Summary
Här presenterar vi en sammanställning av analyser för att direkt mäta mitokondriell funktion i däggdjursceller oberoende av deras förmåga att konsumera molekylärt syre.
Abstract
Flödet av elektroner i mitokondriell elektrontransportkedja (ETC) stöder mångfacetterade biosyntetiska, bioenergetiska och signaleringsfunktioner i däggdjursceller. Eftersom syre (O2) är den mest allestädes närvarande terminala elektronacceptorn för däggdjurets ETC, användsO2-förbrukningshastigheten ofta som en proxy för mitokondriell funktion. Ny forskning visar dock att denna parameter inte alltid indikerar mitokondriell funktion, eftersom fumarat kan användas som en alternativ elektronacceptor för att upprätthålla mitokondriella funktioner vid hypoxi. Denna artikel sammanställer en serie protokoll som gör det möjligt för forskare att mäta mitokondriell funktion oberoende avO2-konsumtionshastigheten. Dessa analyser är särskilt användbara när man studerar mitokondriell funktion i hypoxiska miljöer. Specifikt beskriver vi metoder för att mäta mitokondriell ATP-produktion, de novo pyrimidinbiosyntes, NADH-oxidation genom komplex I och superoxidproduktion. I kombination med klassiska respirometriexperiment kommer dessa ortogonala och ekonomiska analyser att ge forskare en mer omfattande bedömning av mitokondriell funktion i deras intressesystem.
Introduction
Mitokondriell funktion är ett kritiskt mått på cellulär hälsa, eftersom den upprätthåller viktiga biosyntetiska, bioenergetiska och signalfunktioner i däggdjursceller1. De allra flesta mitokondriella funktioner kräver elektronflöde genom elektrontransportkedjan (ETC), och störningar i elektronflödet i ETC orsakar allvarlig mitokondriell sjukdom2. ETC består av en serie reduktions- och oxidationsreaktioner (redox) som är inbäddade i det inre mitokondriella membranet, och dessa elektronöverföringsreaktioner frigör fri energi som kan utnyttjas för att stödja ATP-syntes, fysiologiska processer såsom termogenes, biosyntetiska vägar såsom de novo pyrimidinbiosyntes och balansen i redoxstatusen för co-faktorer såsom NADH. ETC-komplex I och III producerar reaktiva syreradikaler (ROS)3,4,5, som i sin tur reglerar signaleringsnyckelvägar som HIF, PI3K, NRF2, NFκB och MAPK 6. Följaktligen används metriker av elektronflödet i ETC klassiskt som en proxy för mitokondriell funktion i däggdjursceller.
Respirometriexperiment används ofta för att mäta mitokondriell funktion i däggdjursceller. EftersomO2 är den mest allestädes närvarande terminala elektronacceptorn för däggdjurets ETC, används dess reduktion som en proxy för mitokondriell funktion. Nya bevis visar emellertid att mitokondrier hos däggdjur kan använda fumarat som elektronacceptor för att upprätthålla mitokondriella funktioner som är beroende av ETC, inklusive de novo pyrimidinbiosyntes 7, NADH-oxidation7 och avgiftning av vätesulfid8. I vissa sammanhang, särskilt i hypoxiska miljöer, ger mätningar avO2-konsumtionshastigheten (OCR) således inte en exakt eller exakt indikation på mitokondriell funktion.
Här beskriver vi en serie analyser som kan användas för att mäta mitokondriell funktion oberoende av OCR. Vi tillhandahåller analyser för att direkt mäta komplex I-medierad NADH-oxidation, dihydroorotatdehydrogenasmedierad de novo-pyrimidinbiosyntes, komplex V-beroende ATP-syntes, nettoriktningen för succinatdehydrogenaskomplexet (SDH) och mitokondriell härledd ROS. Dessa analyser är avsedda att utföras på odlade däggdjursceller, även om många kan anpassas för att studera mitokondriella funktioner in vivo. I synnerhet är analyserna som beskrivs i detta protokoll mer direkta mätningar av mitokondriella funktioner än OCR. Dessutom möjliggör de mätning av mitokondriell funktion vid hypoxi, ett sammanhang där OCR inte är en vägledande mätning. Sammantaget kommer dessa analyser, i kombination med klassiska respirometriexperiment, att ge forskare en mer omfattande bedömning av mitokondriell funktion i däggdjursceller.
Protocol
1. Proliferationsanalyser för att mäta aktiviteten hos komplexa I, dihydroorotatdehydrogenas (DHODH) och komplexa V-aktiviteter
- Såddceller för spridningsanalyser
OBS: Detta protokoll använder den humana osteosarkomcellinjen 143B köpt kommersiellt från ATCC. Denna cellinje användes enligt riktlinjerna i vårt godkända protokoll från Institutional Biosafety Committee (IBC).- Ta bort plattorna från vävnadsodlingsinkubatorn. Aspirera mediet från plattorna och tvätta med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att ta bort eventuellt kvarvarande medium. Aspirera PBS och täck skålen med 0,05% -0,25% trypsin för att lyfta cellerna från botten av plattan.
- Vänta 3-5 minuter tills trypsinet släpper cellerna från plattan och släck sedan trypsinet med 10 ml av önskat tillväxtmedium innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS).
- Samla cellerna i ett koniskt rör och centrifugera vid 1 000 × g i 5 minuter för att pellet cellerna.
- Aspirera mediet från röret utan att störa pelleten. Återsuspendera pelleten med komplett medium.
- Räkna cellerna och kvantifiera volymen som behövs för att frö mellan 10 000 och 25 000 celler i en 6-brunnsplatta.
OBS: Varje cellinje måste optimeras för antalet celler som ska seedas. Den ideala sammanflödet som uppnås är ~ 10% i början av experimentet och ~ 80% i slutet av experimentet. - Pipettera cellerna till en 6-brunnsplatta och tillsätt 2 ml komplett medium till brunnarna. Låt sitta i 24 timmar innan du byter till experimentmedieförhållandena.
OBS: Utsäde minst tre replikat per tillstånd och tillräckligt många brunnar för att testa det obehandlade kontrollförhållandet, inhibitorbehandlade kontrollvillkor, obehandlade experimentella tillstånd och inhibitorbehandlade experimentella tillstånd.
- Medelstor förändring för att bedöma komplex V-aktivitet genom spridning
OBS: Celler som prolifererar i ett medium med galaktos är beroende av komplex V-aktivitet för ATP-syntes 9,10. Till skillnad från glukos, som ger netto två ATP från glykolys, ger galaktos ingen, vilket tvingar cellerna att vara beroende av komplex V för ATP-syntes (figur 1). Den komplexa V-hämmaren oligomycin används som en kontroll.- Gör 10 mM glukosinnehållande medium (se tabell 1).
- Gör 10 mM galaktosinnehållande medium (se tabell 1).
- Byt medium i varje brunn till antingen glukosinnehållande DMEM eller galaktosinnehållande DMEM. Tillsätt 5 μM oligomycin (den komplexa V-hämmaren) till de relevanta brunnarna och samma volym DMSO till de obehandlade brunnarna. Oligomycinstammen är 10 mM resuspenderad i DMSO. Sätt tillbaka plattan i vävnadsodlingsinkubatorn i 2 dagar.
