורסצנטיים ואתידיום ברומיד, בריכוזי FA שונים, שנצפו בציטומטריית זרימה. קיצורים: EtBr = אתידיום ברומיד; FA = נוגדן פלואורסצנטי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטות מסורתיות, כגון ספירת לוחות של מושבות, אינן רק גוזלות זמן, אלא גם זקוקות לתאים בני קיימא ואינן מאפשרות כימות של נבגים בלתי פעילים5. תא פטרוף-האוזר הוא מתודולוגיה חלופית, אך נדרש מיקרוסקופיסט מנוסה כדי לבצע אותה. ציטומטריית זרימה הוכחה כחלופה שימושית למטרה זו.
Genovese et al.12 תיארו את השימוש בציטומטריית זרימה לכימות תאים ונבגים בני קיימא של Bacillus sp. באמצעות שני סמנים של חומצות גרעין ויכולת בקרה גבוהה של קצב הזרימה (נפח / דקה) של הציוד המשמש, המספק את האפשרות לקבוע את הכמות המספרית שיש להגדיר. לא לכל ציוד הציטומטריה יש שליטה קפדנית על קצב הזרימה (נפח/דקות), וחלקם ניתנים לכוונון רק באפשרויות המינימום, הבינוני והמקסימום. במקרים אלה, ספירת חרוזים יכולה לשמש כדי להבטיח את הדיוק של ספירת תאים ויכולת שחזור מול ציוד ציטומטריית זרימה אחרים. באמצעות שיטה זו, במחקר זה, ניתן היה לחשב את מספר הנבגים (מונבטים ורדומים) למיליליטר בדגימות.
אוכלוסיית הנבגים נמנתה ונותחה על פי הפרמטרים המתוארים בפטנט10 של גודפרי ואלשריף. מחברים אלה מתארים את השימוש במתודולוגיה זו לניתוח שלבי הנביטה של Bacillus spp. מבלי לתאר את מצב הנבג ולהשתמש בסמני DNA מסחריים בעלות גבוהה 11,12,13. בעבודה המתוארת כאן, באמצעות AS, ניתן היה לזהות שתי אוכלוסיות של נבגים (רדומים ונביטים) באמצעות EtBr, שהוא סמן נפוץ ונגיש. זיהוי מצב הנבגים התאפשר בשל חדירות הנבגים לאטבר. חשוב להדגיש כי אוכלוסיית הנבגים שאינם מסומנים ב- EtBr עשויה להציג ממצאים בגודל דומה באותה מדגם. ניתן להקל על מגבלה זו על ידי שטיפה וסינון של המאגרים בהם נעשה שימוש.
ניתוח ציטומטריית הזרימה של דגימות AS המסומנות ב- EtBr יחד עם FA המתואר כאן אפשרו גם הסמכה וכימות של צימוד חלבון פלואורסצנטי (FPC). ניתוח של דגימות מסומנות פלואורסצנטית ומצומדות צריך להתבצע באופן מיידי כדי למנוע אובדן פליטה פלואורסצנטית. יתר על כן, ניתן היה להסיק אם המורפולוגיה והריכוז של אוכלוסיית הנבגים הושפעו מהליך הצמידה, מה שנותן הבנה כוללת של התהליך, שאינה מתקבלת בעת שימוש בשיטת כתם הנקודה. Isticato et al.15 ניתחו גם FPC על פני הנבג והראו את כדאיותו על ידי אישורו עם ציטומטריית אימונופלואורסנציה וזרימה, בהתאם לסוג החלבון המשמש לצימוד. כאן, נצפה כי השימוש ב- AS11 עדיף לצימוד מכיוון שתהליך האוטוקלאבינג חשוב לנטרול של פרוטאזות שעלולות לפגוע בחלבון המצומד. חשוב לציין כי הטכניקות המתוארות כאן בוצעו באמצעות זן B. subtilis KO7 בלבד, כאשר היישום בזנים אחרים עדיין נבדק.
אין דיווחים בספרות המשווים את יכולת הצימוד של נבגים על פי השלב שלהם. בניסויים שהוצגו כאן, נצפה אחוז גבוה יותר של נבגים רדומים בשילוב עם FA (EtBr-/FA+)16. לעומת זאת, נבגים שנבטו (EtBr+/FA+), למרות האחוז הנמוך שלהם, הראו MFI גבוה יותר ממה שנצפה בנבגים הרדומים. מחקרים נוספים צריכים להתבצע כדי להעריך התנהגות זו עבור ריכוזים גבוהים יותר של FA (נקודת רוויה) ב Bacillus spp אחרים.
עבור יישומים עתידיים, השיטה המוצגת כאן יכולה לשמש במחקרים על השימוש בנבגי B. subtilis כאדג'ובנט חיסון, הערכת הצימוד של אנטיגן מטרה שסומן בתחילה על ידי פלואורסצנטיות. לאחר קביעת ריכוז הרוויה, ניתן להחיל את הערך שזוהה על אנטיגן היעד לשימוש בחיסונים.
