Summary
Detta protokoll fokuserar på användningen av flödescytometri och räkning av pärlor för att kvantifiera bakteriesporer märkta med etidiumbromid. Metoden är också effektiv för att analysera den kovalenta bindningen av proteiner på ytan av intakta sporer.
Abstract
Sporerna av Bacillus subtilis har redan föreslagits för olika biotekniska och immunologiska tillämpningar; Det finns dock ett ökande behov av att utveckla metoder som förbättrar detektionen av antigener immobiliserade på ytan av sporer tillsammans med deras kvantifiering. Flödescytometribaserade analyser har tidigare föreslagits som snabba, tillförlitliga och specifika metoder för att detektera märkta celler av B. subtilis. Häri föreslår vi användning av flödescytometri för att utvärdera visningseffektiviteten hos en fluorescerande antikropp (FA) på sporens yta och kvantifiera antalet sporer med hjälp av räknande pärlor.
För detta använde vi etidiumbromid som DNA-markör och en allophycocyanin (APC)-märkt antikropp, som var kopplad till sporerna, som ytmarkör. Kvantifieringen av sporer utfördes med hjälp av räknepärlor eftersom denna teknik visar hög noggrannhet vid detektion av celler. De märkta sporerna analyserades med hjälp av en flödescytometer, som bekräftade kopplingen. Som ett resultat visade det sig att DNA-märkning förbättrade noggrannheten vid kvantifiering med flödescytometri för detektion av grodda sporer. Det observerades att etidiumbromid inte kunde märka vilande sporer; Denna teknik ger dock en mer exakt bestämning av antalet sporer med fluorescerande protein kopplat till deras yta, vilket hjälper till att utveckla studier som fokuserar på användningen av sporer som en bioteknisk plattform i olika applikationer.
Introduction
Bacillus subtilis är en stavformad, grampositiv bakterie som kan producera vilande sporer när miljöförhållandena inte tillåter celltillväxt1. Sporer är extremt stabila cellformer och sporer från flera arter, inklusive B. subtilis, används i stor utsträckning som probiotika för användning av människor och djur2. På grund av dess resistens och säkerhetsegenskaper har sporen av B. subtilis, som uppvisar heterologa proteiner, föreslagits som ett slemhinneadjuvans, ett vaccinleveranssystem och en enzymimmobiliseringsplattform 3,4.
För att få sporer från B. subtilis är det nödvändigt att utsätta den för näringsbrist med hjälp av ett speciellt odlingsmedium. Efter att ha erhållit och renat dessa sporer måste man kvantifiera dem för att förbättra testeffektiviteten 5,6. Således tillämpas vissa metoder för att analysera koncentrationen av de erhållna sporerna. Plåträkning och en Petroff-Hausser-kammare, även känd som en räknekammare, kan användas. Den senare utvecklades ursprungligen för att bestämma koncentrationen av blodkroppar; Det är dock möjligt att använda det inom mikrobiologi för sporräkning 7,8. Trots att det är standardmetoden som används för cellräkning är läsningen mödosam eftersom denna metod är helt manuell och dess noggrannhet beror på operatörens erfarenhet.
Flödescytometribaserade (FC) analyser har tidigare föreslagits som snabba, tillförlitliga och specifika metoder för att detektera märkta celler av Bacillus spp. Användningen av flödescytometri som räknar pärlor har garanterat reproducerbarhet vid cellräkning vid rutinundersökningar (absolut antal CD4- och CD8 T-lymfocyter) och vid utvecklingen av forskning som involverar partiklar som kan detekteras och räknas med hjälp av flödescytometri9. Godjafrey och Alsharif föreslog att man skulle använda sig av att räkna pärlor för FC-kvantifiering av omärkta sporer10. Användningen av flödescytometri beskrevs för övervakning av sporulation i Bacillus spp. genom märkning av spor-DNA 10,11,12,13. I en annan studie användes FC för att utvärdera mängden fluorescerande märkta proteiner på sporytan15.
Denna studie syftade till att använda kommersiella räknepärlor för att säkerställa en standard för reproducerbarhet med avseende på händelseräkning med hjälp av flödescytometri. Häri föreslår vi användning av räknepärlor för cellräkning i FC för att förfina sporräkningen och utvärdera kopplingseffektiviteten hos fluorescerande märkta antikroppar på sporytan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Se materialtabellen för detaljer relaterade till alla material, instrument och programvara som används i detta protokoll.
1. Inställning av flödescytometri
- Justering av optiska parametrar för flödescytometer kopplad till en dator
- Logga in på Cytometer-programvaran.