- Medelstor förändring för att bedöma komplex I-aktivitet genom spridning
OBS: Celler som prolifererar i ett pyruvatfritt medium är mer beroende av komplex I-aktivitet11,12. Utan pyruvat kräver de odlade cellerna komplex I för att underlätta majoriteten av NADH-reoxidation tillbaka till NAD + (figur 2). Den komplexa I-hämmaren rotenon används som kontroll.- Gör pyruvatfritt DMEM-medium kompletterat med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin.
- Gör en 1 M pyruvatlösning (se tabell 1).
- Byt mediet i varje brunn till antingen pyruvatfritt medium eller pyruvatinnehållande medium. Tillsätt 2 μM rotenon (komplex I-hämmaren) till de behandlade brunnarna och samma volym DMSO till de obehandlade brunnarna. Rotenonstammen är 25 mM återsuspenderad i DMSO. Sätt tillbaka plattan i vävnadsodlingsinkubatorn i 2 dagar.
- Medelstor förändring för att bedöma DHODH-aktivitet genom spridning
OBS: Celler som prolifererar i ett uridinfritt medium kräver dihydroorotatdehydrogenas (DHODH) aktivitet11,12,13. I frånvaro av exogent uridin syntetiserar de odlade cellerna pyrimidiner genom de novo-vägen. DHODH-hämmaren brequinar används som kontroll.- Gör uridinfri DMEM kompletterad med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin.
- Gör en 10 mg/ml uridinstamlösning och bered sedan ett 100 μg/ml uridinmedium (se tabell 1).
- Byt medium i varje brunn till uridinfritt medium eller uridininnehållande medium. Tillsätt 5 μM brequinar (DHODH-hämmaren) till de behandlade brunnarna och samma volym DMSO till de obehandlade brunnarna. Brequinarbeståndet är 10 mM återsuspenderat i DMSO. Sätt tillbaka plattan i vävnadsodlingsinkubatorn i 2 dagar.
- Räkna cellerna för proliferationsanalyser
- För alla experiment, fyll på mediet var 2: e dag. Om mediet blir gult i färg, öka frekvensen av mediets förändringar. Låt cellerna proliferera i upp till 7 dagar och stoppa experimentet om någon av brunnarna börjar se övervuxen ut. Brunnar anses vara övervuxna när sammanflödet överstiger 80%.
- Aspirera mediet, tvätta med 1x PBS och täck botten av brunnen med 0,25% trypsin (500 μL för en 6-brunnskål).
- Vänta 5 minuter tills cellerna har lyft av skålen. Kontrollera detta under ett mikroskop.
- Släck trypsinet med 1 ml komplett DMEM innehållande 10% FBS.
- Pipettera upp och ner för att bryta isär cellklumparna.
- Förbered Coulter-räknarkoppar genom att fylla var och en med 10 ml isotonbuffert (en kopp per brunn). Räkna cellerna på en cellräknare och registrera data. Om avläsningen är celler per milliliter (celler / ml), multiplicera det registrerade värdet med 1,5 för att få det totala antalet celler per brunn.
OBS: Andra cellräkningsmetoder som en hemocytometer räcker om laboratoriet inte har en Coulter-räknare.
2. 13C 4-aspartat stabil isotopspårning och LC-MS-analys för att mäta DHODH-aktivitet
- 13C 4-aspartatstabil isotopspårning i vidhäftande celler
OBS: DHODH-aktivitet kan övervakas direkt genom att mäta införlivandet av 13 C 4-aspartat i 13C3-UMP. Brequinar används som en kontroll för DHODH-aktivitet (figur 3). De resulterande nivåerna av 13C3-UMP är ett mått på DHODH-aktivitet.- Frö mellan 250 000 och 500 000 celler i en 6-brunnsskål för att uppnå 75% sammanflöde nästa dag.
- Bered en stamlösning av 250 mM 13 C 4-aspartat och 10 mM 13C 4-aspartatmedium (se tabell 1).
- Byt medium i varje brunn till medium innehållande 10 mM 13C 4-aspartat. Inkubera under lämpligt antal timmar för att uppnå ett stabilt tillstånd för märkning av cellerna av intresse.
OBS: Steady state definieras som den tidsram inom vilken procentandelen märkta metaboliter platåer över tiden14. För 143B osteosarkomceller uppnår 13C 4-aspartat ett stabilt tillstånd med 8 timmar. Det är bästa praxis att bestämma denna tidsram före experimentet genom att göra ett tidsförloppsexperiment med den stabila isotopen av intresse.
- Metabolitisolering från de vidhäftande cellerna
- Innan du börjar, förbered en hink med torris och förbered 80% HPLC-grade MeOH i vatten av HPLC-kvalitet. Kyl denna buffert i en −80 °C frys över natten eller placera den direkt på torris.
- Ta ut en platta i taget från inkubatorn, aspirera mediet från brunnarna och tvätta 2x med 1x PBS. Ta bort alla kvarvarande PBS från brunnarna innan du går vidare till nästa steg.
OBS: Se till att luta plattan under aspirationen och pipetten mot skålens vägg för att förhindra störning av de vidhäftande cellerna. - Placera plattan på torris och tillsätt omedelbart 800 μL 80 % LCMS-klassad MeOH i 20 % LCMS-vatten till varje brunn.
- Inkubera plattan i minst 15 minuter i en frys på −80 °C för att underlätta celllys.
OBS: Vid denna tidpunkt kan nästa platta tas ut ur inkubatorn och steg 2.2.1-2.2.4 upprepas. Fortsätt tills alla plattor inkuberas i frysen −80 °C. - Ta ut en platta åt gången från frysen, skrapa varje brunn på torris med en celllyftare och överför lysatet till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Håll röret på torris tills nästa steg.
- Virvla alla rör i 10 minuter vid 4 °C och centrifugera sedan vid 4 °C i 10 minuter vid maximal hastighet (minst 17 000 × g).
- Överför supernatanten till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och torka i en vakuumkoncentrator på 4 °C utrustad med en kylfälla på −105 °C vid högvakuuminställning i cirka 6 timmar eller tills proverna har avdunstat. När lysatet har torkats, förvara metabolitpelletsen vid −80 °C tills de är redo att beredas för vätskekromatografi parat med masspektrometri (LCMS).
- Vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS) mätning av polära metaboliter
OBS: Varje kromatografiskt och masspektrometriarbetsflöde som möjliggör detektering av aspartat, intermediärerna i de novo pyrimidinbiosyntes och UMP räcker14.- Bered proverna för LCMS på is genom att tillsätta 100 μl vatten av HPLC-kvalitet till de torkade pelletsen och virveln i 10 minuter vid 4 °C.
- Centrifugera proverna vid 4 °C i 10 minuter med högsta hastighet (minst 17 000 × g) och flytta 25 μl till varje LC-MS-injektionsflaska.
- Injicera 2 μl lysat i LC-MS-systemet. En vanlig metod ges nedan:
- Förbered mobil fas A bestående av 20 mM ammoniumkarbonat (LC-MS-kvalitet) och 0,1% ammoniumhydroxid (LC-MS-kvalitet) upplöst i vatten av LC-MS-kvalitet.
