Summary
Dit protocol richt zich op het gebruik van flowcytometrie en het tellen van kralen om bacteriële sporen te kwantificeren die zijn gelabeld met ethidiumbromide. De methode is ook efficiënt voor het analyseren van de covalente koppeling van eiwitten op het oppervlak van intacte sporen.
Abstract
De sporen van Bacillus subtilis zijn al voorgesteld voor verschillende biotechnologische en immunologische toepassingen; Er is echter een toenemende behoefte aan de ontwikkeling van methodologieën die de detectie van geïmmobiliseerde antigenen op het oppervlak van sporen verbeteren, samen met hun kwantificering. Op flowcytometrie gebaseerde analyses zijn eerder voorgesteld als snelle, betrouwbare en specifieke benaderingen voor het detecteren van gelabelde cellen van B. subtilis. Hierin stellen we het gebruik van flowcytometrie voor om de weergave-efficiëntie van een fluorescerend antilichaam (FA) op het oppervlak van de spore te evalueren en het aantal sporen te kwantificeren met behulp van telkralen.
Hiervoor gebruikten we ethidiumbromide als DNA-marker en een allophycocyanine (APC)-gelabeld antilichaam, dat aan de sporen was gekoppeld, als oppervlaktemarker. De kwantificering van sporen werd uitgevoerd met behulp van telkralen, aangezien deze techniek een hoge nauwkeurigheid aantoont bij de detectie van cellen. De gelabelde sporen werden geanalyseerd met behulp van een flowcytometer, die de koppeling bevestigde. Als gevolg hiervan werd aangetoond dat DNA-etikettering de nauwkeurigheid van kwantificering door flowcytometrie verbeterde, voor de detectie van ontkiemde sporen. Er werd waargenomen dat ethidiumbromide niet in staat was om slapende sporen te labelen; Deze techniek zorgt echter voor een nauwkeurigere bepaling van het aantal sporen met fluorescerend eiwit gekoppeld aan hun oppervlak, wat helpt bij de ontwikkeling van studies die zich richten op het gebruik van sporen als biotechnologisch platform in verschillende toepassingen.
Introduction
Bacillus subtilis is een staafvormige, grampositieve bacterie die in staat is om slapende sporen te produceren wanneer de omgevingsomstandigheden geen celgroeitoelaten1. Sporen zijn uiterst stabiele celvormen en die van verschillende soorten, waaronder B. subtilis, worden veel gebruikt als probiotica voor menselijk en dierlijk gebruik. Vanwege zijn resistentie- en veiligheidseigenschappen is de spore van B. subtilis, die heterologe eiwitten vertoont, voorgesteld als een mucosale adjuvans, een vaccinafgiftesysteem en een enzym-immobilisatieplatform 3,4.
Om sporen van B. subtilis te verkrijgen, is het noodzakelijk om het bloot te stellen aan nutriëntendeprivatie met behulp van een speciaal kweekmedium. Na het verkrijgen en zuiveren van deze sporen, moet men ze kwantificeren om de testefficiëntie te verbeteren 5,6. Zo worden bepaalde methoden toegepast om de concentratie van de verkregen sporen te analyseren. Er kan gebruik worden gemaakt van het tellen van platen en een Petroff-Hausser-kamer, ook wel telkamer genoemd. De laatste is oorspronkelijk ontwikkeld om de concentratie van bloedcellen te bepalen; Het is echter mogelijk om het te gebruiken op het gebied van microbiologie voor het tellen van sporen 7,8. Ondanks dat het de standaardmethode is die wordt gebruikt voor het tellen van cellen, is het lezen arbeidsintensief omdat deze methode volledig handmatig is en de nauwkeurigheid ervan afhangt van de ervaring van de operator.
Op flowcytometrie gebaseerde (FC) analyses zijn eerder voorgesteld als snelle, betrouwbare en specifieke benaderingen voor het detecteren van gelabelde cellen van Bacillus spp. Het gebruik van flowcytometrie telparels heeft de reproduceerbaarheid gegarandeerd bij het tellen van cellen bij routineonderzoeken (absoluut aantal CD4- en CD8 T-lymfocyten) en bij de ontwikkeling van onderzoek met deeltjes die kunnen worden gedetecteerd en geteld met behulp van flowcytometrie9. Godjafrey en Alsharif suggereerden het gebruik van telkralen voor FC-kwantificering van niet-gelabelde sporen10. Het gebruik van flowcytometrie werd beschreven voor de monitoring van sporulatie in Bacillus spp. via het labelen van het sporen-DNA 10,11,12,13. Nog een andere studie gebruikte FC om de hoeveelheid fluorescerend gelabelde eiwitten op het sporenoppervlak te evalueren15.