לפיכך, מאמר זה מציג שיטה מעשית ורגישה לספירת נבגים מונבטים ורדומים ולניתוח צימוד חלבונים פלואורסצנטיים של נבגי Bacillus subtilis באמצעות ציטומטריית זרימה. השימוש בספירת חרוזים כפרמטר לכימות, בנוסף לסימון נבגי EtBr, מאפשר ספירה מעודנת של נבגים מונבטים וקביעת אחוזים של צימוד חלבון פלואורסצנטי. שיטה זו אמורה לסייע בפיתוח מחקרים המתמקדים בשימוש בנבגים כאדג'ובנט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה מומן בחלקו על ידי Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001; Governo do Estado do Amazonas עם משאבים מ Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). המחברים מודים לתוכנית לפיתוח טכנולוגי בכלים לבריאות PDTIS-FIOCRUZ על השימוש במתקניה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (N-hydroxysuccinimide) (NHS) | Sigma | 130672 | |
| Anti-human fluorescent antibody | BioLegend | 501410 | APC anti-human IL-10 |
| Anti-mouse fluorescent antibody | Thermo Scientific | A32723 | Alexa Fluor Plus 488 |
| BD FACSCanto II | BD | Flow cytometer | |
| BD FACSDiva Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva software v 6.x) | BD | 642412 | Quality control reagent |
| BD FACSDiva Software v. 6.1.3 | BD | 643629 | Software |
| Centrifuge MegaFuge 8R | Thermo Scientific | 75007213 | |
| Counting Beads | BD | 340334 | TruCount Tubes |
| Eclipse 80i | Nikon | Fluorescent Microsope | |
| Ethidium Bromide | Ludwig Biotec | ||
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Plastic Microtubes | Eppendorf | ||
| Polystyrene tube | Falcon | 352008 | 5 mL polystyrene tube, 12 x 75 mm, without lid, non-sterile |
References
- McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis endospore: assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews. Microbiology. 11 (1), 33-44 (2013).
- Cutting, S. M.
- Ricca, E., Baccigalupi, L., Cangiano, G., De Felice, M., Isticato, R. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).
- Falahati-Pour, S. K., Lotfi, A. S., Ahmadian, G., Baghizadeh, A. Covalent immobilization of recombinant organophosphorus hydrolase on spores of Bacillus subtilis. Journal of Applied Microbiology. 118 (4), 976-988 (2015).
- Harrold, Z., Hertel, M., Gorman-Lewis, D. Optimizing Bacillus subtilis spore isolation and quantifying spore harvest purity. Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 325-329 (2011).
- Nicholson, W. L., Setlow, P. Sporulation, germination and outgrowth. Molecular biological methods for Bacillus. , John Wiley and Sons, Chichester, UK. (1990).
- Mora-Uribe, P., et al. Characterization of the adherence of Clostridium difficile spores: the integrity of the outermost layer affects adherence properties of spores of the epidemic strain R20291 to components of the intestinal mucosa. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 99 (2016).
- Paidhungat, M., Setlow, P. Role of ger proteins in nutrient and nonnutrient triggering of spore germination in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 182 (9), 2513-2519 (2000).
- Schnizlein-Bick, C., Spritzler, J., Wilkening, C., Nicholson, J., O'Gorman, M. Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Site Investigators and The NIAID DAIDS New Technologies Evaluation Group. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 7 (3), 336-343 (2000).
- Rapid enumeration of viable spores by flow cytometry. US Patent. Godfrey, A., Alsharif, R. , US20040023319A1 https://patentimages.storage.googleapis.com/fa/3c/dc/9e08d9ecd1b315/US20040023319A1.pdf (2003).
- Karava, M., Bracharz, F., Kabisch, J. Quantification and isolation of Bacillus subtilis spores using cell sorting and automated gating. PLoS ONE. 14 (7), e021989 (2019).
- Genovese, M., Poulain, E., Doppler, F., Toussaint, R., Boyer, M. Bacillus spore enumeration using flow cytometry: A proof of concept for probiotic application. Journal of Microbiological Methods. 190, 106336 (2021).
- Trunet, C., Ngo, H., Coroller, L. Quantifying permeabilization and activity recovery of Bacillus spores in adverse conditions for growth. Food Microbiology. 81, 115-120 (2019).
- Tehri, N., Kumar, N., Raghu, H., Vashishth, A.
- Isticato, R., Ricca, E., Baccigalupi, L. Spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens. Journal of Visualized Experiments. 145, e59102 (2019).
- Song, M., et al. Killed Bacillus subtilis spores as a mucosal adjuvant for an H5N1 vaccine. Vaccine. 30 (22), 3266-3277 (2012).
