Summary
여기에서 우리는 분자 산소를 소비하는 능력과 독립적으로 포유류 세포의 미토콘드리아 기능을 직접 측정하기 위한 분석 모음을 제시합니다.
Abstract
미토콘드리아 전자 수송 사슬(ETC)의 전자 흐름은 포유류 세포에서 다면적 생합성, 생체 에너지 및 신호 전달 기능을 지원합니다. 산소(O2)는 포유류 ETC에 대한 가장 보편적인 말단 전자 수용체이기 때문에O2 소비율은 미토콘드리아 기능의 프록시로 자주 사용됩니다. 그러나 새로운 연구에 따르면 푸마레이트는 저산소증에서 미토콘드리아 기능을 유지하기 위한 대체 전자 수용체로 사용될 수 있기 때문에 이 매개변수가 항상 미토콘드리아 기능을 나타내는 것은 아닙니다. 이 기사는 연구자들이 O2 소비율과 독립적으로 미토콘드리아 기능을 측정할 수 있도록 하는 일련의 프로토콜을 컴파일합니다. 이러한 분석은 저산소 환경에서 미토콘드리아 기능을 연구할 때 특히 유용합니다. 구체적으로, 우리는 미토콘드리아 ATP 생산, 새로운 피리 미딘 생합성, 복합체 I에 의한 NADH 산화 및 과산화물 생산을 측정하는 방법을 설명합니다. 고전적인 호흡 측정 실험과 함께 이러한 직교하고 경제적인 분석은 연구자들에게 관심 시스템에서 미토콘드리아 기능에 대한 보다 포괄적인 평가를 제공할 것입니다.
Introduction
미토콘드리아 기능은 포유류 세포에서 중요한 생합성, 생체 에너지 및 신호 전달 기능을 유지하기 때문에 세포 건강의 중요한 지표입니다1. 대부분의 미토콘드리아 기능은 전자 수송 사슬(ETC)을 통한 전자 흐름을 필요로 하며, ETC의 전자 흐름 중단은 심각한 미토콘드리아 질환을 유발합니다2. ETC는 내부 미토콘드리아 막에 내장된 일련의 환원 및 산화(산화환원) 반응으로 구성되며, 이러한 전자 전달 반응은 ATP 합성, 열 발생과 같은 생리학적 과정, 새로운 피리미딘 생합성과 같은 생합성 경로 및 NADH와 같은 보조 인자의 산화 환원 상태의 균형을 지원하는 데 활용할 수 있는 자유 에너지를 방출합니다. ETC 복합체 I 및 III은 활성 산소 종(ROS)3,4,5를 생성하며, 이는 차례로 HIF, PI3K, NRF2, NFκB 및 MAPK6과 같은 신호 전달 주요 경로를 조절합니다. 결과적으로, ETC의 전자 흐름 메트릭은 포유류 세포에서 미토콘드리아 기능의 프록시로 고전적으로 사용됩니다.
호흡 측정 실험은 포유류 세포에서 미토콘드리아 기능을 측정하기 위해 자주 사용됩니다. O2는 포유류 ETC에 대한 가장 보편적인 말단 전자 수용체이기 때문에 그 환원은 미토콘드리아 기능의 프록시로 사용됩니다. 그러나 포유류의 미토콘드리아는 새로운 피리미딘 생합성7, NADH 산화7,황화수소 해독8을 포함하여 ETC에 의존하는 미토콘드리아 기능을 유지하기 위해 푸마레이트를 전자 수용체로 사용할 수 있음을 보여줍니다. 따라서, 특정 상황에서, 특히 저산소 환경에서,O2 소비율 (OCR)의 측정은 미토콘드리아 기능의 정확하거나 정확한 지시를 제공하지 않는다.
여기에서는 OCR과 독립적으로 미토콘드리아 기능을 측정하는 데 사용할 수 있는 일련의 분석에 대해 간략하게 설명합니다. 자사는 복합체 I-매개 NADH 산화, 디히드로오로테이트 탈수소효소 매개 de novo 피리미딘 생합성, 복합체 V-의존성 ATP 합성, 숙신산 탈수소효소(SDH) 복합체의 순 방향성 및 미토콘드리아 유래 ROS를 직접 측정하기 위한 분석을 제공합니다. 이러한 분석은 배양된 포유류 세포에서 수행되기 위한 것이지만, 많은 세포 가 생체 내에서 미토콘드리아 기능을 연구하는 데 적용될 수 있습니다.특히, 이 프로토콜에 설명된 분석은 OCR보다 미토콘드리아 기능의 보다 직접적인 측정입니다. 또한, 저산소증에서 미토콘드리아 기능의 측정을 가능하게 하며, 이는 OCR이 지표 측정이 아닌 맥락입니다. 종합하면, 이러한 분석은 고전적인 호흡 측정 실험과 함께 연구자들에게 포유류 세포의 미토콘드리아 기능에 대한 보다 포괄적인 평가를 제공할 것입니다.
Protocol
1. 복합체 I, 디히드로오로테이트 탈수소효소(DHODH) 및 복합체 V 활성의 활성을 측정하기 위한 증식 분석
- 증식 분석을 위한 파종 세포
참고: 이 프로토콜은 ATCC에서 상업적으로 구입한 인간 골육종 세포주 143B를 사용합니다. 이 세포주는 승인된 IBC(Institutional Biosafety Committee) 프로토콜의 지침에 따라 사용되었습니다.- 조직 배양 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. 플레이트에서 배지를 흡인하고 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하여 남은 배지를 제거합니다. PBS를 흡인하고 접시를 0.05%-0.25% 트립신으로 덮어 플레이트 바닥에서 세포를 들어 올립니다.
- 트립신이 플레이트에서 세포를 방출할 때까지 3-5분 정도 기다린 다음 10% 소 태아 혈청(FBS)을 포함하는 원하는 성장 배지 10mL로 트립신을 켄칭합니다.
- 세포를 원뿔형 튜브에 모으고 1,000 × g 에서 5 분 동안 원심 분리하여 세포를 펠렛으로 만듭니다.
- 펠릿을 방해하지 않고 튜브에서 매체를 흡인합니다. 완전한 매체로 펠릿을 다시 매달아 놓습니다.
- 세포 수를 세고 6웰 플레이트에서 10,000개에서 25,000개 사이의 세포를 시딩하는 데 필요한 부피를 정량화합니다.
참고: 각 세포주는 시드할 세포 수에 맞게 최적화되어야 합니다. 달성된 이상적인 합류점은 실험 시작 시 ~10%, 실험 종료 시 ~80%입니다. - 세포를 6-웰 플레이트에 피펫팅하고 2mL의 완전 배지를 웰에 추가합니다. 실험 배지 조건으로 변경하기 전에 24시간 동안 그대로 두십시오.
참고: 조건당 최소 3번의 반복을 시드하고 처리되지 않은 대조군 조건, 억제제 처리 대조군 조건, 처리되지 않은 실험 조건 및 억제제 처리 실험 조건을 테스트하기에 충분한 웰을 시드합니다.
- 증식에 의한 복잡한 V 활성을 평가하기 위한 배지 변화
참고: 갈락토오스가 있는 배지에서 증식하는 세포는 ATP 합성을 위한 복합체 V 활성에 의존한다 9,10. 해당과정(glycolysis)을 통해 순 2개의 ATP를 생성하는 포도당과 달리, 갈락토오스는 아무 것도 생성하지 않아 세포가 ATP 합성을 위해 복합체 V에 의존하게 됩니다(그림 1). 복합 V 억제제 올리고마이신이 대조군으로 사용됩니다.- 10 mM 포도당 함유 배지를 만든다( 표 1 참조).
- 10 mM 갈락토오스 함유 배지를 만든다( 표 1 참조).
