Summary
Denne protokollen fokuserer på bruk av flowcytometri og telling av perler for å kvantifisere bakteriesporer merket med ethidiumbromid. Metoden er også effektiv for å analysere den kovalente koblingen av proteiner på overflaten av intakte sporer.
Abstract
Sporer av Bacillus subtilis har allerede blitt foreslått for ulike bioteknologiske og immunologiske applikasjoner; Imidlertid er det et økende behov for utvikling av metoder som forbedrer deteksjonen av antigener immobilisert på overflaten av sporer sammen med deres kvantifisering. Flowcytometribaserte analyser har tidligere blitt foreslått som raske, pålitelige og spesifikke tilnærminger for å oppdage merkede celler av B. subtilis. Her foreslår vi bruk av flowcytometri for å evaluere visningseffektiviteten til et fluorescerende antistoff (FA) på overflaten av sporen og kvantifisere antall sporer ved hjelp av tellekuler.
For dette brukte vi ethidiumbromid som DNA-markør og et allophycocyanin (APC)-merket antistoff, som ble koblet til sporene, som en overflatemarkør. Kvantifiseringen av sporer ble utført ved hjelp av telleperler, siden denne teknikken viser høy nøyaktighet i deteksjon av celler. De merkede sporene ble analysert ved hjelp av et strømningscytometer, som bekreftet koblingen. Som et resultat ble det demonstrert at DNA-merking forbedret nøyaktigheten av kvantifisering ved flowcytometri, for påvisning av spiresporer. Det ble observert at ethidiumbromid ikke var i stand til å merke sovende sporer; Imidlertid gir denne teknikken en mer presis bestemmelse av antall sporer med fluorescerende protein koblet til overflaten, og bidrar dermed til utvikling av studier som fokuserer på bruk av sporer som en bioteknologisk plattform i forskjellige applikasjoner.
Introduction
Bacillus subtilis er en stavformet, gram-positiv bakterie som er i stand til å produsere hvilesporer når miljøforholdene ikke tillater cellevekst1. Sporer er ekstremt stabile celleformer, og de av flere arter, inkludert B. subtilis, er mye brukt som probiotika for mennesker og dyrbruk 2. På grunn av dens motstand og sikkerhetsegenskaper har sporen av B. subtilis, som viser heterologe proteiner, blitt foreslått som en slimhinneadjuvans, et vaksineleveringssystem og en enzymimmobiliseringsplattform 3,4.
For å oppnå sporer fra B. subtilis, er det nødvendig å utsette det for næringsmangel ved hjelp av et spesielt kulturmedium. Etter å ha oppnådd og renset disse sporene, må man kvantifisere dem for å forbedre testeffektiviteten 5,6. Dermed brukes visse metoder for å analysere konsentrasjonen av sporene som er oppnådd. Platetelling og et Petroff-Hausser-kammer, også kjent som et tellekammer, kan brukes. Sistnevnte ble opprinnelig utviklet for å bestemme konsentrasjonen av blodceller; Det er imidlertid mulig å bruke det innen mikrobiologi for sporetall 7,8. Til tross for at det er standardmetoden som brukes til celletelling, er lesing arbeidskrevende siden denne metoden er helt manuell og nøyaktigheten avhenger av operatørens erfaring.
Flowcytometribaserte (FC) analyser har tidligere blitt foreslått som raske, pålitelige og spesifikke tilnærminger for å oppdage merkede celler av Bacillus spp. Bruk av flowcytometritellende perler har garantert reproduserbarhet i celletelling ved rutineundersøkelser (absolutt telling av CD4- og CD8 T-lymfocytter) og i utviklingen av forskning som involverer partikler som kan detekteres og telles ved hjelp av flowcytometri9. Godjafrey og Alsharif foreslo bruk av telleperler for FC kvantifisering av umerkede sporer10. Bruk av flowcytometri ble beskrevet for monitorering av sporulering i Bacillus spp. via merking av sporens DNA 10,11,12,13. Enda en studie brukte FC til å evaluere mengden fluorescerende merkede proteiner på sporeoverflaten15.
