Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Oksygenuavhengige analyser for å måle mitokondriefunksjon hos pattedyr

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/65184
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1,2
1Program in Molecular Medicine, University of Massachusetts Chan Medical School, 2Cancer Center, University of Massachusetts Chan Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en samling analyser for direkte måling av mitokondriell funksjon i pattedyrceller uavhengig av deres evne til å konsumere molekylært oksygen.

Abstract

Strømmen av elektroner i den mitokondrielle elektrontransportkjeden (ETC) støtter mangefasetterte biosyntetiske, bioenergetiske og signalfunksjoner i pattedyrceller. Siden oksygen (O2) er den mest allestedsnærværende terminale elektronakseptoren for pattedyrs ETC, brukesO2-forbrukshastigheten ofte som en proxy for mitokondriell funksjon. Ny forskning viser imidlertid at denne parameteren ikke alltid er indikativ for mitokondriell funksjon, da fumarat kan brukes som en alternativ elektronakseptor for å opprettholde mitokondrielle funksjoner i hypoksi. Denne artikkelen samler en rekke protokoller som tillater forskere å måle mitokondriell funksjon uavhengig av O2-forbruket. Disse analysene er spesielt nyttige når man studerer mitokondriell funksjon i hypoksiske miljøer. Spesielt beskriver vi metoder for å måle mitokondriell ATP-produksjon, de novo pyrimidinbiosyntese, NADH-oksidasjon ved kompleks I og superoksidproduksjon. I kombinasjon med klassiske respirometrieksperimenter vil disse ortogonale og økonomiske analysene gi forskere en mer omfattende vurdering av mitokondriell funksjon i deres interessesystem.

Introduction

Mitokondriell funksjon er en kritisk beregning av cellulær helse, da den opprettholder viktige biosyntetiske, bioenergetiske og signalfunksjoner i pattedyrceller1. De aller fleste mitokondriefunksjoner krever elektronstrøm gjennom elektrontransportkjeden (ETC), og forstyrrelser i elektronstrømmen i ETC forårsaker alvorlig mitokondriesykdom2. ETC består av en serie reduksjons- og oksidasjonsreaksjoner (redoks) som er innebygd i den indre mitokondriemembranen, og disse elektronoverføringsreaksjonene frigjør fri energi som kan utnyttes for å støtte ATP-syntese, fysiologiske prosesser som termogenese, biosyntetiske veier som de novo pyrimidin biosyntese, og balansen mellom redoksstatusen til kofaktorer som NADH. ETC-kompleks I og III produserer reaktive oksygenarter (ROS) 3,4,5, som igjen regulerer signaleringsveier som HIF, PI3K, NRF2, NFκB og MAPK 6. Følgelig er beregninger av elektronstrøm i ETC klassisk brukt som en proxy for mitokondriell funksjon i pattedyrceller.

Respirometri eksperimenter er ofte ansatt for å måle mitokondriell funksjon i pattedyrceller. Siden O2 er den mest allestedsnærværende terminale elektronakseptoren for pattedyrs ETC, brukes reduksjonen som en proxy for mitokondriell funksjon. Imidlertid viser nye bevis at pattedyrs mitokondrier kan bruke fumarat som en elektronakseptor for å opprettholde mitokondrielle funksjoner som er avhengige av ETC, inkludert de novo pyrimidin biosyntese 7, NADH oksidasjon7 og avgiftning av hydrogensulfid8. I visse sammenhenger, spesielt i hypoksiske miljøer, gir målinger avO2-forbrukshastigheten (OCR) derfor ikke en presis eller nøyaktig indikasjon på mitokondriell funksjon.

Her skisserer vi en rekke analyser som kan brukes til å måle mitokondriell funksjon uavhengig av OCR. Vi tilbyr analyser for direkte å måle kompleks I-mediert NADH-oksidasjon, dihydroorotat dehydrogenase-mediert de novo pyrimidin biosyntese, kompleks V-avhengig ATP-syntese, nettoretningen til succinat dehydrogenase (SDH) kompleks og mitokondriell avledet ROS. Disse analysene er ment å bli utført på dyrkede pattedyrceller, selv om mange kan tilpasses for å studere mitokondrielle funksjoner in vivo. Spesielt er analysene beskrevet i denne protokollen mer direkte målinger av mitokondrielle funksjoner enn OCR. Videre muliggjør de måling av mitokondriell funksjon i hypoksi, en kontekst der OCR ikke er en indikativ måling. Samlet sett vil disse analysene, i kombinasjon med klassiske respirometrieksperimenter, gi forskere en mer omfattende vurdering av mitokondriell funksjon i pattedyrceller.

Protocol

1. Spredningsanalyser for å måle aktiviteten til kompleks I, dihydroorotat dehydrogenase (DHODH) og komplekse V-aktiviteter