Deze studie was gericht op het gebruik van commerciële telkralen om een standaard van reproduceerbaarheid te garanderen met betrekking tot het tellen van gebeurtenissen met behulp van flowcytometrie. Hierin suggereren we het gebruik van telkralen voor het tellen van cellen in FC om de sporentelling te verfijnen en de koppelingsefficiëntie van fluorescerend gelabelde antilichamen op het sporenoppervlak te evalueren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen, instrumenten en software die in dit protocol worden gebruikt.
1. Instelling van de flowcytometrie
- Uitlijning van optische parameters van flowcytometer gekoppeld aan een computer
- Log in op de Cytometer-software.
- Selecteer in de softwarewerkruimte de optie Cytometer | Opstarten en een paar minuten wachten | Schone modus | Zit vloeistoffen.
OPMERKING: Luchtbellen en obstructies werden verwijderd tijdens het initiatieproces van de cytometer, voorafgaand aan de monsterverwerving.
- Kwaliteitscontrole
- Gebruik het kwaliteitscontrolereagens om de spanningen van de fotomultiplicatorbuizen aan te passen en hun gevoeligheid te evalueren.
- Bereid het reagens voor kwaliteitscontrole voor in een polystyreenbuis.
- Om de basislijn te bepalen, bereidt u de suspensiekorrels voor door 0,5 ml verdunningsmiddel (10 mM gefilterd PBS, pH 7) en 3 druppels parels toe te voegen aan de gelabelde buis.
- Meng de injectieflacon met kralen door deze voorzichtig om te keren.
- Selecteer in de softwarewerkruimte de optie Cytometer | CST om verbinding te maken met de CST-interface. Wacht een paar minuten en observeer de boodschap cytometer losgekoppeld.
- Bevestig de polystyreenbuis met het kwaliteitscontrolereagens aan de flowcytometersonde.
- Gebruik het kwaliteitscontrolereagens om de spanningen van de fotomultiplicatorbuizen aan te passen en hun gevoeligheid te evalueren.
- Verificatie van de configuratie van de cytometer
- Controleer in het venster Systeemoverzicht of de configuratie van de cytometer geschikt is voor het experiment.
- Selecteer de batch-ID van de opzetkralen die overeenkomt om te controleren of de geselecteerde lot-ID van de opzetkralen overeenkomt met de huidige partij CS&T-onderzoekskralen.
- Prestatiecontrole
- Selecteer de optie Prestaties controleren en klik op Uitvoeren.
- Na voltooiing van de prestatiecontrole worden de prestatieresultaten weergegeven. Bekijk het prestatierapport van de cytometer. Klik op Voltooien om de prestatiecontrole te voltooien of verwijder het buisje uit de cytometer en bekijk de resultaten in het venster Systeemoverzicht .
- Bekijk het eindresultaat van de morfometrische en fluorescentiegevoeligheidsanalyse die zal verschijnen in de | systeemsamenvatting | cytometerprestatieresultaat | met de status: GESLAAGD
2. Bereiding van de sporen
- Spoel de sporen na sporulatie 3x af met ultrapuur ijskoud water door centrifugatie bij 17.949 × g gedurende 10 min.
- Resuspendeer de pellet die is verkregen bij de laatste centrifugatie met 10 ml ultrapuur water.
- Autoclaaf de sporen gedurende 45 minuten bij 121 ºC voor inactivatie van de vegetatieve cellen.
OPMERKING: Eerdere tests die door onze groep zijn uitgevoerd en waarbij verschillende inactiveringsmethoden werden vergeleken, toonden aan dat de in stap 2.3 genoemde omstandigheden een hoog rendement vertoonden, waarbij geen kolonievorming werd aangetoond in de uitplatingsanalysemethode op het LB-agarmedium.