- 각 웰의 배지를 포도당 함유 DMEM 또는 갈락토오스 함유 DMEM으로 변경합니다. 5μM 올리고마이신(복합체 V 억제제)을 관련 웰에 추가하고 동일한 부피의 DMSO를 처리되지 않은 웰에 추가합니다. 올리고마이신 스톡은 DMSO에 재현탁된 10 mM이다. 플레이트를 다시 조직 배양 인큐베이터에 2일 동안 넣습니다.
- 증식에 의한 복합체 I 활성을 평가하기 위한 중간 변화
참고: 피루브산이 없는 배지에서 증식하는 세포는 복합체 I 활성11,12에 더 의존합니다. 피루브산이 없는 경우, 배양된 세포는 NAD+로의 대부분의 NADH 재산화를 촉진하기 위해 복합체 I이 필요합니다(그림 2). 콤플렉스 I 억제제 로테논이 대조군으로 사용됩니다.- 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 피루브산이 없는 DMEM 배지를 만듭니다.
- 피루브산의 1M 용액을 만듭니다( 표 1 참조).
- 각 웰의 배지를 피루브산이 없는 배지 또는 피루브산 함유 배지로 변경합니다. 처리된 웰에 2μM 로테논(복합체 I 억제제)을 추가하고 처리되지 않은 웰에 동일한 부피의 DMSO를 추가합니다. 로테논 스톡은 DMSO에서 25mM 재현탁됩니다. 플레이트를 다시 조직 배양 인큐베이터에 2일 동안 넣습니다.
- 증식에 의한 DHODH 활성을 평가하기 위한 중간 변화
참고: 우리딘이 없는 배지에서 증식하는 세포는 디히드로오로테이트 탈수소효소(DHODH) 활성11,12,13을 필요로 합니다. 외인성 우리딘이 없는 경우, 배양된 세포는 de novo 경로를 통해 피리미딘을 합성합니다. DHODH 억제제 brequinar가 대조군으로 사용됩니다.- 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 우리딘이 없는 DMEM을 만듭니다.
- 10 mg/mL 우리딘 원액을 만든 후, 100 μg/mL 우리딘 배지를 준비한다( 표 1 참조).
- 각 웰의 배지를 우리딘이 없는 배지 또는 우리딘 함유 배지로 변경합니다. 처리된 웰에 5μM 브레퀴나(DHODH 억제제)를 추가하고 처리되지 않은 웰에 동일한 부피의 DMSO를 추가합니다. 브레퀴나 스톡은 DMSO에서 10mM 재현탁됩니다. 플레이트를 다시 조직 배양 인큐베이터에 2일 동안 넣습니다.
- 증식 분석을 위한 세포 계수
- 모든 실험에서 2 일마다 배지를 보충하십시오. 매체의 색이 노란색으로 변하면 매체 변경 빈도를 높입니다. 세포가 최대 7일 동안 증식하도록 하고 우물 중 하나라도 자라기 시작하면 실험을 중단합니다. 우물은 합류가 80 %를 초과 할 때 자란 것으로 간주됩니다.
- 배지를 흡인하고, 1x PBS로 세척하고, 0.25% 트립신(6웰 접시의 경우 500μL)으로 웰 바닥을 덮습니다.
- 세포가 접시에서 들어 올려질 때까지 5분 정도 기다립니다. 이것을 현미경으로 확인하십시오.
- 10% FBS를 함유한 완전한 DMEM 1mL로 트립신을 켄칭합니다.
- 세포 덩어리를 분해하기 위해 위아래로 피펫을 사용합니다.
- Coulter 카운터 컵에 각각 10mL의 이소톤 완충액(웰당 한 컵)을 채워 준비합니다. 셀 카운터의 셀 수를 세고 데이터를 기록합니다. 판독값이 밀리리터당 세포 수(cells/mL)인 경우 기록된 값에 1.5를 곱하여 웰당 총 세포 수를 구합니다.
참고: 실험실에 Coulter 계수기가 없는 경우 혈구계와 같은 다른 세포 계수 방법으로 충분합니다.
2. DHODH 활성을 측정하기 위한 13C4-아스파르테이트 안정 동위원소 추적 및 LC-MS 분석
- 13부착 세포에서C4-아스파르테이트 안정 동위원소 추적
참고: DHODH 활성은 13C4-아스파르테이트를 13C3-UMP에 혼입하는 것을 측정하여 직접 모니터링할 수 있습니다. Brequinar는 DHODH 활성에 대한 대조군으로 사용됩니다(그림 3). 13C3-UMP의 결과 수준은 DHODH 활성의 척도이다.- 250,000에서 500,000 사이의 세포를 6 웰 접시에 시드하여 다음날 75 % 합류를 달성합니다.
- 250 mM 13C 4-아스파르테이트 및 10 mM 13C4-아스파르테이트 배지의 원액을 준비하였다(표 1 참조).
- 각 웰의 배지를 10 mM 13C4-아스파르테이트를 함유하는 배지로 변경한다. 관심 있는 세포를 표지하기 위한 정상 상태를 달성하기 위해 적절한 시간 동안 배양합니다.
참고: 정상 상태는 백분율로 표시된 대사 산물이 시간14에 따라 정체되는 시간 프레임으로 정의됩니다. 143B 골육종 세포의 경우, 13C4-아스파르테이트는 8시간까지 정상 상태를 달성합니다. 관심 있는 안정 동위원소로 시간 경과 실험을 수행하여 실험 전에 이 시간 프레임을 결정하는 것이 가장 좋습니다.
- 부착 세포로부터 대사 산물 분리
- 시작하기 전에 드라이 아이스 통을 준비하고 HPLC 등급 물에 80 % HPLC 등급 MeOH를 준비하십시오. 이 버퍼를 -80°C 냉동고에서 밤새 식히거나 드라이아이스에 직접 올려 놓으십시오.
- 인큐베이터에서 한 번에 한 접시씩 꺼내 웰에서 배지를 흡인하고 1x PBS로 2배 세척합니다. 다음 단계로 이동하기 전에 웰에서 잔류 PBS를 모두 제거합니다.
알림: 흡인 중에 플레이트를 기울이고 부착 세포의 파괴를 방지하기 위해 접시 벽에 피펫을 대십시오. - 플레이트를 드라이 아이스에 놓고 즉시 20 % LCMS 등급 물에 800 μL의 80 % LCMS 등급 MeOH를 각 웰에 첨가하십시오.
- 세포 용해를 촉진하기 위해 플레이트를 -80°C 냉동고에서 최소 15분 동안 인큐베이션합니다.
알림: 이 시점에서 다음 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내고 2.2.1-2.2.4 단계를 반복할 수 있습니다. 모든 플레이트가 -80°C 냉동고에서 배양될 때까지 이것을 계속합니다. - 냉동실에서 한 번에 한 접시씩 꺼내 셀 리프터를 사용하여 드라이아이스에서 각 웰을 긁어내고 용해물을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 다음 단계까지 튜브를 드라이 아이스에 보관하십시오.
- 모든 튜브를 4°C에서 10분 동안 와동시킨 다음, 4°C에서 최대 속도(최소 17,000× g)로 10분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 1.5mL 미세원심분리기 튜브로 옮기고 -105°C 콜드 트랩이 장착된 4°C 진공 농축기에서 약 6시간 동안 또는 샘플이 증발할 때까지 고진공 설정에서 건조시킵니다. 용해물이 건조되면 대사 산물 펠릿을 -80 °C에서 질량 분석법(LCMS)과 쌍을 이루는 액체 크로마토그래피를 위해 준비할 준비가 될 때까지 보관합니다.
- 극성 대사산물의 액체 크로마토그래피-질량분석법(LC-MS) 측정
참고: 새로운 피리 미딘 생합성의 중간체인 아스파르테이트를 검출할 수 있는 모든 크로마토그래피 및 질량분석법 워크플로우 및 UMP로 충분합니다14.- 건조된 펠릿에 100μL의 HPLC 등급 물을 첨가하고 4°C에서 10분 동안 볼텍스하여 얼음 위에서 LCMS용 샘플을 준비합니다.