  1. Såceller for proliferasjonsanalyser
    MERK: Denne protokollen bruker den humane osteosarkomcellelinjen 143B kjøpt kommersielt fra ATCC. Denne cellelinjen ble brukt i henhold til retningslinjene i vår godkjente Institutional Biosafety Committee (IBC) protokoll.
    1. Fjern platene fra vevskulturinkubatoren. Aspirer mediet fra platene, og vask med 1x fosfatbufret saltvann (PBS) for å fjerne gjenværende medium. Aspirer PBS, og dekk parabolen med 0,05% -0,25% trypsin for å løfte cellene fra bunnen av platen.
    2. Vent 3-5 minutter til trypsinet frigjør cellene fra platen, og slukk deretter trypsinet med 10 ml av ønsket vekstmedium som inneholder 10% føtalt bovint serum (FBS).
    3. Samle cellene i et konisk rør, og sentrifuge ved 1000 × g i 5 minutter for å pelletere cellene.
    4. Aspirer mediet fra røret uten å forstyrre pelleten. Suspender pelleten med komplett medium.
    5. Telle cellene, og kvantifiser volumet som trengs for å frø mellom 10.000 og 25.000 celler i en 6-brønnsplate.
      MERK: Hver cellelinje må optimaliseres for antall celler som skal sees. Den ideelle sammenløpet som oppnås er ~ 10% i begynnelsen av eksperimentet og ~ 80% på slutten av eksperimentet.
    6. Pipetter cellene inn i en 6-brønnsplate, og tilsett 2 ml komplett medium til brønnene. La stå i 24 timer før du bytter til eksperimentelle mediumforhold.
      MERK: Frø minst tre replikater per tilstand og nok brønner til å teste den ubehandlede kontrolltilstanden, inhibitorbehandlet kontrolltilstand, ubehandlet eksperimentell tilstand og inhibitorbehandlet eksperimentell tilstand.
  2. Middels endring for å vurdere kompleks V-aktivitet ved spredning
    MERK: Celler som prolifererer i et medium med galaktose er avhengig av kompleks V-aktivitet for ATP-syntese 9,10. I motsetning til glukose, som gir netto to ATP fra glykolyse, gir galaktose ingen, noe som tvinger cellene til å være avhengige av kompleks V for ATP-syntese (figur 1). Den komplekse V-hemmeren oligomycin brukes som kontroll.
    1. Lag 10 ml glukoseholdig medium (se tabell 1).
    2. Lag 10 ml galaktoseholdig medium (se tabell 1).
    3. Bytt mediet i hver brønn til enten glukoseholdig DMEM eller galaktoseholdig DMEM. Tilsett 5 μM oligomycin (den komplekse V-hemmeren) til de relevante brønnene og samme volum DMSO til de ubehandlede brønnene. Oligomycinbestanden er 10 mM resuspendert i DMSO. Sett platen tilbake i vevskulturinkubatoren i 2 dager.
  3. Middels endring for å vurdere kompleks I-aktivitet ved spredning
    MERK: Celler som sprer seg i et pyruvatfritt medium er mer avhengige av kompleks I-aktivitet11,12. Uten pyruvat krever de dyrkede cellene kompleks I for å lette størstedelen av NADH-reoksidasjon tilbake til NAD+ (figur 2). Den komplekse I-hemmeren rotenon brukes som kontroll.
    1. Gjør pyruvatfritt DMEM-medium supplert med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin.
    2. Lag en 1 M oppløsning av pyruvat (se tabell 1).
    3. Endre mediet i hver brønn til enten pyruvatfritt medium eller pyruvatholdig medium. Tilsett 2 μM rotenon (kompleks I-hemmeren) til de behandlede brønnene og samme volum DMSO til de ubehandlede brønnene. Rotenonstammen er 25 mM resuspendert i DMSO. Sett platen tilbake i vevskulturinkubatoren i 2 dager.
  4. Middels endring for å vurdere DHODH-aktivitet ved spredning
    MERK: Celler som prolifererer i et uridinfritt medium krever dihydroorotat dehydrogenase (DHODH) aktivitet11,12,13. I fravær av eksogen uridin syntetiserer de dyrkede cellene pyrimidiner gjennom de novo-banen. DHODH-hemmeren brequinar brukes som kontroll.
    1. Gjør uridinfri DMEM supplert med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin.
    2. Lag en 10 mg/ml uridinstamløsning, og lag deretter et uridinmedium på 100 μg/ml uridin (se tabell 1).
    3. Bytt mediet i hver brønn til uridinfritt medium eller uridinholdig medium. Tilsett 5 μM brequinar (DHODH-hemmeren) til de behandlede brønnene og samme volum DMSO til de ubehandlede brønnene. Brequinar-bestanden er 10 mM resuspendert i DMSO. Sett platen tilbake i vevskulturinkubatoren i 2 dager.
  5. Telle cellene for proliferasjonsanalyser
    1. For alle forsøkene, fyll på mediet hver 2. Hvis mediet blir gult i fargen, øker frekvensen av mediet. La cellene spre seg i opptil 7 dager, og stopp eksperimentet hvis noen av brønnene begynner å se overgrodde ut. Brønner anses å være gjengrodd når samløpet overstiger 80%.
    2. Aspirer mediet, vask med 1x PBS, og dekk bunnen av brønnen med 0,25% trypsin (500 μL for en 6-brønns tallerken).
    3. Vent 5 min til cellene har løftet av fatet. Sjekk dette under et mikroskop.
    4. Slukk trypsinen med 1 ml komplett DMEM inneholdende 10% FBS.
    5. Pipett opp og ned for å bryte fra hverandre celleklumpene.
    6. Forbered Coulter tellerkopper ved å fylle hver med 10 ml isoton buffer (en kopp per brønn). Tell cellene i en celleteller, og registrer dataene. Hvis avlesningen er celler per milliliter (celler / ml), multipliser den registrerte verdien med 1,5 for å få totalt antall celler per brønn.
      MERK: Andre celletellingsmetoder som et hemocytometer vil være tilstrekkelig hvis laboratoriet ikke har en Coulter-teller.

2. 13C 4-aspartat stabil isotopsporing og LC-MS analyse for å måle DHODH aktivitet

  1. 13C4-aspartat stabil isotopsporing i adherente celler
    MERK: DHODH-aktivitet kan overvåkes direkte ved å måle inkorporering av 13 C 4-aspartat i 13C3-UMP. Brequinar brukes som kontroll for DHODH-aktivitet (figur 3). De resulterende nivåene av 13C3-UMP er et mål på DHODH-aktivitet.
    1. Frø mellom 250.000 og 500.000 celler i en 6-brønns tallerken for å oppnå 75% samløp neste dag.
    2. Lag en stamoppløsning på 250 mM 13 C 4-aspartat og 10 mM 13C4-aspartat medium (se tabell 1).
    3. Bytt medium i hver brønn til medium inneholdende 10 mM 13C 4-aspartat. Inkuber i riktig antall timer for å oppnå en jevn tilstand for merking av cellene av interesse.
      MERK: Steady state er definert som tidsrammen der prosentandelen merket metabolitt platåer over tid14. For 143B osteosarkomceller oppnår 13C 4-aspartat en stabil tilstand ved 8 timer. Det er beste praksis å bestemme denne tidsrammen før eksperimenteringen ved å gjøre et tidskurseksperiment med den stabile isotopen av interesse.
  2. Metabolittisolering fra de adherente cellene
    1. Før du begynner, klargjør du en bøtte med tørris, og tilbered 80% HPLC-klasse MeOH i HPLC-grade vann. Avkjøl denne bufferen i en fryser på -80 °C over natten eller legg den direkte på tørris.
    2. Ta en plate ut om gangen fra inkubatoren, aspirer mediet fra brønnene, og vask 2x med 1x PBS. Fjern all gjenværende PBS fra brønnene før du går videre til neste trinn.
      NOTAT: Sørg for å vippe platen under aspirasjon og pipette mot veggen av fatet for å forhindre forstyrrelse av de adherente cellene.
    3. Plasser platen på tørris, og tilsett umiddelbart 800 μL 80% LCMS-grade MeOH i 20% LCMS-grade vann til hver brønn.
    4. Inkuber platen i minst 15 minutter i en fryser på -80 °C for å lette cellelysen.
      MERK: På dette tidspunktet kan neste plate tas ut av inkubatoren og trinn 2.2.1-2.2.4 gjentas. Fortsett dette til alle platene ruges i fryseren på -80 °C.
    5. Ta en plate ut av gangen fra fryseren, skrap hver brønn på tørris ved hjelp av en celleløfter, og overfør lysatet til et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Hold tuben på tørris til neste trinn.
    6. Virv alle rørene i 10 minutter ved 4 °C, og sentrifuger deretter ved 4 °C i 10 minutter ved maksimal hastighet (minst 17 000 × g).
    7. Overfør supernatanten til et 1,5 ml mikrosentrifugerør og tørk ned i en 4 °C vakuumkonsentrator utstyrt med en -105 °C kuldefelle på en høyvakuuminnstilling i ca. 6 timer eller til prøvene har fordampet. Når lysatet er tørket ned, oppbevares metabolittpelletsene ved -80 °C til de er klare til å klargjøres for væskekromatografi parret med massespektrometri (LCMS).
  3. Væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) måling av polare metabolitter
    MERK: Enhver kromatografisk og massespektrometri arbeidsflyt som muliggjør påvisning av aspartat, mellomproduktene i de novo pyrimidin biosyntese, og UMP vil være tilstrekkelig14.
    1. Forbered prøvene for LCMS på is ved å tilsette 100 μL HPLC-vann til de tørkede pelletsene og virvelen i 10 minutter ved 4 °C.
    2. Sentrifuger prøvene ved 4 °C i 10 minutter ved maksimal hastighet (minst 17 000 × g) og flytt 25 μL inn i hvert LC-MS-hetteglass.
    3. Injiser 2 μL lysat inn i LC-MS-systemet. En vanlig brukt metodikk er gitt nedenfor:
      1. Klargjøre mobil fase A bestående av 20 mM ammoniumkarbonat (LC-MS grad) og 0,1 % ammoniumhydroksid (LC-MS grade) oppløst i LC-MS-gradert vann.
      2. Velg 100% acetonitril (LC-MS grade) som mobil fase B.
      3. For kromatografi, velg en 5 μm, 150 mm x 2,1 mm analytisk kolonne utstyrt med en 2,1 mm x 20 mm beskyttelseskolonne for hydrofile forbindelser (se materialfortegnelsen). Sett søyleovnen på 25 °C.
      4. Bruk følgende væskekromatografiinnstillinger: en konstant strømningshastighet på 0,15 ml / min; en lineær gradient fra 80 % til 20 % mobil fase B i 20 minutter, etterfulgt av en lineær gradient fra 20 % til 80 % mobil fase B i 0,5 min, etterfulgt av et hold ved 80 % mobil fase B i 7,5 min.
      5. Velg følgende massespektrometerinnstillinger: en full skanning mellom m / z 70 Da og 1,000 Da; en oppløsning på 70 000; et AGC-mål på 1 × 106; og en maksimal injeksjonstid på 20 ms. Bruk kilden i polaritetsbyttemodus. Still sprøytespenningen på 3,0 kV, den oppvarmede kapillæren ved 275 °C, HESI-sonden ved 350 °C, kappegasstrømmen ved 40 enheter, hjelpegasstrømmen ved 15 enheter og feiegasstrømmen ved 1 enhet.
    4. Utfør dataanalysen ved hjelp av programvare som grensesnitt med LCMS-arbeidsflyten.
      MERK: Programvaren som brukes med arbeidsflyten ovenfor er XCalibur (Thermo) og TraceFinder (Thermo). Viktige hensyn for dataanalyse er skissert nedenfor:
      1. Forventede oppbevaringstider: Bestem retensjonstiden for hver metabolitt ved å kjøre standardene for hver metabolitt av interesse ved hjelp av kromatografisk metode før eksperimentet.
        MERK: Retensjonstidene for UMP og dets isotopologer, inkludert 13C3-UMP, er nøyaktig de samme.
      2. Forventet M/Z for metabolitter: Hvis en metabolitt ioniserer i negativ ionmodus (for eksempel UMP), beregne den forventede eksakte massen ved hjelp av molekylformelen for UMP minus etproton [C 9 H14N2O9P]. For metabolitter som ioniserer i positiv ionmodus, beregne den nøyaktige massen ved å bruke molekylformelen pluss et proton.
      3. Masse nøyaktighet: Ved bruk av et orbitrap-massespektrometer forventes metabolitten av interesse og dens isotopologer å ha en massenøyaktighet ±5 mmu. Bruk programvare til å beregne dette, ta høyde for forventet M/Z og faktisk registrert M/Z.
      4. Naturlig overflod korreksjon: Alle sporingsdata forventes å gjennomgå naturlig mengdekorreksjon for å ta hensyn til ~1 % 13C og ~0,5 % 15 N-isotoper i naturen 15.