Denne studien søkte å bruke kommersielle tellekuler for å sikre en standard for reproduserbarhet med hensyn til hendelsestelling ved bruk av flowcytometri. Her foreslår vi bruk av tellekuler for celletelling i FC for å avgrense sporeoppregning og evaluere koblingseffektiviteten til fluorescerende merkede antistoffer på sporeoverflaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer, instrumenter og programvare som brukes i denne protokollen.
1. Innstilling av flowcytometri
- Justering av optiske parametere for flowcytometer koblet til en datamaskin
- Logg deg på Cytometer programvare.
- Fra programvarearbeidsområdet velger du Cytometer | Oppstart og vent noen minutter | Rengjør modus | Sitt væsker.
MERK: Luftbobler og hindringer ble fjernet under cytometerinitieringsprosessen, før prøveinnsamling.
- Kvalitetskontroll
- Bruk kvalitetskontrollreagenset til å justere spenningene til fotomultiplikatorrørene og evaluere følsomheten.
- Forbered kvalitetskontrollreagenset i et polystyrenrør.
- For å definere grunnlinjen, klargjør suspensjonskulene ved å tilsette 0,5 ml fortynningsmiddel (10 mM filtrert PBS, pH 7) og 3 dråper perler til det merkede røret.
- Bland hetteglasset med perle med forsiktig invertering.
- Fra programvarearbeidsområdet velger du Cytometer | CST for å koble til CST-grensesnittet. Vent noen minutter og observer meldingen cytometer frakoblet.
- Fest polystyrenrøret som inneholder kvalitetskontrollreagenset til strømningscytometersonden.
- Bruk kvalitetskontrollreagenset til å justere spenningene til fotomultiplikatorrørene og evaluere følsomheten.
- Verifikasjon av konfigurasjonen av cytometeret
- I vinduet Systemsammendrag kontrollerer du at cytometerkonfigurasjonen passer for eksperimentet.
- Velg batch-ID-en for oppsettperler som tilsvarer for å bekrefte at ID-en for oppsettperlepartiet som er valgt, samsvarer med gjeldende parti for CS&T-forskningsperler.
- Kontroll av ytelse
- Velg alternativet Kontroller ytelse og klikk Kjør.
- Når ytelseskontrollen er fullført, vises ytelsesresultatene. Se Cytometer Performance Report. Klikk enten på Fullfør for å fullføre ytelseskontrollen, eller fjern slangen fra cytometeret og se gjennom resultatene i vinduet Systemsammendrag .
- Observer det endelige resultatet av den morfometriske og fluorescensfølsomhetsanalysen som vil vises i | systemsammendrag| cytometerytelsesresultat| med status: BESTÅTT
2. Fremstilling av sporene
- Etter sporulering skylles sporene 3x med ultrarent iskaldt vann ved sentrifugering ved 17 949 × g i 10 min.
- Resuspender pelleten oppnådd fra den siste sentrifugeringen med 10 ml ultrarent vann.
- Autoklav sporene i 45 minutter ved 121 ºC for inaktivering av vegetative celler.
MERK: Tidligere tester utført av vår gruppe som sammenlignet forskjellige inaktiveringsmetoder, viste at forholdene nevnt i trinn 2.3 presenterte høy effektivitet, og viste ingen kolonidannelse i pletteringsanalysemetoden på LB-agarmediet.
3. Kvantifisering av autoklaverte sporer ved hjelp av flowcytometri
- Ta 50 μl autoklaverte sporer og inkuber dem beskyttet mot lys med ethidiumbromid (EtBr, 10 mg/ml fortynnet i vann) ved en fortynningsfaktor på 0,05 % v/v i 30 minutter (figur 1A).