- 샘플을 4°C에서 최대 속도(최소 17,000 × g)로 10분 동안 원심분리하고 25μL를 각 LC-MS 바이알에 넣습니다.
- 2μL의 용해물을 LC-MS 시스템에 주입합니다. 일반적으로 사용되는 방법론은 다음과 같습니다.
- LC-MS 등급의 물에 용해된 20mM 탄산암모늄(LC-MS 등급) 및 0.1% 수산화암모늄(LC-MS 등급)을 포함하는 이동상 A 를 준비합니다.
- 100% 아세토니트릴(LC-MS 등급)을 이동상 B로 선택합니다.
- 크로마토그래피의 경우 친수성 화합물에 대한 2.1mm x 20mm 가드 컬럼이 장착된 5μm, 150mm x 2.1mm 분석 컬럼을 선택합니다( 재료 표 참조). 컬럼 오븐을 25°C로 설정합니다.
- 다음 액체 크로마토그래피 설정을 사용하십시오: 0.15mL/min의 일정한 유속; 20분 동안 80%에서 20% 이동상 B로 선형 기울기, 0.5분 동안 20%에서 80% 이동상 B로 선형 기울기, 80% 이동상 B에서 7.5분 동안 유지.
- 다음 질량 분석기 설정을 선택합니다: m/z 70Da와 1,000Da 사이의 전체 스캔; 70,000의 해상도; 1 × 106의 AGC 목표; 최대 주입 시간은 20ms입니다. 극성 전환 모드에서 소스를 작동하십시오. 스프레이 전압을 3.0kV로, 가열된 모세관을 275°C로, HESI 프로브를 350°C로, 시스 가스 유량을 40단위로, 보조 가스 유량을 15단위로 설정하고, 스윕 가스 유량을 1단위로 설정합니다.
- LCMS 워크플로우와 인터페이스하는 모든 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행합니다.
참고: 위의 워크플로에 사용되는 소프트웨어는 XCalibur(Thermo) 및 TraceFinder(Thermo)입니다. 데이터 분석에 대한 주요 고려 사항은 다음과 같습니다.- 예상 보존 시간: 실험 전에 크로마토그래피 방법을 사용하여 관심 있는 각 대사 산물에 대한 표준물질을 실행하여 각 대사 산물의 머무름 시간을 결정합니다.
참고: UMP와 13C3-UMP를 포함한 동위원소의 머무름 시간은 정확히 동일합니다. - 대사 산물에 대한 예상 M/Z: 대사 산물이 음이온 모드(예: UMP)에서 이온화되면 UMP에서 양성자를 뺀 분자식을 사용하여 예상되는 정확한 질량을 계산합니다[C9H14N2O9P]. 양이온 모드에서 이온화하는 대사 산물의 경우 분자식과 양성자를 사용하여 정확한 질량을 계산합니다.
- 질량 정확도: orbitrap 질량분석기를 사용할 때 관심 대사산물과 동위원소는 질량 정확도가 ±5mmu일 것으로 예상됩니다. 소프트웨어를 사용하여 예상 M/Z와 실제 감지된 M/Z를 고려하여 이를 계산합니다.
- 자연 풍부도 보정 : 모든 추적 데이터는 자연에서 ~1% 13C및 ~0.5% 15 N-동위원소를 설명하기 위해 자연 풍부도 보정을 거칠 것으로 예상됩니다 15.
- 예상 보존 시간: 실험 전에 크로마토그래피 방법을 사용하여 관심 있는 각 대사 산물에 대한 표준물질을 실행하여 각 대사 산물의 머무름 시간을 결정합니다.
3. SDH활성을 측정하기 위한 13 C5-글루타민 안정 동위원소 추적
- 13부착 세포에서C5-글루타민 안정 동위원소 추적
참고: SDH 활성은 13C5-글루타민 추적 7,16,17에서 푸마레이트와 숙신산염의 특정 동위원소의 상호 전환을 측정하여 직접 모니터링할 수 있습니다. 복합체 III 억제제 안티마이신은 SDH 복합체의 순 방향성을 변경하기 위한 대조군으로 사용됩니다(그림 4).- 250,000에서 500,000 사이의 세포를 6 웰 접시에 시드하여 다음날 75 % 합류를 달성합니다.
- 50 mM 13C5-글루타민의 스톡을 준비하였다(표 1 참조).
- 2 mM 13C5-글루타민을 함유하는 추적 배지를 준비한다(표 1 참조).
- 각 웰의 배지를 2 mM 13C5-글루타민을 함유하는 배지로 변경한다. 관심 있는 세포를 라벨링하는 안정된 상태를 달성하기 위해 적절한 시간 동안 배양합니다(2.1.3단계의 참고 참조).
- 단계 2.2의 프로토콜에 따라 대사 산물을 분리합니다.
- 2.3단계에서 설명한 워크플로우에 따라 LC-MS에서 샘플을 분석합니다.
- 라벨링 패턴을 기반으로 SDH 활동 분석
참고: SDH 복합체의 숙시네이트 산화 활성은 13C 5-글루타민 추적시 13C4-푸마르산염 대 13C 4-석시네이트의 비율을 평가하여 모니터링할 수 있습니다. SDH 복합체의 푸마레이트 환원 활성은 13C5-글루타민 추적시 13C3-석시네이트 대 13C3-푸마레이트의 비율을 평가함으로써 모니터링할 수 있다.- 13C3-푸마레이트, 13C4-푸마레이트, 13C3-숙시네이트 및 13C 4-숙시네이트의 백분율 표지를 계산합니다. 예를 들어, 13C3-푸마레이트의 백분율을 결정하기 위해, 푸마레이트 동위원소에 대한 모든 통합 피크 면적(표지되지 않은 푸마레이트, 13C1-푸마레이트, 13C2-푸마레이트, 13C3-푸마레이트, 및 13C4-푸마레이트)을 합산하고, 13C3-푸마레이트에 대한 피크 면적을 총 동위원소 면적으로 나눕니다. 100을 곱합니다.
- 숙시네이트 산화를 계산하기 위해, 백분율 13 C 4-푸마레이트를 백분율 13C4-숙시네이트로 나눕니다.
- 푸마레이트 환원을 계산하기 위해, 백분율 13 C 3-숙시네이트를 백분율 13C3-푸마레이트로 나눕니다.
4. 직접 복합체 I 활성 분석
참고 : DCPIP는 인공 전자 수용체입니다. 유비퀴놀에서 전자를 받아들일 때 환원된 형태로 바뀝니다. 이 분석에서 유비퀴논은 NADH의 NAD+로의 복합체 I 매개 산화를 통해 유비퀴놀로 환원됩니다. 따라서, 이러한 무세포 분석에서 산화된 DCPIP의 회전율을 측정하는 것은 복합체 I 활성에 대한 프록시이다 7,18.
- 세포에서 미토콘드리아를 정제하고 정량화하는 방법
참고: 모든 미토콘드리아 정제 프로토콜이 이 분석에 활용될 수 있습니다19.- 25-1억 개의 세포가 얻어질 때까지 세포를 확장합니다. 접시에서 배지를 흡인하고, 1x PBS로 세척하고, PBS를 흡인하고, 0.25% 트립신으로 세포를 시험해 봅니다. 트립신을 배양 배지로 켄칭하고 세포를 1,000 × g 에서 5 분 동안 펠렛화합니다.
- 세포 펠릿을 1x PBS 5mL로 2x 세척하고 1,000× g 에서 5분 동안 원심분리를 반복하여 세포를 펠렛화합니다. 세척된 펠릿을 미토콘드리아 정제가 될 때까지 -20°C 냉동고에 보관합니다.
알림: 세포 펠릿을 두 번 이상 동결-해동하지 마십시오. - 미토콘드리아 분리 완충액을 준비합니다( 표 1 참조).