- Från arbetsytan för programvara väljer du Cytometer | Starta och vänta några minuter | Rengör läge | Sittvätskor.
OBS: Luftbubblor och obstruktioner avlägsnades under cytometerinitieringsprocessen, före sample insamling.
- Kvalitetskontroll
- Använd kvalitetskontrollreagenset för att justera spänningarna i fotomultiplikatorrören och utvärdera deras känslighet.
- Förbered kvalitetskontrollreagenset i ett polystyrenrör.
- För att definiera baslinjen, förbered suspensionspärlorna genom att tillsätta 0.5 ml spädningsmedel (10 mM filtrerad PBS, pH 7) och 3 droppar pärlor till det märkta röret.
- Blanda pärlflaskan genom att försiktigt vända upp och ner på flaskan.
- Från arbetsytan för programvara väljer du Cytometer | CST för att ansluta till CST-gränssnittet. Vänta några minuter och observera att meddelandet cytometer är frånkopplad.
- Fäst polystyrenröret som innehåller kvalitetskontrollreagenset till flödescytometersonden.
- Använd kvalitetskontrollreagenset för att justera spänningarna i fotomultiplikatorrören och utvärdera deras känslighet.
- Verifiering av cytometerns konfiguration
- I fönstret Systemsammanfattning kontrollerar du att cytometerkonfigurationen är lämplig för experimentet.
- Välj det batch-ID för inställningspärlor som motsvarar för att verifiera att det valda parti-ID:t för inställningspärlor matchar det aktuella partiet med CS&T-forskningspärlor.
- Kontroll av prestanda
- Välj alternativet Kontrollera prestanda och klicka på Kör.
- När prestandakontrollen är klar kommer prestandaresultaten att visas. Visa cytometerns prestandarapport. Klicka antingen på Slutför för att slutföra prestandakontrollen eller ta bort röret från cytometern och granska resultaten i fönstret Systemsammanfattning .
- Observera det slutliga resultatet av morfometer- och fluorescenskänslighetsanalysen som kommer att visas i | systemsammanfattning| cytometerprestandaresultat| med statusen: GODKÄND
2. Beredning av sporerna
- Efter sporulering, skölj sporerna 3 gånger med ultrarent iskallt vatten genom centrifugering vid 17 949 × g i 10 minuter.
- Återsuspendera pelleten från den senaste centrifugeringen med 10 ml ultrarent vatten.
- Autoklavera sporerna i 45 minuter vid 121 °C för inaktivering av de vegetativa cellerna.
OBS: Tidigare tester utförda av vår grupp som jämförde olika inaktiveringsmetoder visade att de förhållanden som nämns i steg 2.3 uppvisade hög effektivitet och visade ingen kolonibildning i pläteringsanalysmetoden på LB-agarmediet.
3. Kvantifiering av autoklaverade sporer med hjälp av flödescytometri
- Ta 50 μl autoklaverade sporer och inkubera dem skyddade från ljus med etidiumbromid (EtBr, 10 mg/ml utspädd i vatten) med en spädningsfaktor på 0,05 volymprocent i 30 minuter (figur 1A).
- Tvätta sporerna 3 gånger med 1 x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) genom centrifugering vid 17 949 × g i 10 minuter och åter suspendera i 1 x PBS.
- Tillsätt 10 μL pärlor enligt tillverkarens rekommendationer för spädning.
- Analysera sample med hjälp av en flödescytometer enligt beskrivningen i steg 4.
OBS: Det är viktigt att betona att pärlorna bör pipetteras så homogent som möjligt eftersom skillnader observerades i beräkningarna när detta steg inte utfördes väl.
4. Analys med flödescytometri
- Logga in på Cytometer-programvaran.
- Från arbetsytan för programvara väljer du Cytometer | Rengör läge | Sittvätskor.
- Justera till arbetsytan för att bestämma analysen i flödescytometri.
- Definiera grindarna för analyserna (figur 2).
- Definiera regleringsstrategin baserat på partiklarnas morfometriska och fluorescensegenskaper baserat på den negativa kontrollen (omärkta sporer).
- Om du vill bestämma cellmorfometri väljer du Punktdiagramgrafik för analyser av FSC-A-parametrar på x-axeln och SSC-A på y-axeln.
- Om du vill bestämma fluorescensen väljer du FL3-punktdiagram på y-axeln med FL5 på x-axeln och skapar grindarna i fyra kvadranter.
- Definiera grindarna för analyserna (figur 2).