3. Kwantificering van geautoclaveerde sporen met behulp van flowcytometrie
- Neem 50 μl geautoclaveerde sporen en incubeer ze beschermd tegen licht met ethidiumbromide (EtBr, 10 mg/ml verdund in water) bij een verdunningsfactor van 0,05% v/v gedurende 30 minuten (figuur 1A).
- Was de sporen 3x met 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) door centrifugatie bij 17.949 × g gedurende 10 min en resuspendeer in 1x PBS.
- Voeg 10 μL korrels toe, volgens de aanbevelingen van de fabrikant voor verdunning.
- Analyseer het monster met behulp van een flowcytometer zoals beschreven in stap 4.
OPMERKING: Het is belangrijk om te benadrukken dat de kralen zo homogeen mogelijk moeten worden gepipetteerd, aangezien er verschillen werden waargenomen in de berekeningen wanneer deze stap niet goed werd uitgevoerd.
4. Analyse met behulp van flowcytometrie
- Log in op de Cytometer-software.
- Selecteer in de softwarewerkruimte de optie Cytometer | Schone modus | Zit vloeistoffen.
- Pas aan de werkruimte aan om de analyse in flowcytometrie te bepalen.
- Definieer de poorten voor de analyses (Figuur 2).
- Definieer de poortstrategie op basis van de morfometrische en fluorescentiekenmerken van de deeltjes op basis van de negatieve controle (ongemarkeerde sporen).
- Als u de celmorfometrie wilt bepalen, kiest u Dotplot-afbeelding voor analyses van FSC-A-parameters op de x-as en SSC-A op de y-as.
- Om de fluorescentie te bepalen, kiest u FL3 Dotplot-plots op de y-as met FL5 op de x-as en maakt u de poorten in vier kwadranten.
- Definieer de poorten voor de analyses (Figuur 2).
- Gebruik een polystyreenbuis van 12 x 75 mm met stop met niet-gelabelde monsters, eerder gelabeld met eenkleurige EtBr, eenkleurige APC en meerkleurige EtBr+ APC.
- Meng de buis met de negatieve controle heel voorzichtig en bevestig deze aan de sonde van de flowcytometer.
- Klik op Verwerven.
- Stel het vermogen van de lasers in door te navigeren naar Cytometer | Parameters | FSC (375) en SSC (275).
- Stel de drempelwaarde in op (500) Cytometer | Drempel.
- Om autofluorescentie te verwijderen, analyseert u het kleurstofvrije monster dat alleen sporen bevat.
- Pas de spanningen voor de filterdetectoren aan: FL3 (603) en FL5 (538) om negatieve en positieve populaties te onderscheiden met betrekking tot de gekozen fluorescentie in de controles. Cytometer | Parameters.
- Cytometer | Vergoeding | Stel de offset van de FL5/FL3-instellingen in op 1.0.
- Configureer het apparaat na morfometrie en fluorescentieanalyse voor acquisitie 30.000 gebeurtenissen | Experimenteer | Lay-out van experimenten | Acquisitie |30.000 evenementen....
- Nadat u de parameters hebt aangepast, verkrijgt u gegevens voor de monsters die zijn gelabeld en kralen bevatten in de flowcytometer.
- Bereken de sporenconcentratie zoals beschreven in de instructies van de fabrikant met behulp van vergelijking (1).
(1)
OPMERKING: Voor dit onderzoek werd de kwantificeringsmethode van de kraal vergeleken met de Petroff-Hausser telkameranalyse. Bovendien werd de etikettering van geautoclaveerde sporen vergeleken met de etikettering van niet-geautoclaveerde sporen.
(1)5. Schatting van de eiwitkoppelingsindex op een sporenoppervlak met behulp van flowcytometrie
- Oogst door centrifugatie van 50 μl sporen (103/μl) 17.949 × g gedurende 10 minuten en resuspendeer vervolgens met 25 μl 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) (300 mM)).
- Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 25 μL N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) (50 mM) toe aan de sporensuspensie en incubeer deze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de sporen 3x met 1x PBS door middel van centrifugeren zoals beschreven in stap 5.1.
- Voeg fluorescerend eiwit toe en laat de monsters een nacht bij 15 °C staan.