3. 13C 5-glutamin stabil isotopsporing for å måle SDH-aktivitet

  1. 13C 5-glutamin stabil isotopsporing i adherente celler
    MERK: SDH-aktivitet kan overvåkes direkte ved å måle omdannelsen av visse isotopologer av fumarat og succinat ved 13C 5-glutaminsporing 7,16,17. Den komplekse III-hemmeren antimycin brukes som kontroll for å endre nettoretningen til SDH-komplekset (figur 4).
    1. Frø mellom 250.000 og 500.000 celler i en 6-brønns tallerken for å oppnå 75% samløp neste dag.
    2. Forbered en bestand på 50 mM 13C 5-glutamin (se tabell 1).
    3. Klargjør sporingsmedium inneholdende 2 mM13C 5-glutamin (se tabell 1).
    4. Bytt medium i hver brønn til medium inneholdende 2 mM 13C 5-glutamin. Inkuber i riktig antall timer for å oppnå en jevn tilstand av merking av interessecellene (se notatet i trinn 2.1.3).
    5. Isoler metabolittene etter protokollen i trinn 2.2.
    6. Analyser eksemplene på LC-MS ved å følge arbeidsflyten beskrevet i trinn 2.3.
  2. Analysere SDH-aktiviteten basert på merkemønstre
    MERK: Succcinatoksidasjonsaktiviteten til SDH-komplekset kan overvåkes ved å vurdere forholdet mellom 13 C 4-fumarat og 13 C4-succinat ved 13C5-glutaminsporing. Fumaratreduksjonsaktiviteten til SDH-komplekset kan overvåkes ved å vurdere forholdet mellom 13 C 3-succinat og 13 C3-fumarat ved 13C 5-glutaminsporing.
    1. Beregn prosentmerkingen av 13 C 3-fumarat, 13 C 4-fumarat, 13 C3-succinat og 13 C4-succinat. For eksempel, for å bestemme prosentandelen av 13 C 3-fumarat, oppsummer alle de integrerte toppområdene for fumaratisotopologene (umerket fumarat, 13 C 1-fumarat, 13 C2-fumarat, 13 C 3-fumarat og 13 C4-fumarat), og del toppområdet for 13C 3-fumarat med det totale isotopologområdet. Multipliser med 100.
    2. For å beregne succinatoksydasjonen, del prosentandelen 13 C 4-fumarat med prosentandelen 13C4-succinat.
    3. For å beregne fumaratreduksjonen, del prosentandelen 13 C 3-succinat med prosentandelen 13C 3-fumarat.

4. Direkte kompleks I aktivitetsanalyse

MERK: DCPIP er en kunstig elektronakseptor; Det endres til redusert form når man aksepterer elektroner fra ubiquinol. I denne analysen reduseres ubiquinone til ubiquinol via den komplekse I-medierte oksidasjonen av NADH til NAD+. Dermed er måling av omsetningen av oksidert DCPIP i denne cellefrie analysen en proxy for kompleks I-aktivitet 7,18.