참고: NaOH와 같은 나트륨 함유 시약은 나트륨이 미토콘드리아 막 전위(20 )를 손상시키고 미토콘드리아 칼슘 항상성(21)을 방해하기 때문에 미토콘드리아 분리 완충액을 준비하는 데 사용해서는 안 됩니다. - 세포 펠릿을 미토콘드리아 분리 완충액 1mL당 1,000만 개의 세포로 재현탁합니다. 예를 들어, 10mL의 미토콘드리아 분리 완충액에 1억 개의 펠렛 세포를 재현탁합니다.
알림: 버퍼에 기포가 유입되지 않도록 세포 덩어리를 방해해야 합니다. - 2mL의 세포 현탁액을 Potter-Elvehjem PTFE 유봉과 호환되는 작업 부피 3-8mL의 사전 냉각 유리 균질화기로 옮깁니다. 세포를 10-20회 스트로크로 균질화하고 현미경으로 세포를 모니터링하여 균질화 과정 전반에 걸쳐 세포 용해를 확인합니다. 효율적인 세포 용해를 보장하기 위해 필요한 경우 스트로크 수를 늘립니다.
참고: 위의 방법으로 세포를 균질화하는 것이 세포 용해에 효과적이지 않은 경우 주사기 용해 방법22로 전환하십시오. - 세포 용해물 2mL를 얼음 위의 미세 원심분리 튜브로 옮기고 전체 세포 현탁액이 균질화될 때까지 위의 단계를 반복합니다.
- 핵 및 세포 파편을 4°C 원심분리기에서 10분 동안 650 × g 에서 펠렛화한다.
- 상층액을 새로운 2.0 mL 튜브로 옮기고, 4°C에서 10분 동안 650 × g 에서 위의 원심분리를 반복한다.
- 상청액을 새로운 2.0 mL 튜브로 옮기고, 4°C 원심분리기에서 10분 동안 7,000 × g 의 미토콘드리아를 펠렛화한다.
- 상층액을 버리고 펠릿을 1mL의 미토콘드리아 분리 완충액에 재현탁합니다. 단백질 정량을 위해 50 μL를 새 튜브로 옮깁니다. 샘플의 두 부분 표본(50 μL 샘플 및 나머지 ~950 μL)에 대해 위의 원심분리 단계를 반복합니다.
- 상층액을 버리고 펠릿을 사용할 준비가 될 때까지 -80 °C 냉동고에 보관하십시오.
- 50μL 분취액의 펠릿에 200μL의 RIPA 버퍼를 추가하여 단백질을 추출하고 10분 동안 소용돌이치고 21,000× g 에서 원심분리하여 단백질을 분리합니다. 50 μL 분취액의 단백질 양을 정량화하고 이 수치를 사용하여 950 μL 샘플의 나머지 단백질을 정량합니다. 예를 들어, 50 μL 분취량에 대한 단백질 정량이 1 μg/μL인 경우, 나머지 미토콘드리아 펠릿의 총 단백질은 950 μg(1 μg/μL × 950 μL)입니다.
- 복합체 I 활성 분석 수행
참고: 143B 골육종 세포주가 이 분석에 활용되었지만 프로토콜은 모든 배양된 세포에 적용할 수 있습니다.- 정제된 미토콘드리아를 미토콘드리아 재현탁 완충액( 표 1 참조)에 5mg 단백질/mL의 최종 농도로 재현탁합니다.
- 미토콘드리아를 투과시키기 위해 -20°C 냉동고에서 5번의 동결/해동 주기를 수행합니다.
- 복합체 I 활성 분석 완충액을 확인한다( 표 1 참조).
- 5mg/mL 미토콘드리아 스톡 50ug을 복합체 I 활성 완충액 90μL와 혼합합니다. 복합 I 활성을 제어하기 위해 5개의 처리되지 않은 복제물과 5개의 로테논 처리된(5μM) 복제물을 준비합니다.
- 37°C로 설정된 플레이트 리더에서 600nm에서의 기준선 흡광도를 읽습니다.
- NADH를 2mM의 최종 농도로 첨가하여 반응을 시작하고, 1시간 동안 흡광도(600nm)를 추적하여 최소 2분마다 측정합니다. 흡광도의 감소는 복합체 I 활성을 통한 DCPIP의 감소를 나타낸다.
참고: NADH는 모든 샘플이 동시에 시작되도록 하기 위해 멀티채널 피펫을 사용하여 추가해야 합니다.
5. 과산화물 수준을 측정하기 위한 LC-MS 기반 분석
참고: MitoSox Red의 형광 특성은 슈퍼옥사이드23과의 반응과 무관하게 변할 수 있습니다. 이 LC-MS 기반 분석은 MitoSox Red와 반응하는 과산화물의 생성물을 직접 측정합니다. 다음 분석은 Xiao et al.24에서 약간 수정되었습니다. 2-하이드록시미토에티듐(2-OH MitoE2+)은 슈퍼옥사이드 반응의 산물입니다(그림 5). 이 분석에는 Caki1 세포주가 사용되었지만 프로토콜은 모든 배양된 세포에 적용할 수 있습니다.
- 부착 세포를 MitoSox Red로 치료
- 250,000에서 500,000 사이의 세포를 6 웰 접시에 시드하여 다음날 75 % 합류를 달성합니다. LC-MS 분석을 위한 플레이트 세트와 세포 수 정규화를 위한 플레이트 중복 세트를 시드해야 합니다.
- Dulbecco의 변형된 Eagle 배지에서 10% 열 비활성화 FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 완전한 DMEM을 준비합니다.
- 모든 조건에 대해 모든 웰에서 배지를 2mL의 완전한 DMEM으로 새로 고칩니다. 이 시점에서 관심 있는 약물이나 치료법을 추가해야 합니다.
- 조직 배양 인큐베이터에서 세포를 1시간 동안 인큐베이션합니다.
- 양성 및 음성 대조군을 준비하십시오. PBS에 희석된 50mM tert-부틸 하이드로퍼옥사이드 스톡과 DMSO에 희석된 N-아세틸 시스테인(NAC)의 250mM 스톡을 준비합니다( 표 1 참조).
참고: 테르트부틸 하이드로퍼옥사이드(tBuOOH)는 양성 대조군으로 작용하고 2-OH MitoE2+의 양을 증가시키는 강력한 활성 산소 종입니다. NAC는 음성 대조군 역할을 하고 tBuOOH로 인한 과산화물 생성을 중화하는 강력한 항산화제입니다. - 양성 대조군 웰에 tBuOOH 1μL를 추가하고 음성 대조군 웰에 tBuOOH 1μL + NAC 100μL를 추가합니다.
참고: P2 피펫(0.1-2 μL 범위)을 사용하는 것이 1 μL를 이송하는 최적의 방법입니다. - 조직 배양 인큐베이터에서 1시간 동안 배양합니다.
- 1 mM MitoSox Red 스톡 (표 1 참조)을 준비하고, 1 μM의 최종 농도를 달성하기 위해 각 웰에 1 mM MitoSox Red 2 μL를 첨가한다.
- 이 최종 배양 동안, 최종 LC-MS 데이터를 정규화하기 위해 세포 계수를 획득하기 위해 중복 플레이트 중 하나를 계수합니다.
- 부착 세포에서 산화된 Mitosox Red 제품의 분리
- 드라이아이스 한 통을 가져와서 분리를 시작하기 전에 드라이아이스에 차가운 HPLC 등급 이소프로판올을 놓습니다.
- 한 번에 하나의 플레이트를 꺼내 웰에서 배지를 흡인하고 1x PBS 1mL로 2x 세척합니다. 다음 단계로 이동하기 전에 웰에서 모든 잔류 PBS를 흡인합니다.
알림: 흡인 중에 플레이트를 기울이고 부착 세포의 파손을 방지하기 위해 접시 벽에 피펫을 대십시오. - 플레이트를 드라이 아이스에 놓고 800 μL의 HPLC 등급 이소프로판올을 각 웰에 첨가합니다.
- 세포 용해를 촉진하기 위해 플레이트를 -80°C 냉동고에서 최소 15분 동안 인큐베이션합니다.