- Använd ett 12 x 75 mm proppat polystyrenrör som innehåller omärkta samples, tidigare märkta med enfärgad EtBr, enfärgad APC och flerfärgad EtBr+ APC.
- Blanda röret mycket försiktigt som innehåller den negativa kontrollen och fäst det på flödescytometersonden.
- Klicka på Förvärva.
- Ställ in effekten på lasrarna genom att navigera till Cytometer | Parametrar | FSC (375) och SSC (275).
- Ställ in tröskelvärdet på (500) Cytometer | Tröskelvärde.
- För att avlägsna autofluorescens, analysera det färgfria provet som endast innehåller sporer.
- Justera spänningarna för filterdetektorerna: FL3 (603) och FL5 (538) för att särskilja negativa och positiva populationer med avseende på den valda fluorescensen i kontrollerna. Cytometer | Parametrar.
- Cytometer | Ersättning | Ställ in FL5/FL3-inställningsförskjutning på 1,0.
- Efter morfometri och fluorescerande analys, konfigurera enheten för förvärv 30 000 händelser | Experiment | Upplägg för experiment | Förvärv |30 000 händelser....
- Efter att ha justerat parametrarna, skaffa data för proverna som är märkta och innehåller pärlor i flödescytometern.
- Beräkna sporkoncentrationen enligt tillverkarens anvisningar med hjälp av ekvation (1).
Nej (1)
OBS: För denna studie jämfördes pärlkvantifieringsmetoden med Petroff-Haussers räknekammaranalys. Dessutom jämfördes märkningen av autoklaverade sporer med märkningen av icke-autoklaverade sporer.
Nej (1)5. Uppskattning av proteinkopplingsindex på en sporyta med hjälp av flödescytometri
- Skörda genom centrifugering av 50 μl sporer (103/μl) 17,949 × g i 10 minuter och återsuspendera sedan med 25 μl 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (EDC) (300 mM)).
- Inkubera i 15 min i rumstemperatur.
- Tillsätt 25 μl N-hydroxisulfosuccinimid (NHS) (50 mM) till sporsuspensionen och inkubera den i rumstemperatur i 30 minuter.
- Tvätta sporerna 3 gånger med 1 x PBS genom centrifugering enligt beskrivningen i steg 5.1.
- Tillsätt fluorescerande protein och låt proverna stå över natten vid 15 °C.
OBS: Det fluorescerande proteinet som användes i detta arbete var en APC-märkt anti-human IL-10-antikropp. Denna antikropp användes som en modell för studier, även om applicering av andra fluorescerande molekyler är möjlig eftersom EDC/NHS främjar en kovalent ligering mellan -COOH- och -NH2-grupper som finns i proteiner på sporytan. - Tvätta sporerna enligt steg 5.3.
- Tillsätt 10 mg/ml etidiumbromid utspädd vid 1:50 och låt sedan stå i 1 timme på is och skyddad från ljus (Figur 1B).
- Tvätta sporerna enligt steg 5.3.
- Upprepa steg 4.
- För att bestämma fluorescens, ändra parametrarna FL3 på X-axeln och FL5 på Y-axeln i punktdiagrammet.
- Analysera sample med hjälp av en flödescytometer med den blå lasern (488 nm) vid FL3 (670 LP-filter) och den röda lasern (633 nm) i FL5 (660/20-filter), enligt beskrivningen i steg 4.
OBS: Samma samples analyserades för immunofluorescens på objektglas under ett mikroskop, med ett förstoringsområde på 1 000 x och med hjälp av följande filter: FITC 480/30 nm (grön) och TRITC 540/25 nm (röd).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I autoklaverade sporprover (AS) detekterades 2 × 103 sporer/μl och 1 × 103 sporer/μl med hjälp av räknekulor respektive Petroff-Hausser-metoden (figur 2).
Figur 1: Allmänt schema för kvantifiering av sporer. (A) Sporer märkta med EtBr och (B) dubbelmärkta sporer. Förkortningar: EDC = 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid; NHS = N-hydroxisulfosuccinimid. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Morfometrisk och kvalitativ analys av Bacillus subtilis-sporer och räkning av pärlor med hjälp av flödescytometri. Kvantifiering av B. subtillis-sporer med hjälp av räknekulor (outspätt prov). Förkortningar: FSC-A = främre spridningstoppsarea; SSC-A = sidospridningstoppsarea. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Etidiumbromidfärgning (EtBr) av autoklaverade sporer (AS) prover visade högre genomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) än färgning av icke-autoklaverade sporer (NAS), vilket indikerar större färgning av genetiskt material i det första tillståndet. Dessutom observerades ett högre MFI i den EtBr-märkta AS-populationen än i NAS-populationen (Figur 3, topp i rött och topp i svart). Kontrollprovet, som inte var märkt med EtBr, visade ingen signifikant fluorescens (figur 3, prickad topp).