  1. Rensing og kvantifisering av mitokondriene fra celler
    MERK: Enhver mitokondriell rensingsprotokoll kan brukes til denne analysen19.
    1. Utvid cellene til 25-100 millioner celler er oppnådd. Aspirer mediet av oppvasken, vask med 1x PBS, aspirer PBS og tryspiniser cellene med 0,25% trypsin. Slukk trypsinet med kulturmedium, og pellet cellene ved 1000 × g i 5 minutter.
    2. Vask cellepellets 2x i 5 ml 1x PBS, og gjenta sentrifugeringen ved 1000 × g i 5 minutter for å pelletere cellene. Oppbevar de vaskede pelletsene i en fryser på −20 °C til mitokondriell rensing.
      MERK: Ikke fryse-tine cellepellets mer enn én gang.
    3. Klargjør isolasjonsbufferen for mitokondrier (se tabell 1).
      MERK: Natriumholdige reagenser som NaOH bør ikke brukes til å fremstille mitokondrieisolasjonsbuffere, da natrium tarnishes mitokondriemembranpotensialet20 og forstyrrer mitokondriell kalsiumhomeostase21.
    4. Resuspender cellepellets til 10 millioner celler per 1 ml mitokondrieisolasjonsbuffer. For eksempel, resuspendere 100 millioner pelleterte celler i 10 ml mitokondrier isolasjonsbuffer.
      MERK: Sørg for å forstyrre celleklumpene uten å introdusere bobler i bufferen.
    5. Flytt 2 ml cellesuspensjon til en forkjølt glasshomogenisator med et arbeidsvolum på 3-8 ml som er kompatibelt med en Potter-Elvehjem PTFE-pestel. Homogeniser cellene med 10-20 slag, overvåking av cellene under et mikroskop for å bekrefte cellelyse gjennom homogeniseringsprosessen. Øk antall slag om nødvendig for å sikre effektiv cellelyse.
      MERK: Hvis homogenisering av cellene med metoden ovenfor ikke er effektiv for lysering av cellene, bytt til en sprøyte lysemetode22.
    6. Overfør 2 ml av cellelysatet til et mikrosentrifugerør på is, og gjenta trinnene ovenfor til hele cellesuspensjonen er homogenisert.
    7. Pellet kjernene og celleavfall ved 650 × g i 10 minutter i en 4 ° C sentrifuge.
    8. Flytt supernatanten til et nytt 2,0 ml rør, og gjenta sentrifugeringen ovenfor ved 650 × g i 10 minutter ved 4 °C.
    9. Flytt supernatanten til et nytt 2,0 ml rør, og pellet de rå mitokondriene ved 7000 × g i 10 minutter i en sentrifuge på 4 °C.
    10. Kast supernatanten og resuspender pelleten i 1 ml mitokondrieisolasjonsbuffer. Flytt 50 μL inn i et nytt rør for proteinkvantifisering. Gjenta sentrifugeringstrinnet ovenfor på de to alikotene i prøven (50 μL-prøven og den resterende ~950 μL).
    11. Kast supernatanten og oppbevar pelletsene i en fryser på −80 °C til den er klar til bruk.
    12. Tilsett 200 μL RIPA-buffer til pellets fra 50 μL-alikoten for å trekke ut proteinet, virvel i 10 minutter og sentrifuge ved 21 000 × g for å isolere proteinet. Kvantifiser mengden protein i 50 μL-alikoten, og bruk dette tallet til å kvantifisere det gjenværende proteinet i 950 μL-prøven. For eksempel, hvis proteinkvantifiseringen for 50 μL-alikoten er 1 μg / μL, er totalproteinet i den gjenværende mitokondrielle pelleten 950 μg (1 μg / μL × 950 μL).
  2. Utføre den komplekse I-aktivitetsanalysen
    MERK: 143B osteosarkomcellelinjen ble brukt til denne analysen, men protokollen kan tilpasses for alle dyrkede celler.
    1. Resuspender rensede mitokondrier i mitokondrienes suspensjonsbuffer (se tabell 1) til en endelig konsentrasjon på 5 mg protein/ml.
    2. Utfør fem fryse-/tinesykluser i en fryser på -20 °C for å gjennomsyre mitokondriene.
    3. Lag den komplekse I aktivitetsanalysebufferen (se tabell 1).
    4. Bland 50 ug av 5 mg/ml mitokondriemassen med 90 μL kompleks I-aktivitetsbuffer. Forbered fem ubehandlede replikater og fem rotenonbehandlede (5 μM) replikater for å kontrollere for kompleks I-aktivitet.
    5. Les av absorbansen ved baseline ved 600 nm i en plateleser satt til 37 °C.
    6. Start reaksjonen ved å tilsette NADH til en endelig konsentrasjon på 2 mM, og følg absorbansen (600 nm) over et tidsrom på 1 time, og måler minst hvert 2. minutt gjennom. Reduksjonen i absorbans indikerer en reduksjon av DCPIP via kompleks I aktivitet.
      MERK: NADH bør tilsettes ved hjelp av en flerkanals pipette for å sikre at alle prøvene startes samtidig.

5. LC-MS-basert analyse for å måle superoksidnivåene

MERK: Fluorescensegenskapene til MitoSox Red kan endres uavhengig av reaksjonen med superoksid23. Denne LC-MS-baserte analysen måler produktet direkte fra superoksid som reagerer med MitoSox Red. Følgende analyse er litt modifisert fra Xiao et al.24. 2-hydroksy-mitoethidium (2-OH MitoE2+) er produktet av superoksidreaksjonen (figur 5). Caki1-cellelinjen ble brukt til denne analysen, men protokollen kan tilpasses for alle dyrkede celler.