- Välj 100% acetonitril (LC-MS Grade) som mobil fas B.
- För kromatografi, välj en 5 μm, 150 mm x 2,1 mm analyskolonn utrustad med en 2,1 mm x 20 mm skyddskolonn för hydrofila föreningar (se materialtabellen). Ställ in kolonnugnen på 25 °C.
- Använd följande vätskekromatografiinställningar: en konstant flödeshastighet på 0,15 ml / min; en linjär gradient från 80 % till 20 % mobil fas B i 20 minuter, följt av en linjär gradient från 20 % till 80 % mobil fas B i 0,5 minuter, följt av ett uppehåll på 80 % mobil fas B i 7,5 minuter.
- Välj följande masspektrometerinställningar: en fullständig skanning mellan m / z 70 Da och 1,000 Da; en upplösning på 70 000; Ett AGC-mål på 1 × 106. och en maximal injektionstid på 20 ms. Använd källan i polaritetsväxlingsläge. Ställ in sprayspänningen på 3,0 kV, den uppvärmda kapillären på 275 °C, HESI-sonden på 350 °C, mantelgasflödet på 40 enheter, hjälpgasflödet på 15 enheter och svepgasflödet på 1 enhet.
- Utför dataanalysen med valfri programvara som har gränssnitt mot LCMS-arbetsflödet.
OBS: Programvaran som används med ovanstående arbetsflöde är XCalibur (Thermo) och TraceFinder (Thermo). Viktiga överväganden för dataanalys beskrivs nedan:- Förväntade kvarhållningstider: Bestäm retentionstiden för varje metabolit genom att köra standarderna för varje metabolit av intresse med hjälp av kromatografisk metod före experimentet.
OBS: Retentionstiderna för UMP och dess isotopologer, inklusive 13C3-UMP, är exakt desamma. - Förväntat M/Z för metaboliter: Om en metabolit joniseras i negativt jonläge (t.ex. UMP), beräkna den förväntade exakta massan med hjälp av molekylformeln för UMP minus en proton [C9H14N2O9P]. För metaboliter som joniseras i positivt jonläge, beräkna den exakta massan med hjälp av molekylformeln plus en proton.
- Massa noggrannhet: Vid användning av en orbitrap-masspektrometer förväntas metaboliten av intresse och dess isotopologer ha en massnoggrannhet ±5 mmu. Använd programvara för att beräkna detta, med hänsyn till den förväntade M / Z och den faktiska detekterade M / Z.
- Korrigering av naturligt överflöd: Alla spårningsdata förväntas genomgå naturlig överflödskorrigering för att ta hänsyn till ~ 1% 13C och ~ 0,5% 15 N-isotoper i natur 15.
- Förväntade kvarhållningstider: Bestäm retentionstiden för varje metabolit genom att köra standarderna för varje metabolit av intresse med hjälp av kromatografisk metod före experimentet.
3. 13C 5-glutaminstabil isotopspårning för att mäta SDH-aktivitet
- 13C 5-glutaminstabil isotopspårning i vidhäftande celler
OBS: SDH-aktivitet kan övervakas direkt genom att mäta omvandlingen av vissa isotopologer av fumarat och succinat vid 13 C 5-glutamin som spårar 7,16,17. Komplexet III-hämmare antimycin används som en kontroll för att ändra nettoriktningen hos SDH-komplexet (figur 4).- Frö mellan 250 000 och 500 000 celler i en 6-brunnsskål för att uppnå 75% sammanflöde nästa dag.
- Bered ett lager på 50 mM 13C 5-glutamin (se tabell 1).
- Bered ett spårningsmedium innehållande 2 mM 13C 5-glutamin (se tabell 1).
- Byt medium i varje brunn till medium innehållande 2 mM 13C 5-glutamin. Inkubera under lämpligt antal timmar för att uppnå ett stabilt tillstånd för märkning av cellerna av intresse (se anmärkningen i steg 2.1.3).
- Isolera metaboliterna enligt protokollet i steg 2.2.
- Analysera exemplen på LC-MS enligt arbetsflödet som beskrivs i steg 2.3.
- Analysera SDH-aktiviteten baserat på etiketteringsmönster
OBS: Succinatoxidationsaktiviteten hos SDH-komplexet kan övervakas genom att bedöma förhållandet mellan 13 C 4-fumarat och 13 C4-succinat vid 13C5-glutaminspårning. Fumaratreduktionsaktiviteten hos SDH-komplexet kan övervakas genom att bedöma förhållandet mellan 13 C 3-succinat och 13 C3-fumarat vid 13C 5-glutaminspårning.- Beräkna procentuell märkning av 13 C 3-fumarat, 13 C 4-fumarat, 13 C3-succinat och 13 C4-succinat. Till exempel, för att bestämma procentandelen 13 C3-fumarat, summera alla integrerade toppområden för fumaratisotopologerna (omärkt fumarat, 13 C 1-fumarat, 13 C2-fumarat, 13 C 3-fumarat och 13 C4-fumarat) och dela toppområdet för 13C 3-fumarat med det totala isotopologområdet. Multiplicera med 100.
- För att beräkna succinatoxidationen, dela procentandelen 13 C 4-fumarat med procentandelen 13C4-succinat.
- För att beräkna fumaratreduktionen, dividera procentandelen 13 C 3-succinat med procentandelen 13C3-fumarat.
4. Direkt komplex I-aktivitetsanalys
OBS: DCPIP är en artificiell elektronacceptor; Den ändras till sin reducerade form när den accepterar elektroner från ubiqinol. I denna analys reduceras ubiqinon till ubiqinol via den komplexa I-medierade oxidationen av NADH till NAD+. Således är mätning av omsättningen av oxiderad DCPIP i denna cellfria analys en proxy för komplex I-aktivitet 7,18.
- Rening och kvantifiering av mitokondrier från celler
OBS: Alla mitokondriella reningsprotokoll kan användas för denna analys19.- Expandera cellerna tills 25-100 miljoner celler erhålls. Aspirera mediet från diskarna, tvätta med 1x PBS, aspirera PBS och tryspinisera cellerna med 0,25% trypsin. Släck trypsinet med odlingsmedium och pellet cellerna vid 1 000 × g i 5 minuter.
- Tvätta cellpelletsen 2x i 5 ml 1x PBS och upprepa centrifugeringen vid 1 000 × g i 5 minuter för att pellet cellerna. Förvara de tvättade pelletsen i en frys på −20 °C tills mitokondriell rening.
OBS: Frys-tina inte cellpelletsen mer än en gång. - Förbered isoleringsbufferten för mitokondrier (se tabell 1).
OBS: Natriuminnehållande reagens såsom NaOH bör inte användas för att förbereda mitokondriernas isoleringsbuffertar, eftersom natrium skadar mitokondriell membranpotential20 och stör mitokondriell kalciumhomeostas21. - Resuspendera cellpellets till 10 miljoner celler per 1 ml mitokondrier isoleringsbuffert. Till exempel, resuspendera 100 miljoner pelleterade celler i 10 ml mitokondrier isoleringsbuffert.