Figur 3: Histogram av etidiumbromidmärkta, autoklaverade och icke-autoklaverade Bacillus subtillis-sporer . Topp i röd NAS EtBr-märkning; topp i svart-AS EtBr-märkning; prickad toppkontroll utan EtBr-märkning. Förkortningar: EtBr = etidiumbromid; NAS = icke-autoklaverade sporer; AS = autoklaverade sporer. Klicka här för att se en större version av denna figur.
I dessa experiment visade MFI på AS-ytkopplingen med APC-märkt anti-human IL-10-antikropp större kopplingseffektivitet jämfört med NAS (figur 4). Av denna anledning utfördes de dubbelmärkta experimenten med AS. Fyra sporpopulationer identifierades i flödescytometrianalysen: EtBr+/FA+; EtBr+/FA-; EtBr-/FA+; EtBr-/FA-. Förekomsten av sporer som är permeabla för den molekylära markören EtBr indikerar möjlig förekomst av grodda sporer i den totala populationen. Detta kunde observeras efter analys av provet med fluorescensmikroskopi (genom vilket det var möjligt att observera märkningen EtBr/Fluorescent Anti-mouse tabell 8 och båda fluoroforerna individuellt, figur 5). Genom att använda Wirtz-Conclin-färgningsmetoden kunde man visualisera förekomsten av sporer med permeabilitet för safranin (färgat i rosa, tilläggsfigur S1). I samma analys observerades sporer färgade endast med malakitgrönt, vilket tyder på ogenomtränglighet, vilket rapporterats i litteraturen för vilande sporer13. Sporanalysen med faskontrastmikroskopi uppvisar ett högre antal vilande sporer i AS-provet jämfört med NAS (tilläggsfigur S2)14.
Figur 4: Genomsnittlig fluorescensintensitet för APC-märkta antihumana IL-10-antikroppar i autoklaverade och icke-autoklaverade sporer. Förkortningar: FA = fluorescerande antikropp; APC =allophycocyanin. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Immunofluorescensavbildning av sporer märkta med EtBr och fluorescerande anti-mus. (A) Sporer med genetiskt material märkt med EtBr (rött). (B) Sporer med yta märkt med fluorescerande antimus (grön). (C) Dubbelmärkta sporer, med EtBr och fluorescerande anti-mus (orange). Skalstapel = 10 μm. Förkortningar: EtBr = etidiumbromid. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Flödescytometrianalyserna som utfördes här indikerade en högre andel koppling av FA till de vilande sporerna (EtBr-/FA+) jämfört med grodda sporer (EtBr+/FA+). I diagrammet som visas i figur 6A,B kan ökningen av andelen kopplade sporer och MFI observeras när koncentrationen av FA ökar. Dessutom visade populationerna av dessa sporer som inte parade ihop sig med det fluorescerande proteinet (EtBr+/FA- och EtBr-/FA-) en gradvis minskning med ökningen av koncentrationen av FA (tilläggstabell S1).
Figur 6: Procentuell analys av fluorescenskoppling och genomsnittlig fluorescensintensitet för EtBr-/FA+- och EtBr+/FA- populationer. (A) X-axeln representerar de olika koncentrationerna av FA, den svarta y-axeln representerar den detekterade MFI och den röda y-axeln representerar procentandelen FA-märkta sporer från EtBr-/FA+-populationen. (B) X-axeln representerar de olika koncentrationerna av FA, den svarta y-axeln representerar den detekterade MFI och den röda y-axeln representerar procentandelen EtBr-märkta sporer och FA från EtBr+/FA+-populationen. Förkortningar: MFI = genomsnittlig fluorescensintensitet; EtBr = etidiumbromid; FA = fluorescerande antikropp. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tilläggsfigur S1: Mikroskopibild av autoklaverade B. subtilis-sporer färgade med Wirtz-Conclin-metodik. Sporer som färgas rosa är grodda sporer (permeabla för safranin). I grönt finns vilande sporer (ogenomträngliga för safranin). Skalstapel = 10 μm. Klicka här för att ladda ner denna fil.