  1. Behandling av adherente celler med MitoSox Red
    1. Frø mellom 250.000 og 500.000 celler i en 6-brønns tallerken for å oppnå 75% samløp neste dag. Sørg for å frø et sett med plater for LC-MS-analysen og et duplikatsett med plater for normalisering av celletall.
    2. Forbered komplett DMEM som inneholder 10% varmeinaktivert FBS og 1% penicillin-streptomycin i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium.
    3. Oppdater mediet i alle brønnene for alle forhold med 2 ml komplett DMEM. Sørg for å legge til noen medisiner eller behandlinger av interesse på dette punktet.
    4. Inkubere cellene i en vevskulturinkubator i 1 time.
    5. Forbered positive og negative kontroller. Klargjør en 50 mM bestand av tert-butylhydroperoksid fortynnet i PBS og en 250 mM bestand av N-acetylcystein (NAC) fortynnet i DMSO (se tabell 1).
      MERK: Tertbutylhydroperoksid (tBuOOH) er en potent reaktiv oksygenart som vil fungere som en positiv kontroll og øker mengden av 2-OH MitoE2 +. NAC er en potent antioksidant som vil fungere som en negativ kontroll og nøytralisere superoksidproduksjonen forårsaket av tBuOOH.
    6. Tilsett 1 μL tBuOOH til de positive kontrollbrønnene og 1 μL tBuOOH + 100 μL NAC til de negative kontrollbrønnene.
      MERK: Bruk av en P2-pipette (0,1-2 μL-område) er den optimale måten å overføre 1 μL på.
    7. Inkubere i 1 time i en vevskulturinkubator.
    8. Forbered 1 mM MitoSox Red stock (se tabell 1), og tilsett 2 μL av 1 mM MitoSox Red til hver brønn for å oppnå en endelig konsentrasjon på 1 μM. Inkuber i 30 minutter i en vevskulturinkubator.
    9. Under denne endelige inkubasjonen teller du en av de dupliserte platene for å skaffe celletellingene for å normalisere de endelige LC-MS-dataene.
  2. Isolering av det oksiderte Mitosox Red-produktet fra de adherente cellene
    1. Få en bøtte med tørris, og legg kjølig HPLC-grade isopropanol på tørrisen før du begynner isolasjonen.
    2. Ta ut en tallerken om gangen, aspirer mediet fra brønnene og vask 2x med 1 ml 1x PBS. Aspirer all gjenværende PBS fra brønnene før du går videre til neste trinn.
      NOTAT: Sørg for å vippe platen under aspirasjonen og pipetten mot veggen på fatet for å forhindre forstyrrelse av de klebende cellene.
    3. Plasser platen på tørris, og tilsett 800 μL HPLC-isopropanol til hver brønn.
    4. Inkuber platen i minst 15 minutter i en fryser på -80 °C for å lette cellelysen.
      MERK: På dette tidspunktet kan neste plate tas ut av inkubatoren og trinn 5.2.1-5.2.4 gjentas. Fortsett dette til alle platene ruges i fryseren på -80 °C.
    5. Ta en plate ut om gangen fra fryseren, skrap hver brønn på tørris ved hjelp av en celleløfter, og overfør lysatet til et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Hold tuben på tørris til neste trinn.
    6. Virv alle rørene i 10 minutter ved 4 °C, og sentrifuger deretter ved 4 °C i 10 minutter ved maksimal hastighet (minst 17 000 × g).
    7. Overfør supernatanten til et 1,5 ml mikrosentrifugerør og tørk ned i en vakuumkonsentrator. Når lysatet er tørket ut, oppbevares metabolittpellets ved -80 °C til det er klart for LC-MS.
  3. LC-MS måling av MitoSox rød og 2-hydroksy-mitoethidium (2-OH MitoE2+)
    1. Forbered prøvene for LCMS på is ved å tilsette 100 μL av en 3: 3: 1-blanding av HPLC-klasse MeOH: kloroform: vann. Virvel i 10 min ved 4 °C.
    2. Flytt 25 μL inn i hvert LC-MS hetteglass. Oppbevar resten av prøven i -80 °C fryseren.
    3. Forbered følgende væskekromatografibuffere: i) buffer A: HPLC-klasse vann med 0,1% maursyre; ii) buffer B: HPLC-grad acetonitril med 0,1 % maursyre.
    4. Åpne Thermo XCalibur Instrument Setup-appen for å begynne å utvikle metoden.
    5. Se etter to bokser på venstre sidefelt i dette vinduet - den første boksen tillater kromatografimetodeutvikling, og den andre boksen tillater massespektrometrimetodeutvikling.
    6. Væskekromatografi metodeutvikling:
      1. Sett en strømningshastighet på 0,25 ml / min, og start metoden ved 20% B, stigende til 95% B i løpet av 12 minutter. I løpet av det neste minuttet, slipp buffer B ned igjen til 20 % B, og oppretthold dette nivået de neste 2 minuttene.
        MERK: De siste 2 minuttene med strømning ved 20 % B er avgjørende for at kolonnetrykket skal falle tilbake til det opprinnelige trykket og for å balansere kolonnen med passende bufferforhold. Hvis du ikke inkluderer dette likevektstrinnet, vil oppbevaringstidene forskyves for alle prøvene som kjøres etterpå.
    7. Opprett en tunefil med følgende parametere:
      1. Åpne Tune-appen, og opprett en ny tunefil.
      2. Bruk eventuelle overlappende innstillinger fra Method Setup-modulen (se trinn 5.3.9.3) også på denne justeringsfilen, inkludert skanneområde, oppløsning, polaritet, AGC-mål og maksimal IT.
      3. Sett kappegassen til 30, AUX-gassen til 3 og feiegassen til 3 også. Sett sprøytespenningen til 3 kV, kapillærtemperaturen til 300 og S-objektivets RF-nivå til 60.
    8. Utvikling av massespektrometrimetoder:
      1. Fra listen nederst til venstre over potensielle skanninger, dra og slipp Full MS til midten av vinduet. Sørg for å klikke på Full MS-firkanten etter slippet for å justere innstillingene. Den totale MS-metodens varighet er 13 min.
        MERK: LC-metoden er lengre enn MS-metoden fordi de siste 2 minuttene er for kolonnerekondisjonering og ikke metabolittkvantifisering.
      2. På høyre side av modulen, under Egenskaper for metoden, må du kontrollere at Metodevarighet og Kjøretid er satt til 13,00 min.
      3. Kjør denne fullstendige skanningen i positiv modus med en oppløsning på 70 000 og et AGC-mål på 1 × 106. Sett maksimal IT til 100 ms og skanneområdet fra 300 m/z til 700 m/z.
      4. Under Tune Files mot toppen av modulen, observer at tunefilen som nettopp ble opprettet, er knyttet til denne metoden.
    9. Kjør metoden for MitoSox Red deteksjon med 2 μL prøveinjeksjoner.

Representative Results

Aktivitetene til DHODH, kompleks I og kompleks V kan alle vurderes ved hjelp av spredningsanalyser. Ved deprivasjon av uridin fra kulturmediet blir cellene mer avhengige av de novo-banen for pyrimidinbiosyntese. Når celler ble utfordret til å proliferere i et uridinfritt medium, var de derfor mer følsomme for inhibering av DHODH-aktivitet av brekinar enn celler dyrket i et medium som inneholdt uridin (figur 6A). På samme måte gjør berøvelse av pyruvat fra kulturmediet cellene mer avhengige av kompleks I-aktivitet for spredning. Når celler ble utfordret til å proliferere i et pyruvatfritt medium, var de derfor mer følsomme for inhibering av kompleks I-aktivitet ved rotenon enn celler dyrket i et pyruvatholdig medium (figur 6B). Kompleks V-aktivitet kan vurderes ved å utfordre celler til å proliferere i et medium som inneholder galaktose i stedet for glukose. Siden galaktose gir netto null ATP i glykolyse, er celler som vokser i dette drivstoffet mer avhengige av mitokondriell ATP-syntese via kompleks V-aktivitet. Dermed var celler som prolifererte i et galaktoseholdig medium mer følsomme for kompleks V-hemming av oligomycin enn celler som prolifererte i et glukoseholdig medium (figur 6C).

SDH-aktivitet kan måles ved hjelp av 13C 5-glutaminsporing og ved å overvåke inkorporering i fumarat og succinate isotopologer. Under kjøretøybehandlede forhold favoriserte SDH-komplekset den fremre aktiviteten, og inkorporeringen av 13 C-4-succinat i 13C-4-fumarat var høyere enn inkorporeringen av 13 C-3-fumarat i 13 C3-succinat (figur 7). Ved antimycinbehandlede tilstander favoriserte SDH-komplekset omvendt aktivitet, og inkorporeringen av 13 C 3-fumarat i 13 C3-succinat var større enn inkorporeringen av 13 C 4-succinat i 13C 4-fumarat (figur 7).

Superoksidproduksjonen inne i mitokondriene kan måles ved hjelp av fluorescerende reporter MitoSox, som genererer 2-hydroksy-mitoethidium ved reaksjon med superoksid. I denne studien hadde celler behandlet med MitoSox i nærvær av tertbutylhydrogenperoksid høyere nivåer av 2-hydroksy-mitoethidium på en måte som ble undertrykt ved tilsetning av NAC, en antioksidant som slukker cellulær ROS (figur 8).