알림: 이 시점에서 다음 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 5.2.1-5.2.4 단계를 반복할 수 있습니다. 모든 플레이트가 -80°C 냉동고에서 배양될 때까지 이것을 계속합니다. - 냉동실에서 한 번에 한 접시씩 꺼내 셀 리프터를 사용하여 드라이아이스에서 각 웰을 긁어내고 용해물을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 다음 단계까지 튜브를 드라이 아이스에 보관하십시오.
- 모든 튜브를 4°C에서 10분 동안 와동시킨 다음, 4°C에서 최대 속도(최소 17,000× g)로 10분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 1.5mL 미세원심분리기 튜브로 옮기고 진공 농축기에서 건조시킵니다. 용해물이 건조되면 LC-MS가 준비될 때까지 대사산물 펠릿을 -80°C에서 보관합니다.
- MitoSox Red 및 2-하이드록시미토에티듐(2-OH MitoE2+)의 LC-MS 측정
- HPLC 등급 MeOH:클로로포름:물의 3:3:1 혼합물 100μL를 추가하여 얼음 위에서 LCMS용 샘플을 준비합니다. 4°C에서 10분 동안 소용돌이칩니다.
- 25 μL를 각 LC-MS 바이알에 옮깁니다. 나머지 샘플을 -80°C 냉동고에 보관합니다.
- 다음 액체 크로마토그래피 완충액을 제조한다: i) 완충액 A: 0.1% 포름산을 함유한 HPLC 등급 물; ii) 완충액 B: 0.1% 포름산을 함유한 HPLC 등급 아세토니트릴.
- Thermo XCalibur Instrument Setup 앱을 열어 분석법 개발을 시작합니다.
- 이 창의 왼쪽 사이드바에 있는 두 개의 상자를 찾습니다 - 첫 번째 상자는 크로마토그래피 분석법 개발을 허용하고 두 번째 상자는 질량 분석법 개발을 허용합니다.
- 액체 크로마토그래피 분석법 개발:
- 유속을 0.25mL/분으로 설정하고 방법을 20% B에서 시작하여 12분 동안 95% B까지 상승시킵니다. 다음 1분 동안 버퍼 B를 다시 20% B로 떨어뜨리고 다음 2분 동안 이 수준을 유지합니다.
참고: 20% B에서 마지막 2분 동안 흐르는 것은 컬럼 압력이 초기 압력으로 다시 떨어지고 적절한 버퍼 비율로 컬럼을 평형화하는 데 중요합니다. 이 평형화 단계를 포함하지 않으면 이후에 실행되는 모든 샘플에 대해 머무름 시간이 변경됩니다.
- 유속을 0.25mL/분으로 설정하고 방법을 20% B에서 시작하여 12분 동안 95% B까지 상승시킵니다. 다음 1분 동안 버퍼 B를 다시 20% B로 떨어뜨리고 다음 2분 동안 이 수준을 유지합니다.
- 다음 매개 변수를 사용하여 Tune 파일을 만듭니다.
- Tune 앱을 열고 새 tune 파일을 만듭니다.
- 메서드 설정 모듈(5.3.9.3단계 참조)에서 겹치는 설정을 이 조정 파일에 적용합니다(스캔 범위, 해상도, 극성, AGC 대상 및 최대 IT 포함).
- Sheath 가스를 30으로, Aux 가스를 3으로, Sweep 가스도 3으로 설정합니다. 스프레이 전압을 3kV로, 모세관 온도를 300으로, S-렌즈 RF 레벨을 60으로 설정합니다.
- 질량분석법 개발:
- 잠재적 스캔의 왼쪽 하단 목록에서 Full MS 를 창 중앙으로 끌어다 놓습니다. 드롭 후 전체 MS 사각형 을 클릭하여 설정을 조정해야 합니다. 총 MS 분석법 지속 시간은 13분입니다.
참고: LC 분석법은 최종 2분이 대사산물 정량이 아닌 컬럼 재조정을 위한 것이기 때문에 MS 분석법보다 깁니다. - 모듈 오른쪽의 메서드 속성에서 메서드 기간 및 실행 시간이 13.00분으로 설정되어 있는지 확인합니다.
- 이 전체 스캔을 해상도 70,000 및 AGC 대상 1 × 106에서 양수 모드로 실행합니다. 최대 IT를 100ms로 설정하고 스캔 범위를 300m/z에서 700m/z로 설정합니다.
- 모듈 위쪽의 파일 튜닝에서 방금 만든 튜닝 파일이 이 메서드에 연결되어 있는지 확인합니다.
- 잠재적 스캔의 왼쪽 하단 목록에서 Full MS 를 창 중앙으로 끌어다 놓습니다. 드롭 후 전체 MS 사각형 을 클릭하여 설정을 조정해야 합니다. 총 MS 분석법 지속 시간은 13분입니다.
- 2 μL 시료 주입으로 MitoSox Red 검출 분석법을 실행합니다.
Representative Results
DHODH, 복합체 I 및 복합체 V의 활성은 모두 증식 분석을 사용하여 평가할 수 있습니다. 배양 배지에서 우리딘이 제거되면 세포는 피리미딘 생합성을 위한 새로운 경로에 더 의존하게 됩니다. 따라서, 세포가 우리딘이 없는 배지에서 증식하도록 도전을 받았을 때, 그들은 우리딘을 함유한 배지에서 배양된 세포보다 브레퀴나에 의한 DHODH 활성의 억제에 더 민감하였다(도 6A). 유사하게, 배양 배지로부터의 피루브산의 박탈은 세포를 증식을 위한 복합체 I 활성에 더 의존하게 만든다. 따라서, 세포가 피루브산이 없는 배지에서 증식하도록 도전을 받았을 때, 그들은 피루브산-함유 배지에서 배양된 세포보다 로테논에 의한 복합체 I 활성의 억제에 더 민감하였다(도 6B). 복합체 V 활성은 포도당 대신 갈락토오스를 함유하는 배지에서 증식하도록 세포에 도전함으로써 평가할 수 있습니다. 갈락토오스는 해당과정에서 순 제로 ATP를 생성하므로 이 연료에서 성장하는 세포는 복잡한 V 활성을 통한 미토콘드리아 ATP 합성에 더 의존합니다. 따라서, 갈락토오스-함유 배지에서 증식하는 세포는 글루코스-함유 배지에서 증식하는 세포보다 올리고마이신에 의한 복합체 V 억제에 더 민감하였다 (도 6C).
SDH 활성은 13C5-글루타민 추적을 사용하고 푸마르산염 및 숙신산 동위원소로의 결합을 모니터링하여 측정할 수 있습니다. 비히클-처리된 조건에서, SDH 복합체는 순방향 활성을 선호하였고, 13C4-푸마레이트 내로의 13C4-석시네이트의 혼입은 13C3-석시네이트 내로의 혼입보다 더 높았다 (도 7). 항마이신 처리 조건에서, SDH 복합체는 역활성을 선호했고, 13C3-석시네이트로의 13C3-푸마르산염의 혼입은 13C4-석시네이트를 13C4-푸마르산염으로의 혼입보다 더 컸다(도 7).
미토콘드리아 내부의 슈퍼옥사이드 생성은 슈퍼옥사이드와의 반응 시 2-하이드록시미토에티듐을 생성하는 형광 리포터 MitoSox를 사용하여 측정할 수 있습니다. 이 연구에서, tertbutyl hydrogen peroxide의 존재 하에서 MitoSox로 처리 된 세포는 세포 ROS를 소멸시키는 항산화 제 인 NAC의 첨가에 의해 억제되는 방식으로 2- 하이드 록시 - 미토에 티듐 (2- hydroxy-mitoethidium)의 수치가 더 높았다 (그림 8).
그림 1: 복잡한 V 증식 분석에 대한 기계론적 기초. 해당과정을 통한 포도당과 갈락토오스의 산화. 포도당은 해당 과정에서 순 2 개의 ATP를 생성하는 반면, 갈락토오스는 UTP 합성이 UDP- 갈락토오스에 필요하기 때문에 순 제로 ATP를 산출합니다. 따라서 갈락토오스에서 성장한 세포는 해당과정에서 생성된 ATP가 부족하기 때문에 미토콘드리아 ATP 합성에 더 의존합니다. 약어: GALK = 갈락토키나제; GALT = 갈락토오스-1-포스페이트 우리딜릴트랜스퍼라제; PGM1 = 포스포글루코뮤타제 1; GPI = 포도당-6-포스페이트 이성질화효소, UGP = UDP-글루코스 피로포스포릴라제; GALE = UDP-갈락토오스-4-에피머라제; NDK = 뉴클레오티드 디포스페이트 키나아제; UMPK = 우리딘 모노포스페이트 키나아제; HK = 헥소키나제; PFK = 포스포프럭토키나제; 알도 = 알돌라아제; TPI = 트리오오스포스페이트 이성질화효소; GAPDH = 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소; PGK = 포스포글리세레이트 키나아제; PGM = 포스포글루코뮤타제; ENO = 에놀라아제; PK = 피루브산 키나아제. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 복합체 I 증식 분석에 대한 기계론적 기초. 복합체 I 활성의 억제에 따라 변경되는 대사 경로의 개략도. 고-피루브산 매질에서, 복합체 I 억제는 LDH-매개 NADH 산화를 통해 우회된다. 저 피루브산 배지에서 이러한 적응은 실현 가능성이 낮아 세포가 NADH를 재산화하기 위해 복합체 I 활성에 더 의존하게 만듭니다. 약어: LDH = 젖산 탈수소효소; TCA 사이클 = 트리카르복실산 사이클. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 13C4-아스파르테이트 추적에 따른 DHODH 반응의 개략도. Brequinar는 디히드로로테이트 산화가 오로테이트로 산화되는 것을 억제하여 UMP의 다운스트림 합성을 방지합니다. 13C4-아스파르테이트는 DHODH 활성을 통해 13C3-UMP에 혼입된다. 약어: OMM = 외부 미토콘드리아 막; IMM = 내부 미토콘드리아 막; DHODH = 디히드로오로테이트 탈수소효소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 13C5-글루타민 추적을 통한 정방향 및 역방향 복합체 II 활성 측정. 순방향 콤플렉스 II 활성을 측정하기 위해(왼쪽), 13C5-글루타민을 13C4-숙시네이트 및 13C4-푸마레이트로 혼입시키는 것을 모니터링합니다. 역 복합체 II 활성을 측정하기 위해(오른쪽), 13C5-글루타민을 13C3-숙시네이트 및 13C3-푸마레이트에 혼입시키는 것을 모니터링합니다. 약어: SDH = 숙시네이트 탈수소효소; CytC = 시토크롬 C. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: MitoSox Red와 과산화물의 반응. MitoSox와 미토콘드리아 과산화물의 반응은 2-OH-MitoE2+를 형성합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 증식 기반 분석 법 (A) ±100ug/mL 우리딘이 함유된 배지에서 DHODH 억제제인 5uM 브레키나로 처리된 143B 골육종 세포의 증식. 데이터는 SEM± 평균입니다. 조건당 N = 3. (B) ±5 mM 피루브산으로 배지에서 복합체 I 억제제인 2 uM 로테논으로 처리된 143B 골육종 세포의 증식. 데이터는 SEM± 평균입니다. 조건당 N = 3. (C) 10mM 포도당 또는 10mM 갈락토오스를 유일한 중심 탄소원으로 하는 배지에서 복합체 V 억제제인 5uM 올리고마이신으로 처리된 143B 골육종 세포의 증식. 데이터는 SEM± 평균입니다. 조건당 N = 3. *는 Graphpad Prism에서 일원 분산 분석(one-way ANOVA test)을 사용한 p < 0.05를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 복합체 II 활성을 측정하기 위한 13개의 C5-글루타민 추적. DMSO 및 500 nM 안티마이신 A-처리된 Caki1 및 DLD1 세포에서의 숙신산 산화 및 푸마레이트 환원(SDH 역방향). 데이터는 평균 ± SEM을 나타냅니다. 조건당 N = 3. GraphPad Prism에서 unpaired t-검정을 사용하여 p < 0.05를 나타냅니다. 약어: SDH = 숙신산 산화; SDH 역방향 = 푸마레이트 환원. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 과산화물을 검출하기 위한 LCMS 기반 MitoSox 분석. Nac tBuOOH의 존재 하에 30분 동안 MitoSox로 처리된 Caki1 세포로부터 분리된 2-OH-Mito E2+ 의 추출된 이온 크로마토그램±. 약어: LCMS = 액체 크로마토그래피-질량 분석법; NAC = N- 아세틸 시스테인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 이 프로토콜에 사용된 시약, 완충액 및 배지의 구성. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
포유류의 미토콘드리아가 분자 산소를 소비하지 않고도 기능할 수 있다는 새로운 연구가 입증됨에 따라 연구자들은 미토콘드리아 기능을 정확하게 정량화하기 위해 OCR 측정을 넘어 직교 분석을 사용하는 것이 가장 중요합니다. 여기에서 우리는 미토콘드리아 NAD+/NADH 균형, 적응 말단 전자 수용체의 활용, ATP 생성, de novo 피리미딘 생합성 및 미토콘드리아 유래 ROS를 측정하여 복합체 I, 복합체 II, 복합체 V 및 DHODH의 활성을 직접 평가하는 데 사용할 수 있는 일련의 분석을 수집했습니다. 특히, 이러한 분석은 OCR 측정보다 미토콘드리아 기능을 더 직접적으로 측정합니다. 또한, 이러한 분석은 연구자들에게 저산소증 동안 미토콘드리아 기능을 정량화할 수 있는 다루기 쉬운 방법을 제공하며, 이는 푸마레이트가 선호되는 말단 전자 수용체로 사용되기 때문에 OCR 측정이 크게 관련이 없습니다. 마지막으로, 여기에 설명된 증식 기반 방법은 기존의 호흡기 측정 실험보다 비용 효율적이므로 포유류 시스템에서 미토콘드리아 기능을 연구할 수 있는 광범위하게 접근 가능한 방법을 제공합니다.
배양된 세포에서 미토콘드리아 기능을 측정하기 위해 이러한 분석을 사용할 때 주요 고려 사항이 있습니다. 증식 분석과 관련하여, 각 세포주의 배가 속도를 위해 시딩된 세포의 수를 조정하는 것이 중요하다. 세포는 증식의 차이를 정량화할 수 있도록 최소 10%의 합류점과 3-4배의 배가를 허용할 수 있는 충분한 공간이 있어야 합니다. 각 분석에 대한 또 다른 고려 사항은 각 ETC 복합체의 활성에 대한 대조군으로 사용되는 소분자의 농도입니다. 서로 다른 세포주가 이러한 억제제에 대해 서로 다른 민감도를 나타낼 수 있으므로 최적의 농도를 확인하기 위해 이러한 소분자의 용량을 테스트하는 것이 중요합니다.
OCR 측정 및 여기에 설명된 모든 분석을 포함하여 시험관 내에서 미토콘드리아 기능을 연구하는 분석의 보편적인 한계는 배양 배지의 대사 구성입니다. 표준 세포 배양 배지는 시스템을 표면적으로 높은 수준의 미토콘드리아 기능으로 편향시키는 경향이 있습니다. 예를 들어, 초생리학적 글루타민 수치는 미토콘드리아 NADH 합성을 촉진하고 결과적으로 산화적 인산화를 증가시키는 TCA 주기25의 역고세균을 증가시킵니다. 유사하게, 산소 분압은 포유동물 조직에서 3 mmHg 내지 100 mmHg (대략 0.1%-13%O2) 사이이지만, 시험관 내에서는 대기 (140 mmHg, 대략 21%)이다 26,27. 이러한 과잉O2는 미토콘드리아 호흡 능력과 과산화물 생산을 최대화한다28. 최근에, 보다 생리학적으로 배양 배지를 설계하려는 노력이 이루어지고 있다29,30. 특히, 인간 혈장 유사 배지에서 세포를 배양하면 일부 암 세포주(30)에서 미토콘드리아 호흡, T 세포(31)에서 미토콘드리아 ROS, 암 치료제에 대한 미토콘드리아 적응(32)이 감소합니다. 따라서 사용되는 배양 배지의 구성을 염두에 두고 이것이 미토콘드리아 기능에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 이해하는 것이 중요합니다.
미토콘드리아 기능의 해석에서 또 다른 중요하고 보편적인 한계는 미토콘드리아 수의 차이에 대한 가능성입니다. 그러므로, mtDNA33의 정량화, 막 전위-비감응성 염료(34)를 이용한 미토콘드리아 질량의 측정, 또는 미토콘드리아 마커의 웨스턴 블로팅을 통해 미토콘드리아 함량을 측정하는 것이 중요하다. 이것은 미토콘드리아 수의 감소가 미토콘드리아 기능의 감소로 오인되지 않도록 하는 중요한 제어입니다.
여기에 설명된 분석에 적용되는 특정 제한 사항 및 문제 해결도 있습니다. 첫째, 분화된 세포가 증식하지 않는다는 점을 감안할 때, 증식 기반 분석은 이러한 맥락에서 미토콘드리아 기능을 평가하는 데 유용하지 않을 것입니다. DHODH 활성을 측정하기 위한 13C4-아스파르테이트 추적 프로토콜의 주요 한계는 세포에서의 아스파르테이트 흡수가 매우 비효율적일 수 있다는 것이다35. 이러한 잠재적 한계를 극복하기 위해, 연구자들은 아스파르테이트 수송체인 SLC1A3을 과발현시켜 13C4-아스파르테이트 흡수를 촉진할 수 있다35.
SDH 활성을 측정하기 위해 13C5-글루타민 추적을 사용하는 프로토콜의 한계는 이 분석에서 세포가 역활성을 측정하기 위해 M+3 동위원소를 풍부하게 하기 위해 환원성 카르복실화 경로를 활용해야 한다는 것입니다. 일부 세포주는 낮은 ATP 시트레이트 분해효소 발현36, 불충분한 HIF 안정화 37, 또는 너무 낮은 α-KG:시트레이트 비율38로 인해 환원성 카르복실화 플럭스가 불가능합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, SDH 정방향 및 역방향 활성을 측정하기 위해 13C4-아스파르테이트 추적을 이용할 수 있다7. 이 분석에서, SDH 정방향 활성은 푸마르산염 M+2:숙시네이트 M+2의 비율과 숙신산염 M+4:푸마르산염 M+4에 의한 역반응에 의해 측정될 수 있다. 특히, 이 추적은 환원성 카르복실화 경로에서 대부분의 효소를 우회합니다.
판독으로 DCPIP 감소를 사용하는 복합체 I 활성 분석의 한계는 미토콘드리아가 구조적으로 손상되지 않는다는 것입니다. 분석을 위한 그들의 NADH 흡수를 가능하게 하기 위해 미토콘드리아를 동결-해동시키는 과정은 확실히 미토콘드리아 막의 구조적 완전성을 손상시킬 수 있다39. 이 분석은 관찰된 복합체 I 활성의 변화가 온전한 세포에서도 사실임을 보장하기 위해 복합체 I 증식 분석과 같은 분석과 병행하여 수행되어야 합니다.
향후 연구에서 이러한 기술 중 일부는 마우스 및 Caenorhabditis elegans 와 같은 모델 유기체를 사용하여 생체 내에서 미토콘드리아 기능을 측정하는 데 적용될 수 있습니다.생체 내에서 미토콘드리아 기능을 측정하는 데 사용되는 현재 방법은 유기체 수준 OCR, 특히 마우스 모델을 사용할 때의 호흡 교환률에 중점을 둡니다. 이 방법의 분명한 한계는 산소가 미토콘드리아 ETC에서 유비쿼터스 말단 전자 수용체로서의 역할을 넘어 많은 생화학적 및 신호 전달 기능을 수행한다는 것입니다. 예를 들어, 산소는 디옥시게나제 계열의 효소의 촉매 활성에 의해 "소비"됩니다. 이러한 효소는 세포 산소 소비율에 기여하지만 미토콘드리아 기능에 참여, 조절 또는 반영하지 않습니다. 시험관 내 고전적인 호흡 측정 실험은 일반적으로 "비미토콘드리아 OCR"을 제어하는 반면, 유기체 호흡 교환비(RER) 실험은 이를 제어할 수 없으므로 RER을 생체 내 미토콘드리아 기능에 대한 메트릭으로 해석하는 것이 제한됩니다. 그러나, 생체 내에서 미토콘드리아 기능을 측정하기 위해 13C4-아스파르테이트 추적을 통한 DHODH 활성, 13C5-글루타민 추적을 통한 복합체 II 활성, 조직으로부터 정제된 미토콘드리아에 대한 복합체 I 활성, 및 미토콘드리아 ROS를 통해 미토콘드리아 기능을 측정하기 위해 프로토콜을 적용하는 것이 가능하다. 미토콘드리아 기능을 조사하기 위한 이러한 직접적인 분석은 고전적인 호흡 측정 실험과 함께 연구자들에게 포유류 세포 및 조직의 미토콘드리아 기능에 대한 보다 포괄적이고 정확한 평가를 제공합니다.
Disclosures
저자는 보고할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 원고에서 제작 된 그림은 BioRender.com 로 만들어졌습니다. 이 기사에 대한 피드백을 제공해 주신 Amy Walker에게 감사드립니다. JBS는 우스터 생물 의학 연구 보조금 재단의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube | Cell Treat | 667443 | |
| 2.0 mL tube | Cell Treat | 229446 | |
| 6-well plate | Cell Treat | 229106 | |
| 12-well plate | Cell Treat | 229112 | |
| 13C4-aspartate | Sigma-Aldrich | 604852 | |
| 13C5-Glutamine | Cambridge Isotope Laboratories | 285978-14-5 | |
| 15 mL centrifuge tube | Cell Treat | 667411 | |
| 50 mL centrifuge tube | Cell Treat | 667421 | |
| 150 mm tissue culture dish | Cell Treat | 229651 | |
| 1x Phosphate-buffered saline | Gibco | 10010049 | |
| 2,6-dichlorophenolindophenol | Honeywell | 33125 | |
| Ammonium Carbonate | Sigma-Aldrich | 37999 | |
| Antimycin | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Ascentis Express C18 | Sigma-Aldrich | 53825-U | |
| Bottle top filter 500 mL, 0.22 µm, PES 9 9 mm membrane diameter | Cell Treat | 229717 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Brequinar | Sigma-Aldrich | SML0113 | |
| Cell Lifter, Double End Flat and Narrow Blade | Cell Treat | 229305 | |
| CentriVap -105 Cold Trap | Labconco | 7385020 | |
| Complete Protease Inhibitor Tablets | Sigma-Aldrich | 4693116001 | |
| Coulter Counter Cups | Fisher Scientific | 07-000-694 | |
| Decylubiquinone | Sigma-Aldrich | D7911 | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Eppendorf Centrifuge 5425R | Eppendorf | 2231000908 | |
| Eppendorf Centrifuge 5910 Ri | Eppendorf | 5943000343 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G5388 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Glucose-free DMEM | Gibco | 11966025 | |
| Glutamine-free DMEM | Thermo Fisher | 11960044 | |
| Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| HPLC-grade 35% Ammonium hydroxide | Thermo Scientific | 460801000 | |
| HPLC-grade Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 900667 | |
| HPLC-grade Chloroform | Sigma-Aldrich | 366927 | |
| HPLC-grade formic acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| HPLC-grade Isopropanol | Sigma-Aldrich | 563935 | |
| HPLC-grade MeOH | Sigma-Aldrich | 900688 | |
| HPLC-grade Water | Sigma-Aldrich | 270733 | |
| Human Osteosarcome Cell Line 143B | ATCC | CRL-8303 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 320331-500ML | |
| Isotone buffer | Beckman Coulter | 8546719 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P2222 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| MitoSox Red | Invitrogen | M36008 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351-5MG | |
| Pencillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder, Size 21 | Kimble | 885502-0021 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Pyruvate-free DMEM media | Gibco | 11965175 | |
| Q Exactive Plus Mass Spectrometer | Thermo Scientific | 726030 | |
| ReCO2ver Incubator | Baker | ||
| Refrigerated Centrivap Benchtop Vacuum Concentrator | Labconco | 7310020 | |
| RIPA Buffer | Millipore Sigma | 20188 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| SeQuant ZIC-pHILIC 5μm 150 x 2.1 mm analytical column | Sigma-Aldrich | 1.50460.0001 | |
| SeQuant ZIC-pHILIC guard kit | Millipore Sigma | 1.50438.0001 | |
| Sodium Hydroxide, Pellets | Millipore Sigma | 567530-250GM | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SW, TRACEFINDER 5.1 SP3 | Thermo Scientific | OPTON-31001 | |
| Tert-butyl hydroperoxide solution | Sigma-Aldrich | 458139 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | 93352 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25-200-114 | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| VANQUISH HORIZON / FLEX HPLC | Thermo Scientific | VF-S01-A-02 | |
| Z2 Coulter Particle count and size analyzer | Beckman Coulter | BZ10131270 |
References
- Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
- Gorman, G. S., et al.