OPMERKING: Het fluorescerende eiwit dat in dit werk werd gebruikt, was een APC-gelabeld anti-humaan IL-10-antilichaam. Dit antilichaam werd gebruikt als model voor studie, hoewel de toepassing van andere fluorescerende moleculen mogelijk is omdat EDC/NHS een covalente ligatie bevorderen tussen -COOH- en -NH2-groepen die aanwezig zijn in eiwitten op het sporenoppervlak. - Was de sporen volgens stap 5.3.
- Voeg 10 mg/ml ethidiumbromide verdund tot 1:50 toe en laat 1 uur op ijs staan en beschermd tegen licht (figuur 1B).
- Was de sporen volgens stap 5.3.
- Herhaal stap 4.
- Om de fluorescentie te bepalen, wijzigt u de parameters FL3 op de X-as en FL5 op de Y-as van de dotplot.
- Analyseer het monster met behulp van een flowcytometer met de blauwe laser (488 nm) in FL3 (670 LP-filter) en de rode laser (633 nm) in FL5 (660/20-filter), zoals beschreven in stap 4.
OPMERKING: Dezelfde monsters werden geanalyseerd op immunofluorescentie op objectglaasjes onder een microscoop, met een vergrotingsbereik van 1.000 x en met behulp van de volgende filters: FITC 480/30 nm (groen) en TRITC 540/25 nm (rood).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In geautoclaveerde sporenmonsters (AS) werden respectievelijk 2 × 103 sporen/μl en 1 × 103 sporen/μl gedetecteerd met behulp van telkralen en de Petroff-Hausser-methode (Figuur 2).
Figuur 1: Algemeen schema voor de kwantificering van sporen. (A) Sporen gelabeld met EtBr en (B) dubbel gelabelde sporen. Afkortingen: EDC = 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide; NHS = N-hydroxysulfosuccinimide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Morfometrische en kwalitatieve analyse van Bacillus subtilis sporen en telkralen met behulp van flowcytometrie. Kwantificering van B. subtillis-sporen met behulp van telkralen (onverdund monster). Afkortingen: FSC-A = forward scatter-peak area; SSC-A = zijwaarts verstrooiingspiekgebied. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Ethidiumbromide (EtBr)-kleuring van geautoclaveerde sporenmonsters (AS) vertoonde een hogere gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) dan de kleuring van niet-geautoclaveerde sporen (NAS), wat wijst op een grotere kleuring van genetisch materiaal in de eerste toestand. Bovendien werd een grotere MFI waargenomen in de EtBr-gelabelde AS-populatie dan in de NAS-populatie (Figuur 3, piek in rood en piek in zwart). Het controlemonster, niet gelabeld met EtBr, vertoonde geen significante fluorescentie (Figuur 3, gestippelde piek).
Figuur 3: Histogram van ethidiumbromide-gelabelde, geautoclaveerde en niet-geautoclaveerde Bacillus subtillis-sporen . Piek in rode-NAS EtBr-labeling; piek in zwart-AS EtBr-etikettering; gestippelde piekregeling zonder EtBr-labeling. Afkortingen: EtBr = ethidiumbromide; NAS = niet-geautoclaveerde sporen; AS = geautoclaveerde sporen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
In deze experimenten vertoonde MFI op de AS-oppervlaktekoppeling met APC-gelabeld antihumaan IL-10-antilichaam een grotere koppelingsefficiëntie in vergelijking met NAS (Figuur 4). Om deze reden werden de dubbel gelabelde experimenten uitgevoerd met AS. In de flowcytometrie-analyse werden vier sporenpopulaties geïdentificeerd: EtBr+/FA+; EtBr+/FA-; EtBr-/FA+; EtBr-/FA-. De aanwezigheid van sporen die doorlaatbaar zijn voor de moleculaire marker EtBr duidt op de mogelijke aanwezigheid van ontkiemde sporen in de totale populatie. Dit kon worden waargenomen na analyse van het monster met behulp van fluorescentiemicroscopie (waarmee het mogelijk was om de EtBr/Fluorescent Anti-mouse tabel 8-etikettering en beide fluoroforen afzonderlijk te observeren, Figuur 5). Door gebruik te maken van de Wirtz-Conklin-kleuringsmethode kon het bestaan van sporen met permeabiliteit voor safranine (roze gekleurd, aanvullende figuur S1) worden gevisualiseerd. In dezelfde analyse werden sporen waargenomen die alleen met malachietgroen waren gekleurd, wat wijst op ondoordringbaarheid, zoals gerapporteerd in de literatuur voor slapende sporen13. De sporenanalyse door middel van fasecontrastmicroscopie vertoont een hoger aantal slapende sporen in het AS-monster in vergelijking met NAS (aanvullende figuur S2)14.
Figuur 4: Gemiddelde fluorescentie-intensiteit van APC-gelabelde anti-humane IL-10-antilichamen in geautoclaveerde en niet-geautoclaveerde sporen. Afkortingen: FA = fluorescerend antilichaam; APC = allophycocyanine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Immunofluorescentiebeeldvorming van sporen gelabeld met EtBr en fluorescerende anti-muis. (A) Sporen met genetisch materiaal gemarkeerd met EtBr (rood). (B) Sporen met een oppervlak dat is gelabeld met fluorescerende anti-muis (groen). (C) Dubbel gelabelde sporen, met EtBr en fluorescerende anti-muis (oranje). Schaalbalk = 10 μm. Afkortingen: EtBr = ethidiumbromide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De hier uitgevoerde flowcytometrie-analyses wezen op een hoger percentage koppeling van de FA aan de slapende sporen (EtBr-/FA+) in vergelijking met ontkiemde sporen (EtBr+/FA+). In de grafiek in figuur 6A,B kan de toename van het percentage gekoppelde sporen en MFI worden waargenomen naarmate de concentratie van FA toeneemt. Bovendien vertoonden de populaties van deze sporen die niet paren met het fluorescerende eiwit (EtBr+/FA- en EtBr-/FA-) een geleidelijke afname met de toename van de concentratie van FA (aanvullende tabel S1).
Figuur 6: Analyse van het fluorescentiekoppelingspercentage en de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van EtBr-/FA+- en EtBr+/FA-populaties. (A) De x-as vertegenwoordigt de verschillende concentraties van de FA, de zwarte y-as vertegenwoordigt de gedetecteerde MFI en de rode y-as vertegenwoordigt het percentage FA-gelabelde sporen uit de EtBr - /FA+-populatie. (B) De x-as vertegenwoordigt de verschillende concentraties van FA, de zwarte y-as vertegenwoordigt de gedetecteerde MFI en de rode y-as vertegenwoordigt het percentage EtBr-gelabelde sporen en FA uit de EtBr+/FA+-populatie. Afkortingen: MFI = gemiddelde fluorescentie-intensiteit; EtBr = ethidiumbromide; FA = fluorescerend antilichaam. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur S1: Microscopiebeeld van geautoclaveerde B. subtilis-sporen gekleurd volgens de Wirtz-Conklin-methodologie. Roze gekleurde sporen zijn ontkiemde sporen (doorlaatbaar voor safranine). In het groen zijn slapende sporen (ondoordringbaar voor safranine). Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S2: Vergelijking van fasecontrastmicroscopiebeelden van geautoclaveerde en niet-geautoclaveerde B. subtilis-sporen . (A,B) Beelden van B. subtilis sporen voor en na de autoclaafbehandeling. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel S1: Waarden van de percentages sporen die al dan niet zijn gemarkeerd met fluorescerend antilichaam en ethidiumbromide, in verschillende FA-concentraties, waargenomen bij flowcytometrie. Afkortingen: EtBr = ethidiumbromide; FA = fluorescerend antilichaam. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Traditionele methoden, zoals het tellen van kolonies, zijn niet alleen tijdrovend, maar vereisen ook levensvatbare cellen en maken het niet mogelijk om geïnactiveerde sporen te kwantificeren5. De Petroff-Hausser-kamer is een alternatieve methodologie, maar vereist een ervaren microscopist om deze uit te voeren. Flowcytometrie is hiervoor een nuttig alternatief gebleken.
Genovese et al.12 beschreven het gebruik van flowcytometrie voor de kwantificering van levensvatbare cellen en sporen van Bacillus sp. met behulp van twee nucleïnezuurmarkers en een hoge controlecapaciteit van het debiet (volume/minuut) van de gebruikte apparatuur, die de mogelijkheid biedt om de te configureren numerieke grootheid te bepalen. Niet alle cytometrieapparatuur heeft strikte controle over het debiet (volume/minuten), en sommige zijn alleen instelbaar in de minimale, gemiddelde en maximale opties. In deze gevallen kunnen telkralen worden gebruikt om de nauwkeurigheid van de celtelling en reproduceerbaarheid ten opzichte van andere flowcytometrieapparatuur te waarborgen. Via deze methode was het in dit onderzoek mogelijk om het aantal sporen (ontkiemd en slapend) per milliliter in de monsters te berekenen.
De sporenpopulatie werd geïnventariseerd en geanalyseerd volgens de parameters die zijn beschreven in het patent van Godfrey en Alsharif10. Deze auteurs beschrijven het gebruik van deze methodologie voor de analyse van de kiemstadia van Bacillus spp. zonder de toestand van de spore te beschrijven en met behulp van dure commerciële DNA-markers 11,12,13. In het hier beschreven werk, met behulp van AS, was het mogelijk om twee populaties van sporen (slapend en ontkiemd) te identificeren met behulp van EtBr, een veelgebruikte en gemakkelijk toegankelijke marker. De identificatie van de sporentoestand was mogelijk door de doorlaatbaarheid van de ontkiemde sporen voor de EtBr. Het is belangrijk om te benadrukken dat de populatie van sporen die niet zijn gelabeld met EtBr artefacten van vergelijkbare grootte in hetzelfde monster kan vertonen. Deze beperking kan worden ondervangen door de gebruikte buffers te wassen en te filteren.
De flowcytometrie-analyse van EtBr-gelabelde AS-monsters in combinatie met FA die hier wordt beschreven, maakte ook de kwalificatie en kwantificering van fluorescerende eiwitkoppeling (FPC) mogelijk. Analyse van fluorescerend gelabelde en gekoppelde monsters moet onmiddellijk worden uitgevoerd om verlies van fluorescentie-emissie te voorkomen. Bovendien was het mogelijk om af te leiden of de morfologie en concentratie van de sporenpopulatie werden beïnvloed door de conjugatieprocedure, wat een algemeen begrip van het proces opleverde, dat niet wordt verkregen bij gebruik van de dot-blot-methode. Isticato et al.15 analyseerden ook FPC op het sporenoppervlak en toonden de levensvatbaarheid ervan aan door het te bevestigen met immunofluorescentie en flowcytometrie, afhankelijk van het type eiwit dat wordt gebruikt voor koppeling. Hierin werd opgemerkt dat het gebruik van AS11 de voorkeur verdient voor koppeling, aangezien het autoclaafproces belangrijk is voor de inactivering van proteasen die het te koppelen eiwit kunnen afbreken. Het is belangrijk erop te wijzen dat de hier beschreven technieken zijn uitgevoerd met alleen de B. subtilis KO7-stam, waarbij de toepassing in andere stammen nog moet worden getest.
Er zijn geen rapporten in de literatuur die de koppelingscapaciteit van sporen vergelijken op basis van hun stadium. In de hier gepresenteerde experimenten werd een hoger percentage slapende sporen in combinatie met FA waargenomen (EtBr-/FA+)16. Daarentegen vertoonden ontkiemde sporen (EtBr+/FA+), ondanks hun lagere percentage, een hogere MFI dan wat werd waargenomen in de slapende sporen. Verdere studies moeten worden uitgevoerd om dit gedrag te evalueren voor hogere concentraties FA (verzadigingspunt) in andere Bacillus spp.
Voor toekomstige toepassingen zou de hier gepresenteerde methode kunnen worden gebruikt in onderzoeken naar het gebruik van B. subtilis-sporen als vaccinadjuvans, waarbij de koppeling van een doelantigeen dat aanvankelijk door fluorescentie werd gelabeld, wordt geëvalueerd. Na het bepalen van de verzadigingsconcentratie kan de gedetecteerde waarde worden toegepast op het doelantigeen voor gebruik bij immunisaties.
Dit artikel presenteert dus een praktische en gevoelige methode voor de telling van ontkiemde en slapende sporen en de analyse van fluorescerende eiwitkoppeling van Bacillus subtilis-sporen met behulp van flowcytometrie. Het gebruik van telkralen als parameter voor kwantificering, naast de EtBr-sporenetikettering, maakt een verfijnde telling van ontkiemde sporen en de procentuele bepaling van fluorescerende eiwitkoppeling mogelijk. Deze methode zou moeten helpen bij de ontwikkeling van studies die zich richten op het gebruik van sporen als adjuvans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Acknowledgments
Deze studie werd gedeeltelijk gefinancierd door de Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001; Governo do Estado do Amazonas met middelen van Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). De auteurs danken het Programma voor Technologische Ontwikkeling in Hulpmiddelen voor Gezondheid PDTIS-FIOCRUZ voor het gebruik van zijn faciliteiten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (N-hydroxysuccinimide) (NHS) | Sigma | 130672 | |
| Anti-human fluorescent antibody | BioLegend | 501410 | APC anti-human IL-10 |
| Anti-mouse fluorescent antibody | Thermo Scientific | A32723 | Alexa Fluor Plus 488 |
| BD FACSCanto II | BD | Flow cytometer | |
| BD FACSDiva Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva software v 6.x) | BD | 642412 | Quality control reagent |
| BD FACSDiva Software v. 6.1.3 | BD | 643629 | Software |
| Centrifuge MegaFuge 8R | Thermo Scientific | 75007213 | |
| Counting Beads | BD | 340334 | TruCount Tubes |
| Eclipse 80i | Nikon | Fluorescent Microsope | |
| Ethidium Bromide | Ludwig Biotec | ||
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Plastic Microtubes | Eppendorf | ||
| Polystyrene tube | Falcon | 352008 | 5 mL polystyrene tube, 12 x 75 mm, without lid, non-sterile |
References
- McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis endospore: assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews. Microbiology. 11 (1), 33-44 (2013).
- Cutting, S. M.
- Ricca, E., Baccigalupi, L., Cangiano, G., De Felice, M., Isticato, R. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).
- Falahati-Pour, S. K., Lotfi, A. S., Ahmadian, G., Baghizadeh, A. Covalent immobilization of recombinant organophosphorus hydrolase on spores of Bacillus subtilis. Journal of Applied Microbiology. 118 (4), 976-988 (2015).
- Harrold, Z., Hertel, M., Gorman-Lewis, D. Optimizing Bacillus subtilis spore isolation and quantifying spore harvest purity. Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 325-329 (2011).
- Nicholson, W. L., Setlow, P. Sporulation, germination and outgrowth. Molecular biological methods for Bacillus. , John Wiley and Sons, Chichester, UK. (1990).
- Mora-Uribe, P., et al. Characterization of the adherence of Clostridium difficile spores: the integrity of the outermost layer affects adherence properties of spores of the epidemic strain R20291 to components of the intestinal mucosa. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 99 (2016).
- Paidhungat, M., Setlow, P. Role of ger proteins in nutrient and nonnutrient triggering of spore germination in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 182 (9), 2513-2519 (2000).
- Schnizlein-Bick, C., Spritzler, J., Wilkening, C., Nicholson, J., O'Gorman, M. Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Site Investigators and The NIAID DAIDS New Technologies Evaluation Group. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 7 (3), 336-343 (2000).
- Rapid enumeration of viable spores by flow cytometry. US Patent. Godfrey, A., Alsharif, R. , US20040023319A1 https://patentimages.storage.googleapis.com/fa/3c/dc/9e08d9ecd1b315/US20040023319A1.pdf (2003).
- Karava, M., Bracharz, F., Kabisch, J. Quantification and isolation of Bacillus subtilis spores using cell sorting and automated gating. PLoS ONE. 14 (7), e021989 (2019).
- Genovese, M., Poulain, E., Doppler, F., Toussaint, R., Boyer, M. Bacillus spore enumeration using flow cytometry: A proof of concept for probiotic application. Journal of Microbiological Methods. 190, 106336 (2021).
- Trunet, C., Ngo, H., Coroller, L. Quantifying permeabilization and activity recovery of Bacillus spores in adverse conditions for growth. Food Microbiology. 81, 115-120 (2019).
- Tehri, N., Kumar, N., Raghu, H., Vashishth, A.
- Isticato, R., Ricca, E., Baccigalupi, L. Spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens. Journal of Visualized Experiments. 145, e59102 (2019).
- Song, M., et al. Killed Bacillus subtilis spores as a mucosal adjuvant for an H5N1 vaccine. Vaccine. 30 (22), 3266-3277 (2012).