Figure 1
Figur 1: Mekanistisk grunnlag for den komplekse V-proliferasjonsanalysen. Oksidasjon av glukose og galaktose via glykolyse. Glukose gir netto to ATP fra glykolyse, mens galaktose gir netto null ATP fordi UTP-syntese er nødvendig for UDP-galaktose. Dermed er celler dyrket i galaktose mer avhengig av mitokondriell ATP-syntese på grunn av mangel på ATP produsert fra glykolyse. Forkortelser: GALK = galaktokinase; GALT = galaktose-1-fosfat uridylyltransferase; PGM1 = fosfoglukomutase 1; GPI = glukose-6-fosfat isomerase, UGP = UDP-glukosepyrofosforylase; GALE = UDP-galaktose-4-epimerase; NDK = nukleotiddifosfatkinase; UMPK = uridinmonofosfat kinase; HK = heksokinase; PFK = fosfofructokinase; ALDO = aldolase; TPI = triosefosfat isomerase; GAPDH = glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase; PGK = fosfoglycerat kinase; PGM = fosfoglukomutase; ENO = enolase; PK = pyruvat kinase. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Mekanistisk grunnlag for den komplekse I-spredningsanalysen. Skjematisk fremstilling av metabolske veier som endres ved hemming av kompleks I-aktivitet. I høypyruvatmedier omgås kompleks I-hemming via LDH-mediert NADH-oksidasjon. I lavpyruvatmedier er denne tilpasningen mindre gjennomførbar, noe som gjør cellene mer avhengige av kompleks I-aktivitet for å reoxidisere NADH. Forkortelser: LDH = laktat dehydrogenase; TCA-syklus = trikarboksylsyresyklus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Skjematisk fremstilling av DHODH-reaksjonen ved 13C 4-aspartatsporing. Brequinar hemmer dihydroorotat oksidasjon å orotate, og dermed hindre nedstrøms syntese av UMP. 13C 4-aspartat er inkorporert i 13C3-UMP via DHODH aktivitet. Forkortelser: OMM = ytre mitokondriemembran; IMM = indre mitokondriemembran; DHODH = dihydroorotat dehydrogenase. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Måling av forover- og reverskompleks II-aktivitet via 13C 5-glutaminsporing. For å måle fremoverkompleks II-aktivitet (venstre) overvåkes inkorporering av 13 C 5-glutamin i 13 C 4-succinat og 13C4-fumarat. For å måle omvendt kompleks II-aktivitet (høyre) overvåkes inkorporering av 13 C 5-glutamin i 13 C 3-succinat og 13C 3-fumarat. Forkortelser: SDH = succinat dehydrogenase; CytC = cytokrom C. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: MitoSox rød reaksjon med superoksid. Reaksjonen av MitoSox med mitokondrielle superoksider for å danne 2-OH-MitoE2+. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Proliferasjonsbaserte analyser for å måle mitokondriell funksjon (A) Spredning av 143B osteosarkomceller behandlet med 5 uM brequinar, en DHODH-hemmer, i medium med ±100 ug/ml uridin. Data er gjennomsnittlige ± SEM; N = 3 per betingelse. (B) Spredning av 143B osteosarkomceller behandlet med 2 uM rotenon, en kompleks I-hemmer, i medium med ±5 mM pyruvat. Data er gjennomsnittlige ± SEM; N = 3 per betingelse. (C) Spredning av 143B osteosarkomceller behandlet med 5 uM oligomycin, en kompleks V-hemmer, i medium med enten 10 mM glukose eller 10 mM galaktose som eneste sentrale karbonkilde. Data er gjennomsnittlige ± SEM; N = 3 per betingelse. * indikerer p < 0,05 ved hjelp av en enveis ANOVA-test i Graphpad Prism. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: 13C 5-glutaminsporing for å måle kompleks II-aktivitet. Succinate oksidasjon og fumaratreduksjon (SDH revers) i DMSO og 500 nM antimycin A-behandlede Caki1- og DLD1-celler. Data representerer gjennomsnitt ± SEM; N = 3 per betingelse. indikerer p < 0,05 ved bruk av en upparet t-test i GraphPad Prism. Forkortelser: SDH = succinat oksidasjon; SDH revers = fumarat reduksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: LCMS-basert MitoSox-analyse for å oppdage superoksid. Ekstrahert ionekromatogram av 2-OH-Mito E2+ isolert fra Caki1-celler behandlet med MitoSox i 30 minutter i nærvær av tBuOOH ± NAC. Forkortelser: LCMS = væskekromatografi-massespektrometri; NAC = N-acetylcystein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Sammensetning av reagenser, buffere og medier brukt i denne protokollen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

Som ny forskning viser at pattedyrs mitokondrier kan fungere uten å konsumere molekylært oksygen, er det av største betydning for forskere å bruke ortogonale analyser, utover OCR-målinger, for nøyaktig kvantifisering av mitokondriell funksjon. Her samlet vi en rekke analyser som kan brukes til å direkte vurdere aktivitetene til kompleks I, kompleks II, kompleks V og DHODH ved å måle mitokondriell NAD + / NADH-balanse, utnyttelse av adaptive terminale elektronakseptorer, produksjon av ATP, de novo pyrimidin biosyntese og mitokondrie-avledet ROS. Spesielt måler disse analysene mer direkte mitokondriell funksjon enn OCR-målinger. Videre gir disse analysene forskere traktable måter å kvantifisere mitokondriell funksjon under hypoksi, for hvilke OCR-målinger i stor grad er irrelevante på grunn av at fumarat brukes som den favoriserte terminale elektronakseptoren. Endelig er de spredningsbaserte metodene beskrevet her mer kostnadseffektive enn klassiske respirometrieksperimenter, og gir dermed en bredt tilgjengelig måte å studere mitokondriell funksjon i pattedyrsystemer.

Det er viktige hensyn når man bruker disse analysene til å måle mitokondriell funksjon i dyrkede celler. Når det gjelder spredningsanalysene, er det viktig å justere antall celler som er sådd for doblingshastigheten for hver cellelinje. Cellene bør sås til minst 10% sammenløp og med nok plass til å tillate tre til fire doblinger slik at forskjeller i spredning kan kvantifiseres. En annen vurdering for hver analyse er konsentrasjonen av de små molekylene som brukes som kontroller for aktivitetene til hvert ETC-kompleks. Siden forskjellige cellelinjer kan utvise forskjellige følsomheter overfor disse inhibitorene, er det viktig å teste dosen av disse små molekylene for å identifisere den optimale konsentrasjonen.

En universell begrensning av analyser som studerer mitokondriell funksjon in vitro, inkludert OCR-målinger og alle analysene beskrevet her, er den metabolske sammensetningen av kulturmediet. Standard cellekulturmedium har en tendens til å skjevgjøre systemer til overfladisk høye nivåer av mitokondriell funksjon. For eksempel øker suprafysiologiske glutaminnivåer sin anaplerose av TCA-syklusen25, som brenner mitokondriell NADH-syntese og følgelig øker oksidativ fosforylering. Tilsvarende varierer partialtrykket av oksygen mellom 3 mmHg og 100 mmHg (ca. 0,1% -13%O2) i pattedyrvev, men er atmosfærisk (140 mmHg, ca. 21%) in vitro26,27. Dette overskuddet av O2 maksimerer mitokondriell respiratorisk kapasitet og superoksidproduksjon28. Nylig har det blitt gjort forsøk på å designe kulturmedier til å være mer fysiologiske29,30. Spesielt reduserer dyrking av celler i humane plasmalignende medier mitokondriell respirasjon i noen kreftcellelinjer30, mitokondriell ROS i T-celler 31 og mitokondrielle tilpasninger til kreftbehandling32. Det er derfor viktig å være oppmerksom på sammensetningen av kulturmediene som brukes og forstå hvordan det kan påvirke mitokondriefunksjonen.

En annen viktig og universell begrensning i tolkningen av mitokondriell funksjon er potensialet for forskjeller i antall mitokondrier. Det er derfor kritisk å måle mitokondrieinnholdet gjennom enten kvantifisering av mtDNA33, måling av mitokondriemasse med membranpotensial-ufølsomme fargestoffer34, eller vestlig blotting av mitokondriemarkører. Dette er en kritisk kontroll, slik at en reduksjon i antall mitokondrier ikke forveksles med en reduksjon i mitokondriell funksjon.