- Chandel, N. S., et al. Reactive oxygen species generated at mitochondrial complex III stabilize hypoxia-inducible factor-1alpha during hypoxia: A mechanism of O2 sensing. Journal of Biological Chemistry. 275 (33), 25130-25138 (2000).
- Cadenas, E., Boveris, A., Ragan, C. I., Stoppani, A. O. M. Production of superoxide radicals and hydrogen peroxide by NADH-ubiquinone reductase and ubiquinol-cytochrome C reductase from beef-heart mitochondria. Archives of Biochemistry and Biophysics. 180 (2), 248-257 (1977).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochemical Journal. 417 (1), 1-13 (2009).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
- Spinelli, J. B., et al. Fumarate is a terminal electron acceptor in the mammalian electron transport chain. Science. 374 (6572), 1227-1237 (2021).
- Kumar, R., et al. A redox cycle with complex II prioritizes sulfide quinone oxidoreductase-dependent H(2)S oxidation. Journal of Biological Chemistry. 298 (1), 101435 (2022).
- Warburg, O., Geissler, A. W., Lorenz, S. On growth of cancer cells in media in which glucose is replaced by galactose. Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physiologische Chemie. 348 (12), 1686-1687 (1967).
- Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants. Toxicological Sciences. 97 (2), 539-547 (2007).
- Attardi, G., King, M. P. Human cells lacking mtDNA: Repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
- Bodnar, A. G., Cooper, M., Leonard, J. V., Schapira, A. H. Respiratory-deficient human fibroblasts exhibiting defective mitochondrial DNA replication. Biochemical Journal. 305, 817-822 (1995).
- Gregoire, M., Morais, R., Quilliam, M. A., Gravel, D. On auxotrophy for pyrimidines of respiration-deficient chick embryo cells. European Journal of Biochemistry. 142 (1), 49-55 (1984).
- Mackay, G. M., Zheng, L., vanden Broek, N. J., Gottlieb, E. Analysis of cell metabolism using LC-MS and isotope tracers. Methods in Enzymology. 561, 171-196 (2015).
- Heinrich, P., et al. Correcting for natural isotope abundance and tracer impurity in MS-, MS/MS- and high-resolution-multiple-tracer-data from stable isotope labeling experiments with IsoCorrectoR. Scientific Reports. 8 (1), 17910 (2018).
- Lee, P., Chandel, N. S., Simon, M. C. Cellular adaptation to hypoxia through hypoxia inducible factors and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (5), 268-283 (2020).
- Bisbach, C. M., et al. Succinate can shuttle reducing power from the hypoxic retina to the O(2)-rich pigment epithelium. Cell Reports. 31 (2), 107606 (2020).
- Angebault, C., et al. Idebenone increases mitochondrial complex I activity in fibroblasts from LHON patients while producing contradictory effects on respiration. BMC Research Notes. 4, 557 (2011).
- Liao, P. C., Bergamini, C., Fato, R., Pon, L. A., Pallotti, F. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Methods in Cell Biology. 155, 3-31 (2020).
- Iwai, T., et al. Sodium accumulation during ischemia induces mitochondrial damage in perfused rat hearts. Cardiovascular Research. 55 (1), 141-149 (2002).
- Murphy, E., Eisner, D. A. Regulation of intracellular and mitochondrial sodium in health and disease. Circulation Research. 104 (3), 292-303 (2009).
- Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. Isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue. Journal of Visualized Experiments. (97), e52076 (2015).
- Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nature Metabolism. 4 (6), 651-662 (2022).
- Xiao, Y., Meierhofer, D. Are hydroethidine-based probes reliable for reactive oxygen species detection. Antioxidants and Redox Signaling. 31 (4), 359-367 (2019).
- DeBerardinis, R. J., et al. Beyond aerobic glycolysis: Transformed cells can engage in glutamine metabolism that exceeds the requirement for protein and nucleotide synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19345-19350 (2007).
- Keeley, T. P., Mann, G. E. Defining physiological normoxia for improved translation of cell physiology to animal models and humans. Physiological Reviews. 99 (1), 161-234 (2019).
- Ast, T., Mootha, V. K. Oxygen and mammalian cell culture: Are we repeating the experiment of Dr. Ox. Nature Metabolism. 1 (9), 858-860 (2019).
- Gu, C., Jun, J. C. Does hypoxia decrease the metabolic rate. Frontiers in Endocrinology. 9, 668 (2018).
- Voorde, J., et al. Improving the metabolic fidelity of cancer models with a physiological cell culture medium. Scientific Advances. 5 (1), 7314 (2019).
- Cantor, J. R., et al. Physiologic medium rewires cellular metabolism and reveals uric acid as an endogenous inhibitor of UMP synthase. Cell. 169 (2), 258-272 (2017).
- MacPherson, S., et al. Clinically relevant T cell expansion media activate distinct metabolic programs uncoupled from cellular function. Molecular Therapy. Methods and Clinical Development. 24, 380-393 (2022).
- Torres-Quesada, O., Doerrier, C., Strich, S., Gnaiger, E., Stefan, E. Physiological cell culture media tune mitochondrial bioenergetics and drug sensitivity in cancer cell models. Cancers. 14 (16), 3917 (2022).
- Chan, S. W., Chen, J. Z. Measuring mtDNA damage using a supercoiling-sensitive qPCR approach. Methods in Molecular Biology. 554, 183-197 (2009).
- Doherty, E., Perl, A. Measurement of mitochondrial mass by flow cytometry during oxidative stress. Reactive Oxygen Species. 4 (10), 275-283 (2017).
- Birsoy, K., et al. An essential role of the mitochondrial electron transport chain in cell proliferation is to enable aspartate synthesis. Cell. 162 (3), 540-551 (2015).
- Beigneux, A. P., et al.
- Gameiro, P. A., et al. In vivo HIF-mediated reductive carboxylation is regulated by citrate levels and sensitizes VHL-deficient cells to glutamine deprivation. Cell Metabolism. 17 (3), 372-385 (2013).
- Fendt, S. M., et al. Reductive glutamine metabolism is a function of the alpha-ketoglutarate to citrate ratio in cells. Nature Communications. 4, 2236 (2013).
- Lee, C. P. Biochemical studies of isolated mitochondria from normal and diseased tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 1271 (1), 21-28 (1995).