OBS: Se till att störa cellklumparna utan att införa bubblor i bufferten. - Flytta 2 ml cellsuspension till en förkyld glashomogenisator med en arbetsvolym på 3-8 ml som är kompatibel med en Potter-Elvehjem PTFE-stöt. Homogenisera cellerna med 10-20 slag, övervaka cellerna under ett mikroskop för att bekräfta celllys under hela homogeniseringsprocessen. Öka antalet slag om det behövs för att säkerställa effektiv celllys.
OBS: Om homogenisering av cellerna med ovanstående metod inte är effektiv för lysering av cellerna, byt till en sprutlysmetod22. - Överför 2 ml av celllysatet till ett mikrocentrifugrör på is och upprepa ovanstående steg tills hela cellsuspensionen är homogeniserad.
- Pelletera kärnorna och cellskräpet vid 650 × g i 10 minuter i en 4 °C centrifug.
- Flytta supernatanten till ett nytt 2,0 ml rör och upprepa ovanstående centrifugering vid 650 × g i 10 minuter vid 4 °C.
- Flytta supernatanten till ett nytt 2,0 ml rör och pellet de råa mitokondrierna vid 7 000 × g i 10 minuter i en 4 °C centrifug.
- Kassera supernatanten och suspendera pelleten igen i 1 ml mitokondriernas isoleringsbuffert. Flytta 50 μL till ett nytt rör för proteinkvantifiering. Upprepa centrifugeringssteget ovan på provets två alikvoter (50 μL-provet och återstående ~950 μl).
- Kassera supernatanten och förvara pelletsen i en frys på −80 °C tills den är klar att användas.
- Tillsätt 200 μl Ripa-buffert till pelletsen från 50 μl-alikvoten för att extrahera proteinet, virvel i 10 minuter och centrifugera vid 21 000 × g för att isolera proteinet. Kvantifiera mängden protein i alikvoten på 50 μl och använd detta tal för att kvantifiera det återstående proteinet i provet på 950 μl. Om proteinkvantifieringen för exempelvis 50 μL alikvoten är 1 μg/μl är det totala proteinet i den återstående mitokondriella pelleten 950 μg (1 μg/μL × 950 μL).
- Utföra den komplexa I-aktivitetsanalysen
OBS: 143B osteosarkomcellinjen användes för denna analys, men protokollet kan anpassas för alla odlade celler.- Resuspendera renade mitokondrier i mitokondriernas resuspensionsbuffert (se tabell 1) till en slutlig koncentration på 5 mg protein/ml.
- Utför fem frys-/upptiningscykler i en frys på −20 °C för att permeabilisera mitokondrierna.
- Gör den komplexa I-aktivitetsanalysen buffert (se tabell 1).
- Blanda 50 ug av 5 mg/ml mitokondrier med 90 μl komplex I-aktivitetsbuffert. Bered fem obehandlade replikat och fem rotenonbehandlade (5 μM) replikat för kontroll av komplex I-aktivitet.
- Avläs baslinjens absorbans vid 600 nm i en plattläsare inställd på 37 °C.
- Starta reaktionen genom att tillsätta NADH till en slutlig koncentration på 2 mM och spåra absorbansen (600 nm) över 1 timme, mät minst var 2: e minut hela tiden. Minskningen av absorbansen indikerar en minskning av DCPIP via komplex I-aktivitet.
OBS: NADH bör läggas till med en flerkanalig pipett för att säkerställa att alla prover initieras samtidigt.
5. LC-MS-baserad analys för att mäta superoxidnivåerna
OBS: Fluorescensegenskaperna hos MitoSox Red kan förändras oberoende av dess reaktion med superoxid23. Denna LC-MS-baserade analys mäter direkt produkten från superoxid som reagerar med MitoSox Red. Följande analys är något modifierad från Xiao et al.24. 2-hydroximitoetidium (2-OH MitoE2+) är produkten av superoxidreaktionen (figur 5). Caki1-cellinjen användes för denna analys, men protokollet kan anpassas för alla odlade celler.
- Behandling av vidhäftande celler med MitoSox Red
- Frö mellan 250 000 och 500 000 celler i en 6-brunnsskål för att uppnå 75% sammanflöde nästa dag. Var noga med att fröa en uppsättning plattor för LC-MS-analysen och en duplicerad uppsättning plattor för normalisering av cellantal.
- Förbered komplett DMEM innehållande 10% värmeinaktiverat FBS och 1% penicillin-streptomycin i Dulbeccos modifierade Eagle-medium.
- Uppdatera mediet i alla brunnar för alla förhållanden med 2 ml komplett DMEM. Se till att lägga till några droger eller behandlingar av intresse vid denna tidpunkt.
- Inkubera cellerna i en vävnadsodlingsinkubator i 1 timme.
- Förbered positiva och negativa kontroller. Bered ett 50 mM lager tert-butylhydroperoxid utspätt i PBS och ett 250 mM lager N-acetylcystein (NAC) utspätt i DMSO (se tabell 1).
Tertbutylhydroperoxid (tBuOOH) är en potent reaktiv syreart som kommer att fungera som en positiv kontroll och ökar mängden 2-OH MitoE2+. NAC är en potent antioxidant som kommer att fungera som en negativ kontroll och neutralisera superoxidproduktionen orsakad av tBuOOH. - Tillsätt 1 μl tBuOOH till de positiva kontrollbrunnarna och 1 μl tBuOOH + 100 μL NAC till de negativa kontrollbrunnarna.
OBS: Att använda en P2-pipett (0,1-2 μL-intervall) är det optimala sättet att överföra 1 μL. - Inkubera i 1 h i en vävnadsodlingsinkubator.
- Bered 1 mM MitoSox Red stam (se tabell 1) och tillsätt 2 μl 1 mM MitoSox Red till varje brunn för att uppnå en slutlig koncentration på 1 μM. Inkubera i 30 minuter i en vävnadsodlingsinkubator.
- Under denna slutliga inkubation, räkna en av de dubbla plattorna för att få cellräkningarna för att normalisera de slutliga LC-MS-data.
- Isolering av den oxiderade Mitosox Red-produkten från de vidhäftande cellerna
- Få en hink med torris och placera sval isopropanol av HPLC-kvalitet på torrisen innan isoleringen påbörjas.
- Ta ut en platta i taget, aspirera mediet från brunnarna och tvätta 2x med 1 ml 1x PBS. Aspirera alla kvarvarande PBS från brunnarna innan du går vidare till nästa steg.
OBS: Se till att luta plattan under aspirationen och pipetten mot skålens vägg för att förhindra störningar av de vidhäftande cellerna. - Placera plattan på torris och tillsätt 800 μL isopropanol av HPLC-kvalitet till varje brunn.
- Inkubera plattan i minst 15 minuter i en frys på −80 °C för att underlätta celllys.
OBS: Vid denna tidpunkt kan nästa platta tas ut ur inkubatorn och steg 5.2.1-5.2.4 upprepas. Fortsätt tills alla plattor inkuberas i frysen −80 °C. - Ta ut en platta i taget från frysen, skrapa varje brunn på torris med en celllyftare och överför lysatet till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Håll röret på torris tills nästa steg.
- Virvla alla rör i 10 minuter vid 4 °C och centrifugera sedan vid 4 °C i 10 minuter vid maximal hastighet (minst 17 000 × g).
- Överför supernatanten till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och torka ner i en vakuumkoncentrator. När lysatet har torkat, förvara metabolitpelletsen vid −80 °C tills de är klara för LC-MS.
- LC-MS-mätning av MitoSox Red och 2-hydroxy-mitoethidium (2-OH MitoE2+)
- Bered proverna för LCMS på is genom att tillsätta 100 μL av en 3:3:1 blandning av HPLC-grade MeOH:chloroform:water. Virvel i 10 min vid 4 °C.
- Flytta 25 μl till varje LC-MS injektionsflaska. Förvara det återstående provet i frysen −80 °C.
- Bered följande vätskekromatografibuffertar: i) buffert A: vatten av HPLC-kvalitet med 0,1% myrsyra; ii) buffert B: Acetonitril av HPLC-kvalitet med 0,1 % myrsyra.
- Öppna appen Thermo XCalibur Instrument Setup för att börja utveckla metoden.
- Leta efter två rutor på vänster sidofält i det här fönstret - den första rutan tillåter kromatografimetodutveckling, och den andra rutan tillåter utveckling av masspektrometrimetod.
- Utveckling av vätskekromatografimetod:
- Ställ in en flödeshastighet på 0,25 ml / min och starta metoden vid 20% B, öka till 95% B under 12 min. Under nästa minut, släpp buffert B tillbaka till 20% B och behåll den nivån under de kommande 2 minuterna.
OBS: De sista 2 minuterna av flödet vid 20% B är avgörande för att kolonntrycket ska sjunka tillbaka till utgångstrycket och balansera kolonnen med lämpliga buffertförhållanden. Om du inte inkluderar det här jämviktssteget ändras kvarhållningstiderna för alla exempel som körs senare.
- Ställ in en flödeshastighet på 0,25 ml / min och starta metoden vid 20% B, öka till 95% B under 12 min. Under nästa minut, släpp buffert B tillbaka till 20% B och behåll den nivån under de kommande 2 minuterna.
- Skapa en Tune-fil med följande parametrar:
- Öppna appen Tune och skapa en ny tune-fil.
- Använd även eventuella överlappande inställningar från modulen Metodinställning (se steg 5.3.9.3) på den här inställningsfilen, inklusive skanningsintervall, upplösning, polaritet, AGC-mål och maximal IT.
- Ställ in mantelgasen på 30, aux-gasen på 3 och svepgasen på 3 också. Ställ in sprayspänningen på 3 kV, kapillärtemperaturen på 300 och S-objektivets RF-nivå på 60.
- Metodutveckling för masspektrometri:
- Dra och släpp Full MS från den nedre vänstra listan över potentiella skanningar till mitten av fönstret. Se till att klicka på Full MS-rutan efter droppen för att justera inställningarna. Den totala MS-metodens varaktighet är 13 min.
OBS: LC-metoden är längre än MS-metoden eftersom de sista 2 minuterna är för kolonnrekonditionering och inte metabolitkvantifiering. - På höger sida av modulen, under Egenskaper för metoden, kontrollerar du att metodens varaktighet och Körtid är inställda på 13.00 min.
- Kör den här fullständiga genomsökningen i positivt läge med en upplösning på 70 000 och ett AGC-mål på 1 × 106. Ställ in Maximum IT på 100 ms och Scan range från 300 m/z till 700 m/z.
- Under Justera filer längst upp i modulen ser du till att melodifilen som just skapades är länkad till den här metoden.
- Dra och släpp Full MS från den nedre vänstra listan över potentiella skanningar till mitten av fönstret. Se till att klicka på Full MS-rutan efter droppen för att justera inställningarna. Den totala MS-metodens varaktighet är 13 min.
- Kör metoden för MitoSox Red-detektion med 2 μL provinjektioner.
Representative Results
Aktiviteterna hos DHODH, komplex I och komplex V kan alla bedömas med hjälp av spridningsanalyser. Vid berövande av uridin från odlingsmediet blir cellerna mer beroende av de novo-vägen för pyrimidinbiosyntes. Således, när celler utmanades att proliferera i ett uridinfritt medium, var de mer känsliga för hämning av DHODH-aktivitet av brequinar än celler odlade i ett medium innehållande uridin (figur 6A). På samma sätt gör berövandet av pyruvat från odlingsmediet cellerna mer beroende av komplex I-aktivitet för proliferation. Således, när celler utmanades att föröka sig i ett pyruvatfritt medium, var de mer känsliga för hämning av komplex I-aktivitet av rotenon än celler odlade i ett pyruvatinnehållande medium (figur 6B). Komplex V-aktivitet kan bedömas genom att utmana celler att föröka sig i ett medium som innehåller galaktos istället för glukos. Eftersom galaktos ger netto noll ATP i glykolys är celler som växer i detta bränsle mer beroende av mitokondriell ATP-syntes via komplex V-aktivitet. Således var celler som prolifererar i ett galaktosinnehållande medium känsligare för komplex V-hämning av oligomycin än celler som prolifererar i ett glukosinnehållande medium (figur 6C).
SDH-aktivitet kan mätas med 13C 5-glutaminspårning och genom att övervaka dess införlivande i fumarat- och succinatisotopologer. Under vehikelbehandlade förhållanden gynnade SDH-komplexet den framåtriktade aktiviteten, och införlivandet av 13 C4-succinat i 13C4-fumarat var högre än införlivandet av 13 C3-fumarat i 13 C3-succinat(figur 7). Under antimycinbehandlade förhållanden gynnade SDH-komplexet den omvända aktiviteten, och införlivandet av 13 C3-fumarat i 13 C3-succinat var större än införlivandet av 13 C4-succinat i 13 C4-fumarat (figur 7).
Superoxidproduktionen inuti mitokondrierna kan mätas med hjälp av den fluorescerande reportern MitoSox, som genererar 2-hydroxi-mitoetidium vid reaktion med superoxid. I denna studie hade celler behandlade med MitoSox i närvaro av tertbutylväteperoxid högre nivåer av 2-hydroxi-mitoetidium på ett sätt som undertrycktes genom tillsats av NAC, en antioxidant som släcker cellulär ROS (figur 8).