- Vask sporene 3x med 1x fosfatbufret saltvann (PBS) ved sentrifugering ved 17 949 × g i 10 minutter og resuspender i 1x PBS.
- Tilsett 10 μL perler, i henhold til produsentens anbefalinger for fortynning.
- Analyser prøven ved hjelp av et flowcytometer som beskrevet i trinn 4.
MERK: Det er viktig å understreke at kulene skal pipetteres så homogent som mulig, siden ulikheter ble observert i beregningene når dette trinnet ikke ble godt utført.
4. Analyse med flowcytometri
- Logg deg på Cytometer programvare.
- Fra programvarearbeidsområdet velger du Cytometer | Rengjør modus | Sitt væsker.
- Juster til arbeidsområdet for å bestemme analysen i flowcytometri.
- Definer portene for analysene (figur 2).
- Definer gating-strategien basert på partiklenes morfometriske og fluorescensegenskaper basert på den negative kontrollen (umerkede sporer).
- For å bestemme cellemorfometri, velg Dotplot-grafikk for analyser av FSC-A-parametere på x-aksen og SSC-A på y-aksen.
- For å bestemme fluorescens, velg FL3 Dotplot-plott på y-aksen ved hjelp av FL5 på x-aksen og opprett portene i fire kvadranter.
- Definer portene for analysene (figur 2).
- Bruk et 12 x 75 mm stoppet polystyrenrør som inneholder umerkede prøver, tidligere merket med ensfarget EtBr, ensfarget APC og flerfarget EtBr + APC.
- Bland røret veldig forsiktig som inneholder den negative kontrollen og fest den til strømningscytometersonden.
- Klikk på Hent.
- Still inn kraften til laserne ved å navigere til Cytometer | Parametere | FSC (375) og SSC (275).
- Sett terskelen til (500) Cytometer | Terskel.
- For å fjerne autofluorescens, analyser den fargestofffrie prøven som bare inneholder sporer.
- Juster spenningene for filterdetektorene: FL3 (603) og FL5 (538) for å diskriminere negative og positive populasjoner med hensyn til den valgte fluorescensen i kontrollene. Cytometer | Parametere.
- Cytometer | Kompensasjon | Sett FL5/FL3-oppsettforskyvning til 1.0.
- Etter morfometri og fluorescerende analyse, konfigurer enheten for Acquisition 30 000 hendelser | Eksperiment | Eksperiment-oppsettet | Oppkjøp |30.000 arrangementer ....
- Etter justering av parametrene, samle inn data for prøvene som er merket og inneholder perler i flowcytometeret.
- Beregn sporekonsentrasjon som beskrevet i produsentens instruksjoner ved hjelp av ligning (1).
(1)
MERK: For denne studien ble dråpekvantifiseringsmetoden sammenlignet med Petroff-Hausser tellekammeranalyse. I tillegg ble merkingen av autoklaverte sporer sammenlignet med merking av ikke-autoklaverte sporer.
(1)5. Estimering av proteinkoblingsindeksen på sporeoverflaten ved hjelp av flowcytometri
- Høst ved sentrifugering av 50 μL sporer (103/μL) 17 949 × g i 10 minutter og deretter resuspenderes med 25 μL 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (EDC) (300 mM)).
- Inkuber i 15 min ved romtemperatur.
- Tilsett 25 μL N-hydroksysulfosuccinimid (NHS) (50 mM) til sporesuspensjonen og inkuber den ved romtemperatur i 30 minutter.
- Vask sporene 3x med 1x PBS ved sentrifugering som beskrevet i trinn 5.1.
- Tilsett fluorescerende protein og la prøvene stå over natten ved 15 °C.
MERK: Det fluorescerende proteinet som ble brukt i dette arbeidet var et APC-merket anti-humant IL-10-antistoff. Dette antistoffet ble brukt som en modell for studier, selv om anvendelsen av andre fluorescerende molekyler er mulig siden EDC / NHS fremmer en kovalent ligering mellom -COOH og -NH2-grupper tilstede i proteiner på sporeoverflaten. - Vask sporene i henhold til trinn 5.3.