Tilläggsfigur S2: Jämförelse av faskontrastmikroskopibilder av autoklaverade och icke-autoklaverade B. subtilis-sporer . (A,B) Bilder av B. subtilis-sporer före och efter autoklavbehandlingen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell S1: Värden på procentandelen sporer som är markerade med eller inte markerade med fluorescerande antikroppar och etidiumbromid, i olika FA-koncentrationer, observerade i flödescytometri. Förkortningar: EtBr = etidiumbromid; FA = fluorescerande antikropp. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Traditionella metoder, såsom platträkning av kolonier, är inte bara tidskrävande, utan kräver också livskraftiga celler och tillåter inte kvantifiering av inaktiverade sporer5. Petroff-Hausser-kammaren är en alternativ metod, men den kräver en erfaren mikroskopist för att utföra den. Flödescytometri har visat sig vara ett användbart alternativ för detta ändamål.
Genovese et al.12 beskrev användningen av flödescytometri för kvantifiering av livskraftiga celler och sporer av Bacillus sp. med hjälp av två nukleinsyramarkörer och hög kontrollkapacitet för flödeshastigheten (volym/minut) för den utrustning som används, vilket ger möjlighet att bestämma den numeriska kvantitet som ska konfigureras. Inte all cytometriutrustning har strikt kontroll över flödeshastigheten (volym/minuter), och vissa är endast justerbara i de lägsta, medelstora och maximala alternativen. I dessa fall kan räknepärlor användas för att säkerställa noggrannheten i cellräkningen och reproducerbarheten mot annan flödescytometriutrustning. Via denna metod var det i denna studie möjligt att beräkna antalet sporer (grodda och vilande) per milliliter i proverna.
Sporpopulationen räknades upp och analyserades enligt de parametrar som beskrivs i Godfrey och Alsharifs patent10. Dessa författare beskriver användningen av denna metod för analys av groningsstadierna av Bacillus spp. utan att beskriva sporens tillstånd och med hjälp av dyra kommersiella DNA-markörer 11,12,13. I det arbete som beskrivs här var det möjligt att med hjälp av AS identifiera två populationer av sporer (vilande och grodda) med hjälp av EtBr, som är en allmänt använd och lättillgänglig markör. Identifieringen av sportillståndet var möjlig på grund av de grodda sporernas permeabilitet för EtBr. Det är viktigt att betona att populationen av sporer som inte är märkta med EtBr kan uppvisa artefakter av liknande storlek i samma prov. Denna begränsning kan mildras genom att tvätta och filtrera de buffertar som används.
Flödescytometrianalysen av EtBr-märkta AS-prover i kombination med FA som beskrivs här möjliggjorde också kvalificering och kvantifiering av fluorescerande proteinkoppling (FPC). Analys av fluorescerande märkta och kopplade prover bör utföras omedelbart för att undvika förlust av fluorescensemission. Dessutom var det möjligt att dra slutsatser om sporpopulationens morfologi och koncentration påverkades av konjugeringsproceduren, vilket ger en övergripande förståelse av processen, vilket inte erhålls vid användning av dot-blot-metoden. Isticato et al.15 analyserade också FPC på sporytan och demonstrerade dess livskraft genom att bekräfta den med immunofluorescens och flödescytometri, beroende på vilken typ av protein som används för koppling. Här observerades att användningen av AS11 är att föredra för koppling eftersom autoklaveringsprocessen är viktig för inaktivering av proteaser som kan bryta ned proteinet som ska kopplas. Det är viktigt att påpeka att de tekniker som beskrivs här utfördes med endast B. subtilis KO7-stammen, medan tillämpningen i andra stammar ännu inte har testats.
Det finns inga rapporter i litteraturen som jämför sporernas kopplingsförmåga beroende på deras stadium. I experimenten som presenteras här observerades en högre andel vilande sporer i kombination med FA (EtBr-/FA+)16. Däremot visade grodda sporer (EtBr+/FA+), trots sin lägre andel, ett högre MFI än vad som observerades i de vilande sporerna. Ytterligare studier behöver genomföras för att utvärdera detta beteende för högre koncentrationer av FA (mättnadspunkt) i andra Bacillus spp.
För framtida tillämpningar kan den metod som presenteras här användas i studier av användningen av B. subtilis-sporer som vaccinadjuvans, för att utvärdera kopplingen av ett målantigen som initialt märks med fluorescens. Efter bestämning av den mättade koncentrationen kan det detekterade värdet appliceras på målantigenet för användning vid immuniseringar.
Således presenterar denna artikel en praktisk och känslig metod för räkning av grodda och vilande sporer och analys av fluorescerande proteinbindning av Bacillus subtilis-sporer med hjälp av flödescytometri. Användningen av att räkna pärlor som en parameter för kvantifiering, utöver EtBr-spormärkningen, möjliggör en förfinad räkning av grodda sporer och procentuell bestämning av fluorescerande proteinkoppling. Denna metod bör hjälpa till att utveckla studier som fokuserar på användningen av sporer som adjuvans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Denna studie finansierades delvis av Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001; Governo do Estado do Amazonas med resurser från Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Författarna tackar programmet för teknisk utveckling i verktyg för hälsa PDTIS-FIOCRUZ för användningen av dess faciliteter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (N-hydroxysuccinimide) (NHS) | Sigma | 130672 | |
| Anti-human fluorescent antibody | BioLegend | 501410 | APC anti-human IL-10 |
| Anti-mouse fluorescent antibody | Thermo Scientific | A32723 | Alexa Fluor Plus 488 |
| BD FACSCanto II | BD | Flow cytometer | |
| BD FACSDiva Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva software v 6.x) | BD | 642412 | Quality control reagent |
| BD FACSDiva Software v. 6.1.3 | BD | 643629 | Software |
| Centrifuge MegaFuge 8R | Thermo Scientific | 75007213 | |
| Counting Beads | BD | 340334 | TruCount Tubes |
| Eclipse 80i | Nikon | Fluorescent Microsope | |
| Ethidium Bromide | Ludwig Biotec | ||
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Plastic Microtubes | Eppendorf | ||
| Polystyrene tube | Falcon | 352008 | 5 mL polystyrene tube, 12 x 75 mm, without lid, non-sterile |
References
- McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis endospore: assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews. Microbiology. 11 (1), 33-44 (2013).
- Cutting, S. M.
- Ricca, E., Baccigalupi, L., Cangiano, G., De Felice, M., Isticato, R. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).
- Falahati-Pour, S. K., Lotfi, A. S., Ahmadian, G., Baghizadeh, A. Covalent immobilization of recombinant organophosphorus hydrolase on spores of Bacillus subtilis. Journal of Applied Microbiology. 118 (4), 976-988 (2015).
- Harrold, Z., Hertel, M., Gorman-Lewis, D. Optimizing Bacillus subtilis spore isolation and quantifying spore harvest purity. Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 325-329 (2011).
- Nicholson, W. L., Setlow, P. Sporulation, germination and outgrowth. Molecular biological methods for Bacillus. , John Wiley and Sons, Chichester, UK. (1990).
- Mora-Uribe, P., et al. Characterization of the adherence of Clostridium difficile spores: the integrity of the outermost layer affects adherence properties of spores of the epidemic strain R20291 to components of the intestinal mucosa. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 99 (2016).
- Paidhungat, M., Setlow, P. Role of ger proteins in nutrient and nonnutrient triggering of spore germination in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 182 (9), 2513-2519 (2000).
- Schnizlein-Bick, C., Spritzler, J., Wilkening, C., Nicholson, J., O'Gorman, M. Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Site Investigators and The NIAID DAIDS New Technologies Evaluation Group. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 7 (3), 336-343 (2000).
- Rapid enumeration of viable spores by flow cytometry. US Patent. Godfrey, A., Alsharif, R. , US20040023319A1 https://patentimages.storage.googleapis.com/fa/3c/dc/9e08d9ecd1b315/US20040023319A1.pdf (2003).
- Karava, M., Bracharz, F., Kabisch, J. Quantification and isolation of Bacillus subtilis spores using cell sorting and automated gating. PLoS ONE. 14 (7), e021989 (2019).
- Genovese, M., Poulain, E., Doppler, F., Toussaint, R., Boyer, M. Bacillus spore enumeration using flow cytometry: A proof of concept for probiotic application. Journal of Microbiological Methods. 190, 106336 (2021).
- Trunet, C., Ngo, H., Coroller, L. Quantifying permeabilization and activity recovery of Bacillus spores in adverse conditions for growth. Food Microbiology. 81, 115-120 (2019).
- Tehri, N., Kumar, N., Raghu, H., Vashishth, A.
- Isticato, R., Ricca, E., Baccigalupi, L. Spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens. Journal of Visualized Experiments. 145, e59102 (2019).
- Song, M., et al. Killed Bacillus subtilis spores as a mucosal adjuvant for an H5N1 vaccine. Vaccine. 30 (22), 3266-3277 (2012).