Figur 1: Mekanistisk grund för den komplexa V-spridningsanalysen. Oxidation av glukos och galaktos via glykolys. Glukos ger netto två ATP från glykolys, medan galaktos ger netto noll ATP eftersom UTP-syntes krävs för UDP-galaktos. Således är celler odlade i galaktos mer beroende av mitokondriell ATP-syntes på grund av brist på ATP producerad från glykolys. Förkortningar: GALK = galactokinase; GALT = galaktos-1-fosfaturidylyltransferas; PGM1 = fosfoglukomutas 1; GPI = glukos-6-fosfatisomeras, UGP = UDP-glukospyrofosforylas; GALE = UDP-galaktos-4-epimeras; NDK = nukleotiddifosfatkinas; UMPK = uridinmonofosfatkinas; HK = hexokinas; PFK = fosfofruktokinas; ALDO = aldolas; TPI = triosfosfatisomeras; GAPDH = glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas; PGK = fosfoglyceratkinas; PGM = fosfoglukomutas; ENO = enolas; PK = pyruvatkinas. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Mekanistisk grund för den komplexa I-spridningsanalysen. Schematisk bild av de metaboliska vägar som förändras vid hämning av komplex I-aktivitet. I högpyruvatmedier kringgås komplex I-hämning via LDH-medierad NADH-oxidation. I lågpyruvatmedier är denna anpassning mindre genomförbar, vilket gör cellerna mer beroende av komplex I-aktivitet för att reoxidera NADH. Förkortningar: LDH = laktatdehydrogenas; TCA-cykel = trikarboxylsyracykel. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Schematisk bild av DHODH-reaktionen vid 13C 4-aspartatspårning. Brequinar hämmar dihydroorotatoxidation till orotat, vilket förhindrar nedströms syntes av UMP. 13C 4-aspartat införlivas i 13C3-UMP via DHODH aktivitet. Förkortningar: OMM = yttre mitokondriellt membran; IMM = inre mitokondriellt membran; DHODH = dihydroorotatdehydrogenas. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Mätning av komplex II-aktivitet framåt och bakåt via 13C 5-glutaminspårning. För att mäta framåtriktad komplex II-aktivitet (vänster) övervakas införlivandet av 13 C 5-glutamin i 13 C 4-succinat och 13C 4-fumarat. För att mäta omvänd komplex II-aktivitet (höger) övervakas införlivandet av 13C5-glutamin i 13 C3-succinat och 13C3-fumarat. Förkortningar: SDH = succinatdehydrogenas; CytC = cytokrom C. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: MitoSox röd reaktion med superoxid. Reaktionen av MitoSox med mitokondriella superoxider för att bilda 2-OH-MitoE2+. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Proliferationsbaserade analyser för att mäta mitokondriell funktion (A) Proliferation av 143B osteosarkomceller behandlade med 5 uM brequinar, en DHODH-hämmare, i medium med ±100 ug / ml uridin. Data är medelvärde ± SEM; N = 3 per villkor. (B) Proliferation av 143B osteosarkomceller behandlade med 2 uM rotenon, en komplex I-hämmare, i medium med ±5 mM pyruvat. Data är medelvärde ± SEM; N = 3 per villkor. c) Spridning av 143B-osteosarkomceller behandlade med 5 uM oligomycin, en komplex V-hämmare, i medium med antingen 10 mM glukos eller 10 mM galaktos som enda centrala kolkälla. Data är medelvärde ± SEM; N = 3 per villkor. * indikerar p < 0,05 med ett enkelriktat ANOVA-test i Graphpad Prism. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: 13C 5-glutaminspårning för att mäta komplex II-aktivitet. Succinatoxidation och fumaratreduktion (SDH omvänd) i DMSO och 500 nM antimycin A-behandlade Caki1- och DLD1-celler. Data representerar medelvärdet ± SEM; N = 3 per villkor. indikerar p < 0,05 med ett oparat t-test i GraphPad Prism. Förkortningar: SDH = succinatoxidation; SDH omvänd = fumaratreduktion. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: LCMS-baserad MitoSox-analys för detektering av superoxid. Extraherat jonkromatogram av 2-OH-Mito E2+ isolerat från Caki1-celler behandlade med MitoSox i 30 minuter i närvaro av tBuOOH ± NAC. Förkortningar: LCMS = vätskekromatografi-masspektrometri; NAC = N-acetylcystein. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Sammansättning av reagens, buffertar och medier som används i detta protokoll. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Discussion
Eftersom ny forskning visar att mitokondrier hos däggdjur kan fungera utan att konsumera molekylärt syre är det av yttersta vikt för forskare att använda ortogonala analyser, utöver OCR-mätningar, för att exakt kvantifiera mitokondriell funktion. Här sammanställde vi en serie analyser som kan användas för att direkt bedöma aktiviteterna hos komplexa I, komplex II, komplex V och DHODH genom att mäta mitokondriell NAD + / NADH-balans, användningen av adaptiva terminala elektronacceptorer, produktion av ATP, de novo pyrimidinbiosyntes och mitokondriell härledd ROS. I synnerhet mäter dessa analyser mer direkt mitokondriell funktion än OCR-mätningar. Dessutom ger dessa analyser forskare lätthanterliga sätt att kvantifiera mitokondriell funktion under hypoxi, för vilka OCR-mätningar i stort sett är irrelevanta på grund av att fumarat används som den gynnade terminala elektronacceptorn. Slutligen är de spridningsbaserade metoder som beskrivs här mer kostnadseffektiva än klassiska respirometriexperiment, vilket ger ett brett tillgängligt sätt att studera mitokondriell funktion i däggdjurssystem.
Det finns viktiga överväganden när man använder dessa analyser för att mäta mitokondriell funktion i odlade celler. När det gäller proliferationsanalyserna är det viktigt att justera antalet celler som seedas för fördubblingshastigheten för varje cellinje. Cellerna bör sås till minst 10% sammanflöde och med tillräckligt med utrymme för att möjliggöra tre till fyra fördubblingar så att skillnader i proliferation kan kvantifieras. En annan faktor för varje analys är koncentrationen av de små molekyler som används som kontroller för aktiviteterna i varje ETC-komplex. Eftersom olika cellinjer kan uppvisa olika känslighet för dessa hämmare är det viktigt att testa dosen av dessa små molekyler för att identifiera den optimala koncentrationen.
En universell begränsning av analyser som studerar mitokondriell funktion in vitro, inklusive OCR-mätningar och alla analyser som beskrivs här, är odlingsmediets metaboliska sammansättning. Standard cellodlingsmedium tenderar att fördubbla system till ytligt höga nivåer av mitokondriell funktion. Till exempel ökar suprafysiologiska glutaminnivåer sin anapleros av TCA-cykeln25, vilket bränner mitokondriell NADH-syntes och följaktligen ökar oxidativ fosforylering. På liknande sätt varierar partialtrycket av syre mellan 3 mmHg och 100 mmHg (cirka 0,1% -13%O2) i däggdjursvävnader men är atmosfäriskt (140 mmHg, cirka 21%) in vitro26,27. Detta överskottO2 maximerar mitokondriell andningsförmåga och superoxidproduktion28. Nyligen har ansträngningar gjorts för att designa kulturmedier för att vara mer fysiologiska29,30. I synnerhet minskar odling av celler i humana plasmaliknande medier mitokondriell andning i vissa cancercellinjer30, mitokondriell ROS i T-celler 31 och mitokondriella anpassningar till cancerterapi32. Därför är det viktigt att vara uppmärksam på sammansättningen av odlingsmediet som används och förstå hur det kan påverka mitokondriell funktion.
En annan viktig och universell begränsning i tolkningen av mitokondriell funktion är potentialen för skillnader i antalet mitokondrier. Det är därför viktigt att mäta mitokondriellt innehåll genom antingen kvantifiering av mtDNA33, mätning av mitokondriell massa med membranpotentialokänsliga färgämnen34 eller western blotting av mitokondriella markörer. Detta är en kritisk kontroll så att en minskning av antalet mitokondrier inte misstas för en minskning av mitokondriell funktion.
Det finns också specifika begränsningar och felsökning som gäller för de analyser som beskrivs här. För det första, med tanke på att differentierade celler inte prolifererar, kommer de proliferationsbaserade analyserna inte att vara användbara för att bedöma mitokondriell funktion i detta sammanhang. En viktig begränsning i 13C 4-aspartatspårningsprotokollet för att mäta DHODH-aktivitet är att aspartatupptag i celler kan vara extremt ineffektivt35. För att övervinna denna potentiella begränsning kan forskare överuttrycka aspartattransportören, SLC1A3, för att underlätta 13C 4-aspartatupptag35.
En begränsning av protokollet som använder 13C 5-glutaminspårning för att mäta SDH-aktivitet är att denna analys kräver att celler använder den reduktiva karboxyleringsvägen för att berika M + 3-isotopologerna för att mäta omvänd aktivitet. Vissa cellinjer är oförmögna till reduktivt karboxyleringsflöde på grund av lågt ATP-citratlyasuttryck36, otillräcklig HIF-stabilisering 37 eller ett α-KG: citratförhållande som är för lågt38. För att övervinna denna begränsning kan man använda 13C 4-aspartatspårning för att mäta SDH-aktiviteterna framåt och bakåt7. I denna analys kan SDH-framåtaktiviteten mätas med förhållandet fumarat M+2:succinat M+2 och omvänd reaktion med succinat M+4:fumarat M+4. I synnerhet kringgår denna spårning de flesta enzymerna i den reduktiva karboxyleringsvägen.
En begränsning av den komplexa I-aktivitetsanalysen med DCPIP-reduktion som avläsning är att mitokondrierna inte är strukturellt intakta. Processen att frystina mitokondrierna för att möjliggöra deras NADH-upptag för analysen kan säkert skada mitokondriens strukturella integritet39. Denna analys bör utföras parallellt med analyser såsom komplex I-proliferationsanalys för att säkerställa att förändringarna i komplex I-aktivitet som observerats också är sanna med intakta celler.
I framtida studier kan några av dessa tekniker anpassas för att mäta mitokondriella funktioner in vivo med hjälp av modellorganismer som möss och Caenorhabditis elegans. De nuvarande metoderna som används för att mäta mitokondriell funktion in vivo är centrerade på OCR på organismnivå, särskilt andningsväxelkursen vid användning av musmodeller. En tydlig begränsning av denna metod är att syre tjänar många biokemiska och signaleringsfunktioner utöver sin roll som en allestädes närvarande terminal elektronacceptor i mitokondriell ETC. Till exempel "konsumeras" syre av den katalytiska aktiviteten hos enzymer i dioxygenasfamiljen. Även om dessa enzymer bidrar till den cellulära syreförbrukningshastigheten, deltar de inte i, reglerar eller återspeglar mitokondriell funktion. Klassiska respirometriexperiment in vitro kontrollerar vanligtvis för "icke-mitokondriell OCR", medan organismal respiratorisk utbyteskvot (RER) -experiment inte kan kontrollera för detta, vilket begränsar tolkningen av RER som ett mått för mitokondriell funktion in vivo. Det är dock möjligt att anpassa protokollen för att mäta DHODH-aktivitet via 13 C 4-aspartatspårning, komplex II-aktivitet via 13C5-glutaminspårning, komplex I-aktivitet på mitokondrier renade från vävnader och mitokondriell ROS med LC-MS-vänliga föreningar såsom MitoB för att mäta mitokondriell funktion in vivo . Dessa direkta analyser för att undersöka mitokondriella funktioner, i kombination med klassiska respirometriexperiment, ger forskare en mer omfattande och noggrann bedömning av mitokondriell funktion i däggdjursceller och vävnader.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att rapportera.
Acknowledgments
Figurerna som produceras i detta manuskript skapades med BioRender.com. Vi är tacksamma för att Amy Walker ger feedback om den här artikeln. J.B.S. stöddes av Worcester Foundation for Biomedical Research Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube | Cell Treat | 667443 | |
| 2.0 mL tube | Cell Treat | 229446 | |
| 6-well plate | Cell Treat | 229106 | |
| 12-well plate | Cell Treat | 229112 | |
| 13C4-aspartate | Sigma-Aldrich | 604852 | |
| 13C5-Glutamine | Cambridge Isotope Laboratories | 285978-14-5 | |
| 15 mL centrifuge tube | Cell Treat | 667411 | |
| 50 mL centrifuge tube | Cell Treat | 667421 | |
| 150 mm tissue culture dish | Cell Treat | 229651 | |
| 1x Phosphate-buffered saline | Gibco | 10010049 | |
| 2,6-dichlorophenolindophenol | Honeywell | 33125 | |
| Ammonium Carbonate | Sigma-Aldrich | 37999 | |
| Antimycin | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Ascentis Express C18 | Sigma-Aldrich | 53825-U | |
| Bottle top filter 500 mL, 0.22 µm, PES 9 9 mm membrane diameter | Cell Treat | 229717 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Brequinar | Sigma-Aldrich | SML0113 | |
| Cell Lifter, Double End Flat and Narrow Blade | Cell Treat | 229305 | |
| CentriVap -105 Cold Trap | Labconco | 7385020 | |
| Complete Protease Inhibitor Tablets | Sigma-Aldrich | 4693116001 | |
| Coulter Counter Cups | Fisher Scientific | 07-000-694 | |
| Decylubiquinone | Sigma-Aldrich | D7911 | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Eppendorf Centrifuge 5425R | Eppendorf | 2231000908 | |
| Eppendorf Centrifuge 5910 Ri | Eppendorf | 5943000343 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G5388 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Glucose-free DMEM | Gibco | 11966025 | |
| Glutamine-free DMEM | Thermo Fisher | 11960044 | |
| Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| HPLC-grade 35% Ammonium hydroxide | Thermo Scientific | 460801000 | |
| HPLC-grade Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 900667 | |
| HPLC-grade Chloroform | Sigma-Aldrich | 366927 | |
| HPLC-grade formic acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| HPLC-grade Isopropanol | Sigma-Aldrich | 563935 | |
| HPLC-grade MeOH | Sigma-Aldrich | 900688 | |
| HPLC-grade Water | Sigma-Aldrich | 270733 | |
| Human Osteosarcome Cell Line 143B | ATCC | CRL-8303 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 320331-500ML | |
| Isotone buffer | Beckman Coulter | 8546719 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P2222 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| MitoSox Red | Invitrogen | M36008 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351-5MG | |
| Pencillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder, Size 21 | Kimble | 885502-0021 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Pyruvate-free DMEM media | Gibco | 11965175 | |
| Q Exactive Plus Mass Spectrometer | Thermo Scientific | 726030 | |
| ReCO2ver Incubator | Baker | ||
| Refrigerated Centrivap Benchtop Vacuum Concentrator | Labconco | 7310020 | |
| RIPA Buffer | Millipore Sigma | 20188 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| SeQuant ZIC-pHILIC 5μm 150 x 2.1 mm analytical column | Sigma-Aldrich | 1.50460.0001 | |
| SeQuant ZIC-pHILIC guard kit | Millipore Sigma | 1.50438.0001 | |
| Sodium Hydroxide, Pellets | Millipore Sigma | 567530-250GM | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SW, TRACEFINDER 5.1 SP3 | Thermo Scientific | OPTON-31001 | |
| Tert-butyl hydroperoxide solution | Sigma-Aldrich | 458139 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | 93352 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25-200-114 | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| VANQUISH HORIZON / FLEX HPLC | Thermo Scientific | VF-S01-A-02 | |
| Z2 Coulter Particle count and size analyzer | Beckman Coulter | BZ10131270 |
References
- Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
- Gorman, G. S., et al.
- Chandel, N. S., et al. Reactive oxygen species generated at mitochondrial complex III stabilize hypoxia-inducible factor-1alpha during hypoxia: A mechanism of O2 sensing. Journal of Biological Chemistry. 275 (33), 25130-25138 (2000).
- Cadenas, E., Boveris, A., Ragan, C. I., Stoppani, A. O. M. Production of superoxide radicals and hydrogen peroxide by NADH-ubiquinone reductase and ubiquinol-cytochrome C reductase from beef-heart mitochondria. Archives of Biochemistry and Biophysics. 180 (2), 248-257 (1977).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochemical Journal. 417 (1), 1-13 (2009).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
- Spinelli, J. B., et al. Fumarate is a terminal electron acceptor in the mammalian electron transport chain. Science. 374 (6572), 1227-1237 (2021).
- Kumar, R., et al. A redox cycle with complex II prioritizes sulfide quinone oxidoreductase-dependent H(2)S oxidation. Journal of Biological Chemistry. 298 (1), 101435 (2022).
- Warburg, O., Geissler, A. W., Lorenz, S. On growth of cancer cells in media in which glucose is replaced by galactose. Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physiologische Chemie. 348 (12), 1686-1687 (1967).
- Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants. Toxicological Sciences. 97 (2), 539-547 (2007).
- Attardi, G., King, M. P. Human cells lacking mtDNA: Repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
- Bodnar, A. G., Cooper, M., Leonard, J. V., Schapira, A. H. Respiratory-deficient human fibroblasts exhibiting defective mitochondrial DNA replication. Biochemical Journal. 305, 817-822 (1995).
- Gregoire, M., Morais, R., Quilliam, M. A., Gravel, D. On auxotrophy for pyrimidines of respiration-deficient chick embryo cells. European Journal of Biochemistry. 142 (1), 49-55 (1984).
- Mackay, G. M., Zheng, L., vanden Broek, N. J., Gottlieb, E. Analysis of cell metabolism using LC-MS and isotope tracers. Methods in Enzymology. 561, 171-196 (2015).
- Heinrich, P., et al. Correcting for natural isotope abundance and tracer impurity in MS-, MS/MS- and high-resolution-multiple-tracer-data from stable isotope labeling experiments with IsoCorrectoR. Scientific Reports. 8 (1), 17910 (2018).
- Lee, P., Chandel, N. S., Simon, M. C. Cellular adaptation to hypoxia through hypoxia inducible factors and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (5), 268-283 (2020).
- Bisbach, C. M., et al. Succinate can shuttle reducing power from the hypoxic retina to the O(2)-rich pigment epithelium. Cell Reports. 31 (2), 107606 (2020).
- Angebault, C., et al. Idebenone increases mitochondrial complex I activity in fibroblasts from LHON patients while producing contradictory effects on respiration. BMC Research Notes. 4, 557 (2011).
- Liao, P. C., Bergamini, C., Fato, R., Pon, L. A., Pallotti, F. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Methods in Cell Biology. 155, 3-31 (2020).
- Iwai, T., et al. Sodium accumulation during ischemia induces mitochondrial damage in perfused rat hearts. Cardiovascular Research. 55 (1), 141-149 (2002).
- Murphy, E., Eisner, D. A. Regulation of intracellular and mitochondrial sodium in health and disease. Circulation Research. 104 (3), 292-303 (2009).
- Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. Isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue. Journal of Visualized Experiments. (97), e52076 (2015).
- Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nature Metabolism. 4 (6), 651-662 (2022).
- Xiao, Y., Meierhofer, D. Are hydroethidine-based probes reliable for reactive oxygen species detection. Antioxidants and Redox Signaling. 31 (4), 359-367 (2019).
- DeBerardinis, R. J., et al. Beyond aerobic glycolysis: Transformed cells can engage in glutamine metabolism that exceeds the requirement for protein and nucleotide synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19345-19350 (2007).
- Keeley, T. P., Mann, G. E. Defining physiological normoxia for improved translation of cell physiology to animal models and humans. Physiological Reviews. 99 (1), 161-234 (2019).
- Ast, T., Mootha, V. K. Oxygen and mammalian cell culture: Are we repeating the experiment of Dr. Ox. Nature Metabolism. 1 (9), 858-860 (2019).
- Gu, C., Jun, J. C. Does hypoxia decrease the metabolic rate. Frontiers in Endocrinology. 9, 668 (2018).
- Voorde, J., et al. Improving the metabolic fidelity of cancer models with a physiological cell culture medium. Scientific Advances. 5 (1), 7314 (2019).
- Cantor, J. R., et al. Physiologic medium rewires cellular metabolism and reveals uric acid as an endogenous inhibitor of UMP synthase. Cell. 169 (2), 258-272 (2017).
- MacPherson, S., et al. Clinically relevant T cell expansion media activate distinct metabolic programs uncoupled from cellular function. Molecular Therapy. Methods and Clinical Development. 24, 380-393 (2022).
- Torres-Quesada, O., Doerrier, C., Strich, S., Gnaiger, E., Stefan, E. Physiological cell culture media tune mitochondrial bioenergetics and drug sensitivity in cancer cell models. Cancers. 14 (16), 3917 (2022).
- Chan, S. W., Chen, J. Z. Measuring mtDNA damage using a supercoiling-sensitive qPCR approach. Methods in Molecular Biology. 554, 183-197 (2009).
- Doherty, E., Perl, A. Measurement of mitochondrial mass by flow cytometry during oxidative stress. Reactive Oxygen Species. 4 (10), 275-283 (2017).
- Birsoy, K., et al. An essential role of the mitochondrial electron transport chain in cell proliferation is to enable aspartate synthesis. Cell. 162 (3), 540-551 (2015).
- Beigneux, A. P., et al.
- Gameiro, P. A., et al. In vivo HIF-mediated reductive carboxylation is regulated by citrate levels and sensitizes VHL-deficient cells to glutamine deprivation. Cell Metabolism. 17 (3), 372-385 (2013).
- Fendt, S. M., et al. Reductive glutamine metabolism is a function of the alpha-ketoglutarate to citrate ratio in cells. Nature Communications. 4, 2236 (2013).
- Lee, C. P. Biochemical studies of isolated mitochondria from normal and diseased tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 1271 (1), 21-28 (1995).