Det er også spesifikke begrensninger og feilsøking som gjelder for analysene beskrevet her. For det første, gitt at differensierte celler ikke prolifererer, vil de proliferasjonsbaserte analysene ikke være nyttige for å vurdere mitokondriell funksjon i denne sammenhengen. En viktig begrensning i 13C 4-aspartatsporingsprotokollen for å måle DHODH-aktivitet er at aspartatopptak i celler kan være ekstremt ineffektivt35. For å overvinne denne potensielle begrensningen kan forskere overuttrykke aspartattransportøren, SLC1A3, for å lette 13C 4-aspartatopptak35.

En begrensning av protokollen ved bruk av 13C 5-glutaminsporing for å måle SDH-aktivitet er at denne analysen krever at celler bruker den reduktive karboksyleringsveien for å berike M + 3-isotopologene for å måle omvendt aktivitet. Noen cellelinjer er ikke i stand til reduktiv karboksyleringsfluks på grunn av lavt ATP-citratlyaseuttrykk36, utilstrekkelig HIF-stabilisering 37 eller et α-KG: citratforhold som er for lavt38. For å overvinne denne begrensningen kunne man bruke 13C 4-aspartatsporing for å måle SDH fremover og revers aktiviteter7. I denne analysen kan SDH forward-aktiviteten måles ved forholdet mellom fumarat M + 2: succinate M + 2 og omvendt reaksjon ved succinat M + 4: fumarat M + 4. Spesielt omgår denne sporingen de fleste enzymene i den reduktive karboksyleringsveien.

En begrensning av den komplekse I-aktivitetsanalysen ved bruk av DCPIP-reduksjon som avlesning er at mitokondriene ikke er strukturelt intakte. Prosessen med frysetining av mitokondriene for å muliggjøre deres NADH-opptak for analysen, kan sikkert anløpe den strukturelle integriteten til mitokondriemembranen39. Denne analysen bør utføres parallelt med analyser som den komplekse I-proliferasjonsanalysen for å sikre at endringene i kompleks I-aktivitet observert også er sanne med intakte celler.

I fremtidige studier kan noen av disse teknikkene tilpasses for å måle mitokondrielle funksjoner in vivo ved hjelp av modellorganismer som mus og Caenorhabditis elegans. De nåværende metodene som brukes til å måle mitokondriell funksjon in vivo er sentrert på OCR på organismenivå, spesielt respiratorisk utvekslingshastighet ved bruk av musemodeller. En klar begrensning av denne metoden er at oksygen tjener mange biokjemiske og signalfunksjoner utover sin rolle som en allestedsnærværende terminal elektronakseptor i mitokondriell ETC. For eksempel blir oksygen "forbrukt" av den katalytiske aktiviteten til enzymer i dioksygenasefamilien. Selv om disse enzymene bidrar til det cellulære oksygenforbruket, deltar de ikke i, regulerer eller reflekterer mitokondriell funksjon. Klassiske respirometrieksperimenter in vitro kontrollerer vanligvis for "ikke-mitokondriell OCR", mens eksperimenter med organisatorisk respiratorisk utveksling (RER) ikke kan kontrollere for dette, og begrenser tolkningen av RER som en metrisk for mitokondriell funksjon in vivo. Imidlertid er det mulig å tilpasse protokollene for å måle DHODH-aktivitet via 13 C 4-aspartatsporing, kompleks II-aktivitet via 13C5-glutaminsporing, kompleks I-aktivitet på mitokondrier renset fra vev og mitokondriell ROS ved bruk av LC-MS-vennlige forbindelser som MitoB for å måle mitokondriefunksjon in vivo . Disse direkte analysene for å undersøke mitokondrielle funksjoner, i kombinasjon med klassiske respirometrieksperimenter, gir forskere en mer omfattende og nøyaktig vurdering av mitokondriell funksjon i pattedyrceller og vev.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å rapportere.

Acknowledgments

Figurene som produseres i dette manuskriptet ble laget med BioRender.com. Vi er takknemlige for at Amy Walker gir tilbakemelding på denne artikkelen. J.B.S. ble støttet av Worcester Foundation for Biomedical Research Grant.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 1.5 mL tube Cell Treat 667443
2.0 mL tube Cell Treat 229446
6-well plate Cell Treat 229106
12-well plate Cell Treat 229112
13C4-aspartate Sigma-Aldrich 604852
13C5-Glutamine Cambridge Isotope Laboratories 285978-14-5
15 mL centrifuge tube Cell Treat 667411
50 mL centrifuge tube Cell Treat 667421
150 mm tissue culture dish Cell Treat 229651
1x Phosphate-buffered saline Gibco 10010049
2,6-dichlorophenolindophenol Honeywell 33125
Ammonium Carbonate Sigma-Aldrich 37999
Antimycin Sigma-Aldrich A8674
Ascentis Express C18 Sigma-Aldrich 53825-U
Bottle top filter 500 mL, 0.22 µm, PES 9 9 mm membrane diameter Cell Treat 229717
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A3294
Brequinar Sigma-Aldrich SML0113
Cell Lifter, Double End Flat and Narrow Blade Cell Treat 229305
CentriVap -105 Cold Trap Labconco 7385020
Complete Protease Inhibitor Tablets Sigma-Aldrich  4693116001
Coulter Counter Cups Fisher Scientific 07-000-694
Decylubiquinone Sigma-Aldrich D7911
DMSO Invitrogen D12345
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11995-065
EDTA Sigma-Aldrich E6758
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Eppendorf Centrifuge 5425R Eppendorf 2231000908
Eppendorf Centrifuge 5910 Ri Eppendorf 5943000343
Galactose Sigma-Aldrich G5388
Glucose Sigma-Aldrich G7021
Glucose-free DMEM Gibco 11966025
Glutamine-free DMEM Thermo Fisher 11960044
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F4135
Hepes Sigma-Aldrich H3375
HPLC-grade 35% Ammonium hydroxide Thermo Scientific 460801000
HPLC-grade Acetonitrile Sigma-Aldrich 900667
HPLC-grade Chloroform Sigma-Aldrich 366927
HPLC-grade formic acid Thermo Scientific 28905
HPLC-grade Isopropanol Sigma-Aldrich 563935
HPLC-grade MeOH Sigma-Aldrich 900688
HPLC-grade Water Sigma-Aldrich 270733
Human Osteosarcome Cell Line 143B ATCC CRL-8303
Hydrochloric Acid Sigma-Aldrich 320331-500ML
Isotone buffer Beckman Coulter 8546719
K2HPO4 Sigma-Aldrich P2222
Mannitol Sigma-Aldrich M4125
MitoSox Red Invitrogen M36008
N-acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich A9165
Oligomycin Sigma-Aldrich 75351-5MG
Pencillin Streptomycin Gibco 15140-122
Potter-Elvehjem Tissue Grinder, Size 21 Kimble 885502-0021
Pyruvate Sigma-Aldrich P5280
Pyruvate-free DMEM media Gibco 11965175
Q Exactive Plus Mass Spectrometer Thermo Scientific 726030
ReCO2ver Incubator Baker
Refrigerated Centrivap Benchtop Vacuum Concentrator Labconco 7310020
RIPA Buffer Millipore Sigma 20188
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
SeQuant ZIC-pHILIC 5μm 150 x 2.1 mm analytical column Sigma-Aldrich 1.50460.0001
SeQuant ZIC-pHILIC guard kit Millipore Sigma 1.50438.0001
Sodium Hydroxide, Pellets Millipore Sigma 567530-250GM
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
SW, TRACEFINDER 5.1 SP3 Thermo Scientific OPTON-31001
Tert-butyl hydroperoxide solution Sigma-Aldrich 458139
Tris Sigma-Aldrich 93352
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco 25-200-114
Uridine Sigma-Aldrich U3003
VANQUISH HORIZON / FLEX HPLC Thermo Scientific VF-S01-A-02
Z2 Coulter Particle count and size analyzer Beckman Coulter BZ10131270