- Tilsett 10 mg/ml ethidiumbromid fortynnet ved 1:50, la det deretter ligge i 1 time på is og beskyttet mot lys (figur 1B).
- Vask sporene i henhold til trinn 5.3.
- Gjenta trinn 4.
- For å bestemme fluorescens, endre parametrene FL3 på X-aksen og FL5 på Y-aksen til prikkplottet.
- Analyser prøven ved hjelp av et flowcytometer med den blå laseren (488 nm) ved FL3 (670 LP-filteret) og den røde laseren (633 nm) i FL5 (660/20-filter), som beskrevet i trinn 4.
MERK: De samme prøvene ble analysert for immunfluorescens på lysbilder under et mikroskop, ved et forstørrelsesområde på 1000 x, og ved hjelp av følgende filtre: FITC 480/30 nm (grønn) og TRITC 540/25 nm (rød).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I autoklaverte spore (AS)-prøver ble det påvist 2 × 103 sporer/μl og 1 × 103 sporer/μl med henholdsvis tellekuler og Petroff-Hausser-metoden (figur 2).
Figur 1: Generelt skjema for kvantifisering av sporer. (A) Sporer merket med EtBr og (B) dobbeltmerkede sporer. Forkortelser: EDC = 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid; NHS = N-hydroksysulfosuccinimid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Morfometrisk og kvalitativ analyse av spore- og tellekuler av Bacillus subtilis med flowcytometri. Kvantifisering av B. subtillis sporer ved bruk av tellekuler (ufortynnet prøve). Forkortelser: FSC-A = fremover scatter-peak område; SSC-A = side scatter-peak område. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Ethidiumbromid (EtBr)-farging av autoklaverte sporeprøver (AS) viste høyere gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) enn farging av ikke-autoklaverte sporer (NAS), noe som indikerer større farging av genetisk materiale i første tilstand. I tillegg ble det observert en større MFI i den EtBr-merkede AS-populasjonen enn i NAS-populasjonen (figur 3, topp i rødt og topp i svart). Kontrollprøven, som ikke var merket med EtBr, viste ikke signifikant fluorescens (figur 3, stiplet topp).
Figur 3: Histogram av ethidiumbromidmerkede, autoklaverte og ikke-autoklaverte Bacillus subtillissporer . Topp i rød-NAS EtBr-merking; topp i svart-AS EtBr-merking; prikket toppkontroll uten EtBr-merking. Forkortelser: EtBr = ethidiumbromid; NAS = ikke-autoklavede sporer; AS = autoklaverte sporer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
I disse forsøkene viste MFI på AS-overflatekoblingen med APC-merket anti-humant IL-10-antistoff større koblingseffektivitet sammenlignet med NAS (figur 4). Av denne grunn ble de dobbeltmerkede eksperimentene utført med AS. Fire sporepopulasjoner ble identifisert i flowcytometrianalysen: EtBr+/FA+; EtBr+/FA-; EtBr-/FA+; EtBr-/FA-. Tilstedeværelsen av sporer som er gjennomtrengelige for molekylmarkøren EtBr indikerer mulig tilstedeværelse av spiresporer i totalpopulasjonen. Dette kunne observeres etter analyse av prøven ved hjelp av fluorescensmikroskopi (der det var mulig å observere EtBr/Fluorescent Anti-mouse tabell 8-merkingen og begge fluoroforene hver for seg, figur 5). Bruk av Wirtz-Conklin-fargemetoden tillot visualisering av eksistensen av sporer med permeabilitet for safranin (farget i rosa, tilleggsfigur S1). I den samme analysen ble sporer farget bare med malakittgrønn observert, noe som indikerer ugjennomtrengelighet, som rapportert i litteraturen for sovende sporer13. Sporeanalysen ved fasekontrastmikroskopi viser et høyere antall sovende sporer i AS-utvalget sammenlignet med NAS (tilleggsfigur S2)14.
Figur 4: Gjennomsnittlig fluorescensintensitet av APC-merkede anti-humane IL-10-antistoffer i autoklaverte og ikke-autoklaverte sporer. Forkortelser: FA = fluorescerende antistoff; APC = allofykocyanin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Immunfluorescensavbildning av sporer merket med EtBr og fluorescerende antimus. (A) Sporer med genetisk materiale merket med EtBr (rød). (B) Sporer med overflate merket med fluorescerende antimus (grønn). (C) Dobbeltmerkede sporer, med EtBr og fluorescerende antimus (oransje). Skala bar = 10 μm. Forkortelser: EtBr = ethidiumbromid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Flowcytometrianalysene som ble utført her, indikerte en høyere andel kobling av FA til de sovende sporene (EtBr-/FA+) sammenlignet med spiresporer (EtBr+/FA+). I grafen vist i figur 6A,B kan økningen i prosentandelen koblede sporer og MFI observeres når konsentrasjonen av FA øker. I tillegg viste populasjonene av disse sporene som ikke paret seg med det fluorescerende proteinet (EtBr+/FA- og EtBr-/FA-) en gradvis reduksjon med økningen i konsentrasjonen av FA (tilleggstabell S1).
Figur 6: Fluorescenskoblingsprosentanalyse og gjennomsnittlig fluorescensintensitet for populasjonene EtBr-/FA+ og EtBr+/FA. (A) X-aksen representerer de forskjellige konsentrasjonene av FA, den svarte y-aksen representerer den oppdagede MFI, og den røde y-aksen representerer prosentandelen av FA-merkede sporer fra EtBr-/FA+-populasjonen. (B) X-aksen representerer de forskjellige konsentrasjonene av FA, den svarte y-aksen representerer den oppdagede MFI, og den røde y-aksen representerer prosentandelen av EtBr-merkede sporer og FA fra EtBr + / FA + -populasjonen. Forkortelser: MFI = gjennomsnittlig fluorescensintensitet; EtBr = ethidiumbromid; FA = fluorescerende antistoff. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur S1: Mikroskopibilde av autoklaverte B. subtilissporer farget etter Wirtz-Conklin-metodikk. Sporer farget rosa er spiresporer (gjennomtrengelige for safranin). I grønt er sovende sporer (ugjennomtrengelig for safranin). Skala bar = 10 μm. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S2: Sammenligning av fasekontrastmikroskopibilder av autoklaverte og ikke-autoklaverte B. subtilissporer . (A,B) Bilder av B. subtilis sporer før og etter autoklavbehandlingen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende tabell S1: Verdier av prosentandelen av sporer merket, eller ikke, med fluorescerende antistoff og ethidiumbromid, i forskjellige FA-konsentrasjoner, observert i flowcytometri. Forkortelser: EtBr = ethidiumbromid; FA = fluorescerende antistoff. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tradisjonelle metoder, som platetelling av kolonier, er ikke bare tidkrevende, men trenger også levedyktige celler og tillater ikke kvantifisering av inaktiverte sporer5. Petroff-Hausser-kammeret er en alternativ metodikk, men det krever en erfaren mikroskopist for å utføre den. Flowcytometri har vist seg å være et nyttig alternativ til dette formålet.
Genovese et al.12 beskrev bruken av flowcytometri for kvantifisering av levedyktige celler og sporer av Bacillus sp. ved bruk av to nukleinsyremarkører og høy kontrollkapasitet av strømningshastigheten (volum / minutt) av utstyret som brukes, som gir muligheten til å bestemme den numeriske mengden som skal konfigureres. Ikke alt cytometriutstyr har streng kontroll over strømningshastigheten (volum/minutter), og noen kan bare justeres i minimums-, medium- og maksimumsalternativene. I disse tilfellene kan tellekuler brukes til å sikre nøyaktigheten av celleopptelling og reproduserbarhet mot annet flowcytometriutstyr. Via denne metoden, i denne studien, var det mulig å beregne antall sporer (spiret og sovende) per milliliter i prøvene.
Sporepopulasjonen ble oppregnet og analysert i henhold til parametrene beskrevet i Godfrey og Alsharifs patent10. Disse forfatterne beskriver bruken av denne metoden for analyse av spiringsstadiene av Bacillus spp. uten å beskrive sporens tilstand og bruke kostbare kommersielle DNA-markører 11,12,13. I arbeidet beskrevet her, ved hjelp av AS, var det mulig å identifisere to populasjoner av sporer (sovende og spirete) ved hjelp av EtBr, som er en mye brukt og lett tilgjengelig markør. Identifiseringen av sporetilstanden var mulig på grunn av permeabiliteten til de spirede sporene til EtBr. Det er viktig å fremheve at populasjonen av sporer som ikke er merket med EtBr, kan presentere gjenstander av tilsvarende størrelse i samme prøve. Denne begrensningen kan reduseres ved å vaske og filtrere bufferne som brukes.
Flowcytometrianalysen av EtBr-merkede AS-prøver kombinert med FA beskrevet her tillot også kvalifisering og kvantifisering av fluorescerende proteinkobling (FPC). Analyse av fluorescerende merkede og koblede prøver bør utføres umiddelbart for å unngå tap av fluorescensutslipp. Videre var det mulig å utlede om sporepopulasjonens morfologi og konsentrasjon ble påvirket av konjugasjonsprosedyren, noe som gir en samlet forståelse av prosessen, som ikke oppnås ved bruk av dot-blot-metoden. Isticato et al.15 analyserte også FPC på sporeoverflaten og demonstrerte dens levedyktighet ved å bekrefte den med immunfluorescens og flowcytometri, avhengig av hvilken type protein som brukes til kobling. Her ble det observert at bruk av AS11 er å foretrekke for kobling siden autoklaveringsprosessen er viktig for inaktivering av proteaser som kan nedbryte proteinet som skal kobles. Det er viktig å påpeke at teknikkene beskrevet her ble utført ved bruk av bare B. subtilis KO7-stammen, med applikasjonen i andre stammer som fortsatt skal testes.
Det er ingen rapporter i litteraturen som sammenligner koblingskapasiteten til sporer i henhold til deres stadium. I forsøkene som presenteres her, ble det observert en høyere prosentandel av sovende sporer kombinert med FA (EtBr-/FA+)16. I motsetning til dette viste spiresporer (EtBr + / FA +), til tross for deres lavere prosentandel, en høyere MFI enn det som ble observert i de sovende sporer. Videre studier må utføres for å evaluere denne oppførselen for høyere konsentrasjoner av FA (metningspunkt) i andre Bacillus spp.
For fremtidige applikasjoner kan metoden som presenteres her brukes i studier om bruk av B. subtilis sporer som vaksineadjuvans, og evaluere koblingen av et målantigen som opprinnelig ble merket med fluorescens. Etter å ha bestemt metningskonsentrasjonen, kan den detekterte verdien påføres målantigenet for bruk i immuniseringer.
Dermed presenterer dette papiret en praktisk og sensitiv metode for oppregning av spirede og sovende sporer og analyse av fluorescerende proteinkobling av Bacillus subtilis sporer ved bruk av flowcytometri. Bruken av tellekuler som en parameter for kvantifisering, i tillegg til EtBr-sporemerkingen, tillater en raffinert telling av spiresporer og prosentvis bestemmelse av fluorescerende proteinkobling. Denne metoden skal bidra til utvikling av studier som fokuserer på bruk av sporer som hjelpestoff.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Denne studien ble delvis finansiert av Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001; Governo do Estado do Amazonas med ressurser fra Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Forfatterne takker Program for teknologisk utvikling i verktøy for helse PDTIS-FIOCRUZ for bruk av sine fasiliteter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (N-hydroxysuccinimide) (NHS) | Sigma | 130672 | |
| Anti-human fluorescent antibody | BioLegend | 501410 | APC anti-human IL-10 |
| Anti-mouse fluorescent antibody | Thermo Scientific | A32723 | Alexa Fluor Plus 488 |
| BD FACSCanto II | BD | Flow cytometer | |
| BD FACSDiva Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva software v 6.x) | BD | 642412 | Quality control reagent |
| BD FACSDiva Software v. 6.1.3 | BD | 643629 | Software |
| Centrifuge MegaFuge 8R | Thermo Scientific | 75007213 | |
| Counting Beads | BD | 340334 | TruCount Tubes |
| Eclipse 80i | Nikon | Fluorescent Microsope | |
| Ethidium Bromide | Ludwig Biotec | ||
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Plastic Microtubes | Eppendorf | ||
| Polystyrene tube | Falcon | 352008 | 5 mL polystyrene tube, 12 x 75 mm, without lid, non-sterile |
References
- McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis endospore: assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews. Microbiology. 11 (1), 33-44 (2013).
- Cutting, S. M.
- Ricca, E., Baccigalupi, L., Cangiano, G., De Felice, M., Isticato, R. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).
- Falahati-Pour, S. K., Lotfi, A. S., Ahmadian, G., Baghizadeh, A. Covalent immobilization of recombinant organophosphorus hydrolase on spores of Bacillus subtilis. Journal of Applied Microbiology. 118 (4), 976-988 (2015).
- Harrold, Z., Hertel, M., Gorman-Lewis, D. Optimizing Bacillus subtilis spore isolation and quantifying spore harvest purity. Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 325-329 (2011).
- Nicholson, W. L., Setlow, P. Sporulation, germination and outgrowth. Molecular biological methods for Bacillus. , John Wiley and Sons, Chichester, UK. (1990).
- Mora-Uribe, P., et al. Characterization of the adherence of Clostridium difficile spores: the integrity of the outermost layer affects adherence properties of spores of the epidemic strain R20291 to components of the intestinal mucosa. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 99 (2016).
- Paidhungat, M., Setlow, P. Role of ger proteins in nutrient and nonnutrient triggering of spore germination in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 182 (9), 2513-2519 (2000).
- Schnizlein-Bick, C., Spritzler, J., Wilkening, C., Nicholson, J., O'Gorman, M. Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Site Investigators and The NIAID DAIDS New Technologies Evaluation Group. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 7 (3), 336-343 (2000).
- Rapid enumeration of viable spores by flow cytometry. US Patent. Godfrey, A., Alsharif, R. , US20040023319A1 https://patentimages.storage.googleapis.com/fa/3c/dc/9e08d9ecd1b315/US20040023319A1.pdf (2003).
- Karava, M., Bracharz, F., Kabisch, J. Quantification and isolation of Bacillus subtilis spores using cell sorting and automated gating. PLoS ONE. 14 (7), e021989 (2019).
- Genovese, M., Poulain, E., Doppler, F., Toussaint, R., Boyer, M. Bacillus spore enumeration using flow cytometry: A proof of concept for probiotic application. Journal of Microbiological Methods. 190, 106336 (2021).
- Trunet, C., Ngo, H., Coroller, L. Quantifying permeabilization and activity recovery of Bacillus spores in adverse conditions for growth. Food Microbiology. 81, 115-120 (2019).
- Tehri, N., Kumar, N., Raghu, H., Vashishth, A.
- Isticato, R., Ricca, E., Baccigalupi, L. Spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens. Journal of Visualized Experiments. 145, e59102 (2019).
- Song, M., et al. Killed Bacillus subtilis spores as a mucosal adjuvant for an H5N1 vaccine. Vaccine. 30 (22), 3266-3277 (2012).