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews Disease Primers. 2, 16080 (2016).
  3. Chandel, N. S., et al. Reactive oxygen species generated at mitochondrial complex III stabilize hypoxia-inducible factor-1alpha during hypoxia: A mechanism of O2 sensing. Journal of Biological Chemistry. 275 (33), 25130-25138 (2000).
  4. Cadenas, E., Boveris, A., Ragan, C. I., Stoppani, A. O. M. Production of superoxide radicals and hydrogen peroxide by NADH-ubiquinone reductase and ubiquinol-cytochrome C reductase from beef-heart mitochondria. Archives of Biochemistry and Biophysics. 180 (2), 248-257 (1977).
  5. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochemical Journal. 417 (1), 1-13 (2009).
  6. Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
  7. Spinelli, J. B., et al. Fumarate is a terminal electron acceptor in the mammalian electron transport chain. Science. 374 (6572), 1227-1237 (2021).
  8. Kumar, R., et al. A redox cycle with complex II prioritizes sulfide quinone oxidoreductase-dependent H(2)S oxidation. Journal of Biological Chemistry. 298 (1), 101435 (2022).
  9. Warburg, O., Geissler, A. W., Lorenz, S. On growth of cancer cells in media in which glucose is replaced by galactose. Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physiologische Chemie. 348 (12), 1686-1687 (1967).
  10. Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants. Toxicological Sciences. 97 (2), 539-547 (2007).
  11. Attardi, G., King, M. P. Human cells lacking mtDNA: Repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
  12. Bodnar, A. G., Cooper, M., Leonard, J. V., Schapira, A. H. Respiratory-deficient human fibroblasts exhibiting defective mitochondrial DNA replication. Biochemical Journal. 305, 817-822 (1995).
  13. Gregoire, M., Morais, R., Quilliam, M. A., Gravel, D. On auxotrophy for pyrimidines of respiration-deficient chick embryo cells. European Journal of Biochemistry. 142 (1), 49-55 (1984).
  14. Mackay, G. M., Zheng, L., vanden Broek, N. J., Gottlieb, E. Analysis of cell metabolism using LC-MS and isotope tracers. Methods in Enzymology. 561, 171-196 (2015).
  15. Heinrich, P., et al. Correcting for natural isotope abundance and tracer impurity in MS-, MS/MS- and high-resolution-multiple-tracer-data from stable isotope labeling experiments with IsoCorrectoR. Scientific Reports. 8 (1), 17910 (2018).
  16. Lee, P., Chandel, N. S., Simon, M. C. Cellular adaptation to hypoxia through hypoxia inducible factors and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (5), 268-283 (2020).
  17. Bisbach, C. M., et al. Succinate can shuttle reducing power from the hypoxic retina to the O(2)-rich pigment epithelium. Cell Reports. 31 (2), 107606 (2020).
  18. Angebault, C., et al. Idebenone increases mitochondrial complex I activity in fibroblasts from LHON patients while producing contradictory effects on respiration. BMC Research Notes. 4, 557 (2011).
  19. Liao, P. C., Bergamini, C., Fato, R., Pon, L. A., Pallotti, F. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Methods in Cell Biology. 155, 3-31 (2020).
  20. Iwai, T., et al. Sodium accumulation during ischemia induces mitochondrial damage in perfused rat hearts. Cardiovascular Research. 55 (1), 141-149 (2002).
  21. Murphy, E., Eisner, D. A. Regulation of intracellular and mitochondrial sodium in health and disease. Circulation Research. 104 (3), 292-303 (2009).
  22. Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. Isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue. Journal of Visualized Experiments. (97), e52076 (2015).
  23. Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nature Metabolism. 4 (6), 651-662 (2022).
  24. Xiao, Y., Meierhofer, D. Are hydroethidine-based probes reliable for reactive oxygen species detection. Antioxidants and Redox Signaling. 31 (4), 359-367 (2019).
  25. DeBerardinis, R. J., et al. Beyond aerobic glycolysis: Transformed cells can engage in glutamine metabolism that exceeds the requirement for protein and nucleotide synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19345-19350 (2007).
  26. Keeley, T. P., Mann, G. E. Defining physiological normoxia for improved translation of cell physiology to animal models and humans. Physiological Reviews. 99 (1), 161-234 (2019).
  27. Ast, T., Mootha, V. K. Oxygen and mammalian cell culture: Are we repeating the experiment of Dr. Ox. Nature Metabolism. 1 (9), 858-860 (2019).
  28. Gu, C., Jun, J. C. Does hypoxia decrease the metabolic rate. Frontiers in Endocrinology. 9, 668 (2018).
  29. Voorde, J., et al. Improving the metabolic fidelity of cancer models with a physiological cell culture medium. Scientific Advances. 5 (1), 7314 (2019).
  30. Cantor, J. R., et al. Physiologic medium rewires cellular metabolism and reveals uric acid as an endogenous inhibitor of UMP synthase. Cell. 169 (2), 258-272 (2017).
  31. MacPherson, S., et al. Clinically relevant T cell expansion media activate distinct metabolic programs uncoupled from cellular function. Molecular Therapy. Methods and Clinical Development. 24, 380-393 (2022).
  32. Torres-Quesada, O., Doerrier, C., Strich, S., Gnaiger, E., Stefan, E. Physiological cell culture media tune mitochondrial bioenergetics and drug sensitivity in cancer cell models. Cancers. 14 (16), 3917 (2022).
  33. Chan, S. W., Chen, J. Z. Measuring mtDNA damage using a supercoiling-sensitive qPCR approach. Methods in Molecular Biology. 554, 183-197 (2009).
  34. Doherty, E., Perl, A. Measurement of mitochondrial mass by flow cytometry during oxidative stress. Reactive Oxygen Species. 4 (10), 275-283 (2017).
  35. Birsoy, K., et al. An essential role of the mitochondrial electron transport chain in cell proliferation is to enable aspartate synthesis. Cell. 162 (3), 540-551 (2015).
  36. Beigneux, A. P., et al. ATP-citrate lyase deficiency in the mouse. Journal of Biological Chemistry. 279 (10), 9557-9564 (2004).
  37. Gameiro, P. A., et al. In vivo HIF-mediated reductive carboxylation is regulated by citrate levels and sensitizes VHL-deficient cells to glutamine deprivation. Cell Metabolism. 17 (3), 372-385 (2013).
  38. Fendt, S. M., et al. Reductive glutamine metabolism is a function of the alpha-ketoglutarate to citrate ratio in cells. Nature Communications. 4, 2236 (2013).
  39. Lee, C. P. Biochemical studies of isolated mitochondria from normal and diseased tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 1271 (1), 21-28 (1995).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 195
Oksygenuavhengige analyser for å måle mitokondriefunksjon hos pattedyr
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tseyang, T., Valeros, J., Vo, P.,… More

Tseyang, T., Valeros, J., Vo, P., Spinelli, J. B. Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals. J. Vis. Exp. (195), e65184, doi:10.3791/65184 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter