Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Memelilerde Mitokondriyal Fonksiyonu Ölçmek için Oksijenden Bağımsız Tahliller

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/65184
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1,2
1Program in Molecular Medicine, University of Massachusetts Chan Medical School, 2Cancer Center, University of Massachusetts Chan Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Burada, memeli hücrelerinde moleküler oksijen tüketme yeteneklerinden bağımsız olarak mitokondriyal fonksiyonu doğrudan ölçmek için bir tahlil derlemesi sunuyoruz.

Abstract

Mitokondriyal elektron taşıma zincirindeki (ETC) elektronların akışı, memeli hücrelerinde çok yönlü biyosentetik, biyoenerjik ve sinyal fonksiyonlarını destekler. Oksijen (O2), memeli ETC için en yaygın terminal elektron alıcısı olduğundan,O2 tüketim oranı sıklıkla mitokondriyal fonksiyon için bir vekil olarak kullanılır. Bununla birlikte, ortaya çıkan araştırmalar, bu parametrenin her zaman mitokondriyal fonksiyonun göstergesi olmadığını göstermektedir, çünkü fumarat hipokside mitokondriyal fonksiyonları sürdürmek için alternatif bir elektron alıcısı olarak kullanılabilir. Bu makale, araştırmacıların mitokondriyal fonksiyonuO2 tüketim oranından bağımsız olarak ölçmelerini sağlayan bir dizi protokolü derlemektedir. Bu testler, hipoksik ortamlarda mitokondriyal fonksiyonu incelerken özellikle yararlıdır. Spesifik olarak, mitokondriyal ATP üretimini, de novo pirimidin biyosentezini, kompleks I ile NADH oksidasyonunu ve süperoksit üretimini ölçmek için yöntemler açıklıyoruz. Klasik respirometri deneyleriyle birlikte, bu ortogonal ve ekonomik testler, araştırmacılara ilgi sistemlerindeki mitokondriyal fonksiyonun daha kapsamlı bir değerlendirmesini sağlayacaktır.

Introduction

Mitokondriyal fonksiyon, memeli hücrelerinde anahtar biyosentetik, biyoenerjik ve sinyal fonksiyonlarını sürdürdüğü için hücresel sağlığın kritik bir metriğidir1. Mitokondriyal fonksiyonların büyük çoğunluğu elektron taşıma zinciri (ETC) boyunca elektron akışı gerektirir ve ETM'deki elektron akışındaki bozulmalar ciddi mitokondriyal hastalığa neden olur2. ETC, iç mitokondriyal membrana gömülü bir dizi indirgeme ve oksidasyon (redoks) reaksiyonundan oluşur ve bu elektron transfer reaksiyonları, ATP sentezini, termojenez gibi fizyolojik süreçleri, de novo pirimidin biyosentezi gibi biyosentetik yolları ve NADH gibi ko-faktörlerin redoks durumunun dengesini desteklemek için kullanılabilecek serbest enerjiyi serbest bırakır. ETC kompleksi I ve III, sırayla HIF, PI3K, NRF2, NFκB ve MAPK6 gibi sinyal anahtar yollarını düzenleyen reaktif oksijen türleri (ROS) 3,4,5 üretir. Sonuç olarak, ETM'deki elektron akışı ölçümleri klasik olarak memeli hücrelerinde mitokondriyal fonksiyon için bir vekil olarak kullanılır.

Respirometri deneyleri, memeli hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonu ölçmek için sıklıkla kullanılır. O2, memeli ETC için en yaygın terminal elektron alıcısı olduğundan, indirgenmesi mitokondriyal fonksiyon için bir vekil olarak kullanılır. Bununla birlikte, ortaya çıkan kanıtlar, memeli mitokondrilerinin, de novo pirimidin biyosentezi 7, NADH oksidasyonu7 ve hidrojen sülfür8'in detoksifikasyonu dahil olmak üzere ETC'ye bağlı mitokondriyal fonksiyonları sürdürmek için bir elektron alıcısı olarak fumaratı kullanabileceğini göstermektedir. Bu nedenle, belirli bağlamlarda, özellikle hipoksik ortamlarda,O2 tüketim oranının (OCR) ölçümleri, mitokondriyal fonksiyonun kesin veya doğru bir göstergesini sağlamaz.

Burada, OCR'den bağımsız olarak mitokondriyal fonksiyonu ölçmek için kullanılabilecek bir dizi tahlili özetliyoruz. Kompleks I-aracılı NADH oksidasyonunu, dihidroorotat dehidrogenaz aracılı de novo pirimidin biyosentezini, kompleks V-bağımlı ATP sentezini, süksinat dehidrogenaz (SDH) kompleksinin net yönlülüğünü ve mitokondriyal kaynaklı ROS'u doğrudan ölçmek için tahliller sunuyoruz. Bu testlerin kültürlü memeli hücreleri üzerinde yapılması amaçlanmıştır, ancak birçoğu in vivo mitokondriyal fonksiyonları incelemek için uyarlanabilir.Özellikle, bu protokolde açıklanan tahliller, mitokondriyal fonksiyonların OCR'den daha doğrudan ölçümleridir. Dahası, OCR'nin gösterge niteliğinde bir ölçüm olmadığı bir bağlam olan hipokside mitokondriyal fonksiyonun ölçülmesini sağlarlar. Birlikte ele alındığında, bu testler, klasik respirometri deneyleri ile birlikte, araştırmacılara memeli hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonun daha kapsamlı bir değerlendirmesini sağlayacaktır.

Protocol

1. Kompleks I, dihidroorotat dehidrogenaz (DHODH) ve kompleks V aktivitelerinin aktivitesini ölçmek için proliferasyon testleri

  1. Proliferasyon tahlilleri için hücrelerin tohumlanması
    NOT: Bu protokol, ATCC'den ticari olarak satın alınan insan osteosarkom hücre hattı 143B'yi kullanır. Bu hücre hattı, onaylı Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBC) protokolümüzün yönergeleri altında kullanılmıştır.
    1. Plakaları doku kültürü inkübatöründen çıkarın. Ortamı plakalardan aspire edin ve kalan ortamları çıkarmak için 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. PBS'yi aspire edin ve hücreleri plakanın altından kaldırmak için çanağı% 0.05 -% 0.25 tripsin ile örtün.
    2. Tripsinin hücreleri plakadan serbest bırakması için 3-5 dakika bekleyin ve daha sonra tripsini% 10 fetal sığır serumu (FBS) içeren istenen büyüme ortamının 10 mL'si ile söndürün.
    3. Hücreleri konik bir tüpte toplayın ve hücreleri pelet etmek için 5 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüjleyin.
    4. Peletleri rahatsız etmeden ortamı tüpten aspire edin. Pelet tam ortamla tekrar askıya alın.
    5. Hücreleri sayın ve 6 delikli bir plakada 10.000 ila 25.000 hücre arasında tohum atmak için gereken hacmi ölçün.
      NOT: Her hücre satırının, tohumlanacak hücre sayısı için optimize edilmesi gerekir. Elde edilen ideal birleşim, deneyin başlangıcında ~%10 ve deneyin sonunda ~%80'dir.
    6. Hücreleri 6 delikli bir plakaya pipetleyin ve kuyucuklara 2 mL tam ortam ekleyin. Deneysel ortam koşullarına geçmeden önce 24 saat bekletin.
      NOT: Tohum, koşul başına en az üç kopya ve tedavi edilmemiş kontrol koşulunu, inhibitörle tedavi edilmiş kontrol koşulunu, tedavi edilmemiş deneysel durumu ve inhibitörle muamele edilmiş deneysel durumu test etmek için yeterli kuyucuk içerir.
  2. Proliferasyon yoluyla karmaşık V aktivitesini değerlendirmek için orta değişim
    NOT: Galaktozlu bir ortamda çoğalan hücreler, ATP sentezi 9,10 için kompleks V aktivitesine bağlıdır. Glikolizden net iki ATP veren glikozun aksine, galaktoz hiç vermez ve hücreleri ATP sentezi için kompleks V'ye bağımlı olmaya zorlar (Şekil 1). Kompleks V inhibitörü oligomisin kontrol olarak kullanılır.
    1. 10 mM glikoz içeren ortam yapın (bkz. Tablo 1).
    2. 10 mM galaktoz içeren ortam yapın (bkz. Tablo 1).
    3. Her bir kuyucuktaki ortamı glikoz içeren DMEM veya galaktoz içeren DMEM olarak değiştirin. İlgili kuyucuklara 5 μM oligomisin (kompleks V inhibitörü) ve tedavi edilmemiş kuyucuklara aynı miktarda DMSO ekleyin. Oligomisin stoğu DMSO'da askıya alınmış 10 mM'dir. Plakayı 2 gün boyunca doku kültürü inkübatörüne geri koyun.
  3. Karmaşık I aktivitesini proliferasyon yoluyla değerlendirmek için orta değişim
    NOT: Piruvat içermeyen bir ortamda çoğalan hücreler, kompleks I aktivitesine daha fazla bağımlıdır11,12. Piruvat olmadan, kültürlenmiş hücreler NADH reoksidasyonunun çoğunluğunu NAD + 'ya geri döndürmek için kompleks I'e ihtiyaç duyarlar (Şekil 2). Kompleks I inhibitörü rotenon bir kontrol olarak kullanılır.
    1. % 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş piruvat içermeyen DMEM ortamı yapın.
    2. 1 M'lik bir piruvat çözeltisi yapın (bkz. Tablo 1).
    3. Her bir kuyucuktaki ortamı piruvat içermeyen ortam veya piruvat içeren ortam olarak değiştirin. Tedavi edilen kuyucuklara 2 μM rotenon (kompleks I inhibitörü) ve tedavi edilmemiş kuyucuklara aynı miktarda DMSO ekleyin. Rotenon stoğu DMSO'da 25 mM'dir. Plakayı 2 gün boyunca doku kültürü inkübatörüne geri koyun.
  4. DHODH aktivitesini proliferasyon ile değerlendirmek için orta değişim
    NOT: İdrar içermeyen bir ortamda çoğalan hücreler dihidroorotat dehidrogenaz (DHODH) aktivitesi gerektirir11,12,13. Eksojen idrarın yokluğunda, kültürlenmiş hücreler de novo yol boyunca pirimidinler sentezler. DHODH inhibitörü brequinar kontrol olarak kullanılır.
    1. İdrar içermeyen DMEM'i% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin ile takviye edin.
    2. 10 mg / mL idrar stok çözeltisi yapın ve ardından 100 μg / mL idrar ortamı hazırlayın ( bkz. Tablo 1).
    3. Her bir kuyucuktaki ortamı idrarsız ortama veya idrar içeren ortama değiştirin. Tedavi edilen kuyucuklara 5 μM brequinar (DHODH inhibitörü) ve tedavi edilmemiş kuyucuklara aynı miktarda DMSO ekleyin. Brequinar stoğu DMSO'da 10 mM'dir. Plakayı 2 gün boyunca doku kültürü inkübatörüne geri koyun.
  5. Proliferasyon tahlilleri için hücrelerin sayılması
    1. Tüm deneyler için, ortamı her 2 günde bir doldurun. Ortamın rengi sarı olursa, ortam değişikliklerinin sıklığını artırın. Hücrelerin 7 güne kadar çoğalmasına izin verin ve kuyucuklardan herhangi biri aşırı büyümüş görünmeye başlarsa deneyi durdurun. Kuyular, birleşme% 80'i aştığında aşırı büyümüş olarak kabul edilir.
    2. Ortamı aspire edin, 1x PBS ile yıkayın ve kuyunun dibini% 0.25 tripsin ile örtün (6 delikli bir tabak için 500 μL).
    3. Hücreler çanaktan çıkana kadar 5 dakika bekleyin. Bunu mikroskop altında kontrol edin.
    4. Tripsini% 10 FBS içeren 1 mL tam DMEM ile söndürün.
    5. Hücre kümelerini parçalamak için pipeti yukarı ve aşağı çekin.
    6. Her birini 10 mL izoton tamponu (kuyucuk başına bir bardak) ile doldurarak Coulter sayaç kaplarını hazırlayın. Bir hücre sayacındaki hücreleri sayın ve verileri kaydedin. Okuma mililitre başına hücre (hücre/mL) ise, kuyu başına toplam hücre sayısını elde etmek için kaydedilen değeri 1,5 ile çarpın.
      NOT: Hemositometre gibi diğer hücre sayma yöntemleri, laboratuvarda Coulter sayacı yoksa yeterli olacaktır.

2. DHODH aktivitesini ölçmek için 13C 4-Aspartat kararlı izotop izleme ve LC-MS analizi

  1. 13C4-yapışkan hücrelerde 4-aspartat kararlı izotop izleme
    NOT: DHODH aktivitesi, 13 C 4-aspartatın 13C 3-UMP'ye dahil edilmesi ölçülerek doğrudan izlenebilir. Brequinar, DHODH aktivitesi için bir kontrol olarak kullanılır (Şekil 3). Ortaya çıkan 13C3-UMP seviyeleri, DHODH aktivitesinin bir ölçüsüdür.
    1. Ertesi gün% 75 birleşme elde etmek için 6 kuyucuklu bir kapta 250.000 ila 500.000 hücre arasında tohumlayın.
    2. 250 mM 13 C 4-aspartat ve 10 mM 13C4-aspartat ortamından oluşan bir stok çözeltisi hazırlayın (bakınız Tablo 1).
    3. Her bir kuyucuktaki ortamı 10 mM 13C 4-aspartat içeren ortama değiştirin. İlgilenilen hücreleri etiketlemek için sabit bir durum elde etmek için uygun sayıda saat boyunca inkübe edin.
      NOT: Kararlı durum, yüzde etiketli metabolit platolarının zaman içinde14 olduğu zaman dilimi olarak tanımlanır. 143B osteosarkom hücreleri için, 13C 4-aspartat 8 saat boyunca kararlı bir duruma ulaşır. Bu zaman dilimini, deneyden önce, ilgilenilen kararlı izotop ile bir zaman kursu deneyi yaparak belirlemek en iyi uygulamadır.
  2. Yapışkan hücrelerden metabolit izolasyonu
    1. Başlamadan önce, bir kova kuru buz hazırlayın ve HPLC sınıfı suda% 80 HPLC sınıfı MeOH hazırlayın. Bu tamponu gece boyunca -80 ° C'lik bir dondurucuda soğutun veya doğrudan kuru buzun üzerine yerleştirin.
    2. İnkübatörden bir seferde bir plaka çıkararak, ortamı kuyucuklardan aspire edin ve 1x PBS ile 2x yıkayın. Bir sonraki adıma geçmeden önce kalan tüm PBS'yi kuyucuklardan çıkarın.
      NOT: Aspirasyon sırasında plakayı ve pipeti kabın duvarına yaslayarak yapışkan hücrelerin bozulmasını önleyin.
    3. Plakayı kuru buz üzerine yerleştirin ve hemen her bir kuyucuğa% 20 LCMS dereceli suya 800 μL% 80 LCMS sınıfı MeOH ekleyin.
    4. Hücre lizizini kolaylaştırmak için plakayı -80 ° C'lik bir dondurucuda en az 15 dakika inkübe edin.
      NOT: Bu noktada, bir sonraki plaka inkübatörden çıkarılabilir ve 2.2.1-2.2.4 adımları tekrarlanabilir. Tüm plakalar -80 ° C dondurucuda inkübe edilene kadar buna devam edin.
    5. Dondurucudan bir seferde bir plaka çıkararak, bir hücre kaldırıcı kullanarak kuru buz üzerinde her bir kuyucuğu kazıyın ve lizatı 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bir sonraki adıma kadar tüpü kuru buz üzerinde tutun.
    6. Tüm tüpleri 4 ° C'de 10 dakika boyunca vorteks edin ve daha sonra maksimum hızda (en az 17.000 × g) 10 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj yapın.
    7. Süpernatantı 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve yaklaşık 6 saat boyunca veya numuneler buharlaşana kadar yüksek vakum ayarında -105 ° C soğuk tuzak ile donatılmış 4 ° C'lik bir vakum yoğunlaştırıcısında kurutun. Lizat kuruduktan sonra, metabolit peletlerini kütle spektrometrisi (LCMS) ile eşleştirilmiş sıvı kromatografisine hazırlamaya hazır olana kadar -80 ° C'de saklayın.
  3. Polar metabolitlerin sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi (LC-MS) ölçümü
    NOT: Aspartatın, de novo pirimidin biyosentezindeki ara ürünlerin ve UMP'nin tespitine izin veren herhangi bir kromatografik ve kütle spektrometresi iş akışı yeterli olacaktır14.
    1. Kurutulmuş peletlere ve vortekse 4 °C'de 10 dakika boyunca 100 μL HPLC sınıfı su ekleyerek buz üzerinde LCMS için numuneleri hazırlayın.
    2. Numuneleri 4 °C'de maksimum hızda (en az 17.000 × g) 10 dakika boyunca santrifüj edin ve her LC-MS şişesine 25 μL hareket ettirin.
    3. LC-MS sistemine 2 μL lizat enjekte edin. Yaygın olarak kullanılan bir metodoloji aşağıda verilmiştir:
      1. LC-MS sınıfı suda çözünmüş 20 mM amonyum karbonat (LC-MS sınıfı) ve% 0.1 amonyum hidroksit (LC-MS Sınıfı) içeren mobil faz A'yı hazırlayın.
      2. Mobil faz B olarak %100 asetonitril (LC-MS Sınıfı) seçin.
      3. Kromatografi için, hidrofilik bileşikler için 2,1 mm x 20 mm koruma sütunu ile donatılmış 5 μm, 150 mm x 2,1 mm analitik bir sütun seçin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Kolonlu fırını 25 °C'ye ayarlayın.
      4. Aşağıdaki sıvı kromatografisi ayarlarını kullanın: 0,15 mL/dak sabit akış hızı; 20 dakika boyunca %80 ila %20 Mobil Faz B arasında doğrusal bir gradyan, ardından 0,5 dakika boyunca %20 ila %80 Mobil Faz B'de doğrusal bir gradyan ve ardından 7,5 dakika boyunca %80 Mobil Faz B'de bir bekletme takip eder.
      5. Aşağıdaki kütle spektrometre ayarlarını seçin: m/z 70 Da ile 1.000 Da arasında tam tarama; 70.000'lik bir karar; 1 × 106 AGC hedefi; ve maksimum 20 ms enjeksiyon süresi. Kaynağı polarite anahtarlama modunda çalıştırın. Püskürtme voltajını 3,0 kV'a, ısıtılmış kılcal damarı 275 °C'ye, HESI probunu 350 °C'ye, kılıf gazı akışını 40 üniteye, yardımcı gaz akışını 15 üniteye ve süpürme gazı akışını 1 üniteye ayarlayın.
    4. LCMS iş akışıyla arabirim oluşturan herhangi bir yazılımı kullanarak veri analizini gerçekleştirin.
      NOT: Yukarıdaki iş akışıyla kullanılan yazılımlar XCalibur (Thermo) ve TraceFinder'dır (Thermo). Veri analizi için dikkat edilmesi gereken önemli noktalar aşağıda özetlenmiştir:
      1. Beklenen saklama süreleri: Deneyden önce kromatografik yöntemi kullanarak ilgilenilen her metabolit için standartları çalıştırarak her metabolitin tutma süresini belirleyin.
        NOT: UMP ve 13C3-UMP dahil izotopologlarının tutma süreleri tamamen aynıdır.
      2. Metabolitler için beklenen M/Z: Bir metabolit negatif iyon modunda iyonlaşırsa (UMP gibi), UMP eksi bir protonun moleküler formülünü kullanarak beklenen tam kütleyi hesaplayın [C 9 H14N2O9P]. Pozitif iyon modunda iyonlaşan metabolitler için, moleküler formülü ve bir protonu kullanarak tam kütleyi hesaplayın.
      3. Kütle doğruluğu: Bir orbitrap kütle spektrometresi kullanıldığında, ilgilenilen metabolitin ve izotopologlarının kütle doğruluğunun ±5 mmu olması beklenir. Beklenen M/Z'yi ve algılanan gerçek M/Z'yi hesaba katarak bunu hesaplamak için yazılım kullanın.
      4. Doğal bolluk düzeltmesi: Tüm izleme verilerinin, doğadaki ~% 1 13C ve ~% 0.5 15N-izotoplarını hesaba katmak için doğal bolluk düzeltmesinden geçmesi beklenir.

3. SDH aktivitesini ölçmek için 13C 5-glutamin kararlı izotop izleme

  1. 13Yapışkan hücrelerde C5-glutamin kararlı izotop izleme
    NOT: SDH aktivitesi, fumarat ve süksinatın belirli izotopologlarının 13 C 5-glutamin izleme 7,16,17 üzerine karşılıklı dönüşümü ölçülerek doğrudan izlenebilir. Kompleks III inhibitörü antimisin, SDH kompleksinin net yönlülüğünü değiştirmek için bir kontrol olarak kullanılır (Şekil 4).
    1. Ertesi gün% 75 birleşme elde etmek için 6 kuyucuklu bir kapta 250.000 ila 500.000 hücre arasında tohumlayın.
    2. 50 mM, 13C, 5-glutamin stoğu hazırlayın (bakınız Tablo 1).
    3. 2 mM, 13C, 5-glutamin içeren izleme ortamı hazırlayın (bkz. Tablo 1).
    4. Her bir kuyucuktaki ortamı 2 mM, 13C, 5-glutamin içeren ortama değiştirin. İlgilenilen hücreleri etiketlemenin sabit bir durumunu elde etmek için uygun sayıda saat boyunca inkübe edin (adım 2.1.3'teki nota bakın).
    5. Adım 2.2'deki protokolü izleyerek metabolitleri izole edin.
    6. Adım 2.3'te açıklanan iş akışını izleyerek LC-MS üzerindeki örnekleri analiz edin.
  2. SDH aktivitesini etiketleme desenlerine göre analiz etme
    NOT: SDH kompleksinin süksinat oksidasyon aktivitesi, 13 C 5-glutamin izlemesinde 13 C 4-fumaratın 13C 4-süksinat oranı değerlendirilerek izlenebilir. SDH kompleksinin fumarat indirgeme aktivitesi, 13 C 5-glutamin izlemesinde 13 C 3-süksinatın 13C 3-fumarat oranı değerlendirilerek izlenebilir.
    1. 13C 3-fumarat, 13 C 4-fumarat, 13 C3-süksinat ve 13C 4-süksinat yüzde etiketlemesini hesaplayın. Örneğin, 13 C 3-fumarat yüzdesini belirlemek için, fumarat izotopologları için tüm entegre tepe alanlarını toplayın (etiketsiz fumarat, 13 C 1-fumarat, 13 C 2-fumarat, 13 C 3-fumarat ve 13 C4-fumarat) ve 13C 3-fumarat için tepe alanını toplam izotopolog alanına bölün. 100 ile çarpın.
    2. Süksinat oksidasyonunu hesaplamak için, yüzde 13 C 4-fumaratı yüzde 13C4-süksinat yüzdesine bölün.
    3. Fumarat azalmasını hesaplamak için, yüzde13 C 3-süksinat yüzdesini yüzde 13C3-fumarat ile bölün.

4. Doğrudan kompleks I aktivite testi

NOT: DCPIP yapay bir elektron alıcısıdır; ubikinolden elektronları kabul ederken indirgenmiş formuna dönüşür. Bu tahlilde, ubikinon, NADH'nin NAD + 'ya karmaşık I-aracılı oksidasyonu yoluyla ubikinol'e indirgenir. Bu nedenle, bu hücresiz tahlilde oksitlenmiş DCPIP'in cirosunu ölçmek, kompleks I aktivitesi 7,18 için bir vekildir.

  1. Mitokondrinin hücrelerden saflaştırılması ve nicelleştirilmesi
    NOT: Bu tahlil19 için herhangi bir mitokondriyal saflaştırma protokolü kullanılabilir.
    1. 25-100 milyon hücre elde edilene kadar hücreleri genişletin. Ortamı bulaşıklardan aspire edin, 1x PBS ile yıkayın, PBS'yi aspire edin ve% 0.25 tripsin ile hücreleri deneyin. Tripsini kültür ortamı ile söndürün ve hücreleri 5 dakika boyunca 1.000 × g'da pelet edin.
    2. Hücre peletlerini 5 mL 1x PBS'de 2x yıkayın ve hücreleri pelet etmek için santrifüjlemeyi 5 dakika boyunca 1.000 × g'da tekrarlayın. Yıkanmış peletleri mitokondriyal saflaştırmaya kadar -20 ° C'lik bir dondurucuda saklayın.
      NOT: Hücre topaklarını bir kereden fazla dondurmayın-çözmeyin.
    3. Mitokondri izolasyon tamponunu hazırlayın (bkz. Tablo 1).
      NOT: NaOH gibi sodyum içeren reaktifler, mitokondri izolasyon tamponlarını hazırlamak için kullanılmamalıdır, çünkü sodyum mitokondriyal membran potansiyeli20'yi karartır ve mitokondriyal kalsiyum homeostazı21'i bozar.
    4. Hücre peletlerini 1 mL mitokondri izolasyon tamponu başına 10 milyon hücreye yeniden askıya alın. Örneğin, 10 mL mitokondri izolasyon tamponunda 100 milyon peletlenmiş hücreyi yeniden askıya alın.
      NOT: Arabelleğe kabarcıklar sokmadan hücre kümelerini bozduğunuzdan emin olun.
    5. 2 mL hücre süspansiyonunu, Potter-Elvehjem PTFE havanesiyle uyumlu 3-8 mL çalışma hacmine sahip önceden soğutulmuş bir cam homojenizatöre taşıyın. Hücreleri 10-20 vuruşla homojenize edin, homojenizasyon işlemi boyunca hücre lizizini doğrulamak için hücreleri mikroskop altında izleyin. Etkili hücre lizisi sağlamak için gerekirse inme sayısını artırın.
      NOT: Yukarıdaki yöntemle hücrelerin homojenize edilmesi, hücrelerin lize edilmesinde etkili değilse, bir şırınga lizis yöntemi22'ye geçin.
    6. Hücre lizatının 2 mL'sini buz üzerindeki bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve tüm hücre süspansiyonu homojenize edilene kadar yukarıdaki adımları tekrarlayın.
    7. Çekirdekleri ve hücre kalıntılarını 4 ° C'lik bir santrifüjde 10 dakika boyunca 650 × g'da peletleyin.
    8. Süpernatantı yeni bir 2,0 mL tüpe taşıyın ve yukarıdaki santrifüjlemeyi 650 × g'da 4 ° C'de 10 dakika boyunca tekrarlayın.
    9. Süpernatantı yeni bir 2.0 mL tüpe taşıyın ve ham mitokondrileri 4 ° C'lik bir santrifüjde 10 dakika boyunca 7.000 × g'da pelet edin.
    10. Süpernatanı atın ve peleti 1 mL mitokondri izolasyon tamponunda yeniden askıya alın. Protein ölçümü için 50 μL'yi yeni bir tüpe taşıyın. Yukarıdaki santrifüjleme adımını numunenin iki alikotunda tekrarlayın (50 μL numune ve kalan ~ 950 μL).
    11. Supernatanı atın ve peletleri kullanıma hazır olana kadar -80 ° C'lik bir dondurucuda saklayın.
    12. Proteini çıkarmak için 50 μL aliquot'tan peletlere 200 μL RIPA tamponu, 10 dakika boyunca vorteks ve proteini izole etmek için 21.000 × g'da santrifüj ekleyin. 50 μL aliquot'taki protein miktarını ölçün ve 950 μL numunede kalan proteini ölçmek için bu sayıyı kullanın. Örneğin, 50 μL aliquot için protein niceliği 1 μg / μL ise, kalan mitokondriyal peletteki toplam protein 950 μg'dir (1 μg / μL × 950 μL).
  2. Kompleks I aktivite testinin yapılması
    NOT: Bu test için 143B osteosarkom hücre hattı kullanılmıştır, ancak protokol herhangi bir kültürlü hücre için uyarlanabilir.
    1. Mitokondri resüspansiyon tamponunda saflaştırılmış mitokondrileri (bakınız Tablo 1) 5 mg protein / mL'lik nihai bir konsantrasyona yeniden askıya alın.
    2. Mitokondrileri geçirgenleştirmek için -20 ° C'lik bir dondurucuda beş dondurma / çözülme döngüsü gerçekleştirin.
    3. Karmaşık I aktivite tahlili tamponunu yapın (bkz. Tablo 1).
    4. 5 mg/mL mitokondri stoğunun 50 ug'unu 90 μL kompleks I aktivite tamponu ile karıştırın. Kompleks I aktivitesini kontrol etmek için beş işlenmemiş replika ve beş rotenon ile muamele edilmiş (5 μM) replika hazırlayın.
    5. 37 °C'ye ayarlanmış bir plaka okuyucuda 600 nm'de taban çizgisi absorbansını okuyun.
    6. 2 mM'lik son konsantrasyona NADH ekleyerek reaksiyonu başlatın ve 1 saatlik bir süre boyunca absorbansı (600 nm) izleyin, en az 2 dakikada bir ölçüm yapın. Absorbanstaki azalma, karmaşık I aktivitesi yoluyla DCPIP'in azaldığının göstergesidir.
      NOT: NADH, tüm numunelerin aynı anda başlatıldığından emin olmak için çok kanallı bir pipet kullanılarak eklenmelidir.

5. Süperoksit seviyelerini ölçmek için LC-MS bazlı tahlil

NOT: MitoSox Red'in floresan özellikleri, süperoksit23 ile reaksiyonundan bağımsız olarak değişebilir. Bu LC-MS bazlı tahlil, ürünü doğrudan MitoSox Red ile reaksiyona giren süperoksitten ölçer. Aşağıdaki tahlil Xiao ve ark.24'ten biraz değiştirilmiştir. 2-Hidroksi-mitoethidium (2-OH MitoE2+), süperoksit reaksiyonunun ürünüdür (Şekil 5). Bu test için Caki1 hücre hattı kullanılmıştır, ancak protokol herhangi bir kültürlü hücre için uyarlanabilir.

  1. Yapışkan hücrelerin MitoSox Red ile tedavisi
    1. Ertesi gün% 75 birleşme elde etmek için 6 kuyucuklu bir kapta 250.000 ila 500.000 hücre arasında tohumlayın. LC-MS testi için bir dizi plaka ve hücre sayımı normalizasyonu için bir dizi plaka tohumladığınızdan emin olun.
    2. Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyerinde% 10 ısı ile inaktive FBS ve% 1 penisilin-streptomisin içeren komple DMEM hazırlayın.
    3. Tüm kuyucuklardaki ortamı tüm koşullar için 2 mL tam DMEM ile yenileyin. Bu noktada ilgilendiğiniz ilaçları veya tedavileri eklediğinizden emin olun.
    4. Hücreleri 1 saat boyunca bir doku kültürü inkübatöründe inkübe edin.
    5. Pozitif ve negatif kontroller hazırlayın. PBS'de seyreltilmiş 50 mM'lik bir tert-bütil hidroperoksit stoğu ve DMSO'da seyreltilmiş 250 mM'lik bir N-asetil sistein (NAC) stoğu hazırlayın (bakınız Tablo 1).
      NOT: Tertbütil hidroperoksit (tBuOOH), pozitif bir kontrol görevi görecek ve 2-OH MitoE2 + miktarını artıracak güçlü bir reaktif oksijen türüdür. NAC, negatif bir kontrol görevi görecek ve tBuOOH'un neden olduğu süperoksit üretimini nötralize edecek güçlü bir antioksidandır.
    6. Pozitif kontrol kuyucuklarına 1 μL tBuOOH ve negatif kontrol kuyucuklarına 1 μL tBuOOH + 100 μL NAC ekleyin.
      NOT: P2 pipet (0,1-2 μL aralığı) kullanmak, 1 μL'yi aktarmanın en uygun yoludur.
    7. Bir doku kültürü inkübatöründe 1 saat inkübe edin.
    8. 1 mM MitoSox Kırmızı stoğu hazırlayın ( bakınız Tablo 1) ve 1 μM'lik nihai konsantrasyon elde etmek için her bir kuyucuğa 2 μL 1 mM MitoSox Kırmızısı ekleyin.
    9. Bu son inkübasyon sırasında, son LC-MS verilerini normalleştirmek için hücre sayımlarını elde etmek için yinelenen plakalardan birini sayın.
  2. Oksitlenmiş Mitosox Red ürününün yapışkan hücrelerden izolasyonu
    1. Bir kova kuru buz alın ve izolasyona başlamadan önce kuru buzun üzerine soğuk HPLC sınıfı izopropanol yerleştirin.
    2. Her seferinde bir plaka çıkararak, ortamı kuyucuklardan aspire edin ve 1 mL 1x PBS ile 2x yıkayın. Bir sonraki adıma geçmeden önce kuyulardan kalan tüm PBS'leri aspire edin.
      NOT: Aspirasyon sırasında plakayı ve pipeti kabın duvarına yasladığınızdan emin olun, böylece yapışkan hücrelerin bozulmasını önleyin.
    3. Plakayı kuru buz üzerine yerleştirin ve her bir oyuğa 800 μL HPLC sınıfı izopropanol ekleyin.
    4. Hücre lizizini kolaylaştırmak için plakayı -80 ° C'lik bir dondurucuda en az 15 dakika inkübe edin.
      NOT: Bu noktada, bir sonraki plaka inkübatörden çıkarılabilir ve 5.2.1-5.2.4 adımları tekrarlanabilir. Tüm plakalar -80 ° C dondurucuda inkübe edilene kadar buna devam edin.
    5. Dondurucudan bir seferde bir plaka çıkararak, bir hücre kaldırıcı kullanarak kuru buz üzerinde her bir kuyucuğu kazıyın ve lizatı 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bir sonraki adıma kadar tüpü kuru buz üzerinde tutun.
    6. Tüm tüpleri 4 ° C'de 10 dakika boyunca vorteks edin ve daha sonra maksimum hızda (en az 17.000 × g) 10 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj yapın.
    7. Süpernatantı 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve bir vakum konsantratöründe kurutun. Lizat kuruduktan sonra, metabolit peletlerini LC-MS için hazır olana kadar -80 ° C'de saklayın.
  3. MitoSox Kırmızı ve 2-hidroksi-mitoethidium LC-MS ölçümü (2-OH MitoE2+)
    1. HPLC sınıfı MeOH:kloroform:suyun 3:3:1 karışımından 100 μL ekleyerek buz üzerinde LCMS için numuneleri hazırlayın. 4 ° C'de 10 dakika boyunca vorteks.
    2. Her LC-MS şişesine 25 μL hareket ettirin. Kalan numuneyi -80 °C dondurucuda saklayın.
    3. Aşağıdaki sıvı kromatografi tamponlarını hazırlayın: i) tampon A:% 0.1 formik asit içeren HPLC sınıfı su; ii) tampon B: %0.1 formik asit içeren HPLC sınıfı asetonitril.
    4. Yöntemi geliştirmeye başlamak için Thermo XCalibur Instrument Setup uygulamasını açın.
    5. Bu pencerenin sol kenar çubuğunda iki kutu arayın - ilk kutu kromatografi yöntemi geliştirmeye izin verir ve ikinci kutu kütle spektrometri yöntemi geliştirmeye izin verir.
    6. Sıvı kromatografisi yöntemi geliştirme:
      1. 0,25 mL/dak'lık bir akış hızı ayarlayın ve yöntemi %20 B'de başlatın ve 12 dakikalık süre boyunca %95 B'ye yükselin. Bir sonraki dakika boyunca, arabellek B'yi %20 B'ye geri bırakın ve sonraki 2 dakika boyunca bu seviyeyi koruyun.
        NOT: %20 B'deki son 2 dakikalık akış, kolon basıncının başlangıç basıncına düşmesi ve kolonun uygun tampon oranlarıyla dengelenmesi için kritik öneme sahiptir. Bu dengeleme adımının dahil edilmemesi, daha sonra çalıştırılan tüm örnekler için bekletme sürelerinin değişmesine neden olur.
    7. Aşağıdaki parametrelerle bir Tune Dosyası oluşturun:
      1. Tune Uygulamasını açın ve yeni bir melodi dosyası oluşturun.
      2. Yöntem Kurulumu modülündeki çakışan ayarları (bkz. adım 5.3.9.3) tarama aralığı, çözünürlük, polarite, AGC hedefi ve maksimum BT dahil olmak üzere bu ayar dosyasına da uygulayın.
      3. Kılıf gazını 30'a, Aux gazını 3'e ve Süpürme gazını da 3'e ayarlayın. Püskürtme voltajını 3 kV'a, Kapiler sıcaklığı 300'e ve S-lens RF seviyesini 60'a ayarlayın.
    8. Kütle spektrometresi yöntemi geliştirme:
      1. Sol alttaki potansiyel taramalar listesinden, Full MS'i pencerenin ortasına sürükleyip bırakın. Ayarları yapmak için düşüşten sonra Tam MS karesine tıkladığınızdan emin olun. MS yönteminin toplam süresi 13 dakikadır.
        NOT: LC yöntemi MS yönteminden daha uzundur, çünkü son 2 dakika kolon yenileme içindir ve metabolit nicelleştirmesi için değildir.
      2. Modülün sağ tarafında, Yöntemin özellikleri altında, Yöntem süresi ve Çalışma süresi'nin 13,00 dakika olarak ayarlandığından emin olun.
      3. Bu tam taramayı pozitif modda 70.000 Çözünürlükte ve 1 × 106 AGC hedefinde çalıştırın. Maksimum BT'yi 100 ms'ye ve Tarama aralığını 300 m/z ile 700 m/z arasında ayarlayın.
      4. Modülün üst kısmındaki Dosyaları Ayarla altında, yeni oluşturulan ayar dosyasının bu yönteme bağlı olduğunu gözlemleyin.
    9. 2 μL numune enjeksiyonu ile MitoSox Red algılama yöntemini çalıştırın.

Representative Results

DHODH, kompleks I ve kompleks V'nin aktiviteleri proliferasyon testleri kullanılarak değerlendirilebilir. İdrarın kültür ortamından yoksun bırakılması üzerine, hücreler pirimidin biyosentezi için de novo yola daha bağımlı hale gelir. Bu nedenle, hücreler idrarsız bir ortamda çoğalmaya zorlandıklarında, DHODH aktivitesinin brequinar tarafından inhibe edilmesine, idrar içeren bir ortamda kültürlenen hücrelerden daha duyarlıydılar (Şekil 6A). Benzer şekilde, piruvatın kültür ortamından yoksun bırakılması, hücreleri çoğalma için karmaşık I aktivitesine daha bağımlı hale getirir. Bu nedenle, hücreler piruvat içermeyen bir ortamda çoğalmaya zorlandıklarında, rotenon tarafından kompleks I aktivitesinin inhibisyonuna, piruvat içeren bir ortamda kültürlenen hücrelerden daha duyarlıydılar (Şekil 6B). Kompleks V aktivitesi, hücrelerin glikoz yerine galaktoz içeren bir ortamda çoğalması için zorlanarak değerlendirilebilir. Galaktoz glikolizde net sıfır ATP verdiğinden, bu yakıtta büyüyen hücreler karmaşık V aktivitesi yoluyla mitokondriyal ATP sentezine daha fazla bağımlıdır. Bu nedenle, galaktoz içeren bir ortamda çoğalan hücreler, oligomisin tarafından kompleks V inhibisyonuna, glikoz içeren bir ortamda çoğalan hücrelerden daha duyarlıydı (Şekil 6C).

SDH aktivitesi, 13C 5-glutamin izleme kullanılarak ve fumarat ve süksinat izotopologlarına katılımı izlenerek ölçülebilir. Araçla muamele edilen koşullarda, SDH kompleksi ileri aktiviteyi destekledi ve 13 C 4-süksinatın 13 C 4-fumaratın 13 C3-süksinat içine dahiledilmesinden daha yüksekti (Şekil 7). Antimisin ile muamele edilmiş koşullarda, SDH kompleksi ters aktiviteyi destekledi ve 13 C 3-fumaratın 13 C3-süksinat içine dahil edilmesi, 13 C 4-süksinatın 13C 4-fumarat içine dahil edilmesinden daha büyüktü (Şekil 7).

Mitokondri içindeki süperoksit üretimi, süperoksit ile reaksiyona girdikten sonra 2-hidroksi-mitoethidium üreten floresan muhabir MitoSox kullanılarak ölçülebilir. Bu çalışmada, tertbütil hidrojen peroksit varlığında MitoSox ile tedavi edilen hücreler, hücresel ROS'u söndüren bir antioksidan olan NAC'ın eklenmesiyle baskılanan bir şekilde daha yüksek 2-hidroksi-mitoethidium seviyelerine sahipti (Şekil 8).

Figure 1
Şekil 1: Karmaşık V proliferasyon testinin mekanik temeli. Glikoz ve galaktozun glikoliz yoluyla oksidasyonu. Glikoz, glikolizden net iki ATP verirken, galaktoz net sıfır ATP verir, çünkü UDP-galaktoz için UTP sentezi gereklidir. Bu nedenle, galaktozda yetişen hücreler, glikolizden üretilen ATP eksikliği nedeniyle mitokondriyal ATP sentezine daha fazla bağımlıdır. Kısaltmalar: GALK = galaktokinaz; GALT = galaktoz-1-fosfat üridililtransferaz; PGM1 = fosfoglukomutaz 1; GPI = glukoz-6-fosfat izomeraz, UGP = UDP-glukoz pirofosforilaz; GALE = UDP-galaktoz-4-epimeraz; NDK = nükleotid difosfat kinaz; UMPK = idrar monofosfat kinaz; HK = hekzokinaz; PFK = fosfofruktokinaz; ALDO = aldolaz; TPI = triozefosfat izomeraz; GAPDH = gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz; PGK = fosfogliserat kinaz; PGM = fosfoglukutaz; ENO = enolaz; PK = piruvat kinaz. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Kompleks I proliferasyon testinin mekanik temeli. Kompleks I aktivitesinin inhibisyonu üzerine değiştirilen metabolik yolakların şeması. Yüksek piruvat ortamında, kompleks I inhibisyonu LDH aracılı NADH oksidasyonu yoluyla atlanır. Düşük piruvat ortamında, bu adaptasyon daha az uygulanabilirdir, bu da hücreleri NADH'yi yeniden oksitlemek için karmaşık I aktivitesine daha bağımlı hale getirir. Kısaltmalar: LDH = laktat dehidrojenaz; TCA döngüsü = trikarboksilik asit döngüsü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: 13C 4-aspartat izlemesi üzerine DHODH reaksiyonunun şeması. Brequinar, orotat için dihidroorotat oksidasyonunu inhibe eder, böylece UMP'nin aşağı akış sentezini önler. 13C 4-aspartat, DHODH aktivitesi yoluyla 13C3-UMP'ye dahil edilir. Kısaltmalar: OMM = dış mitokondriyal membran; IMM = iç mitokondriyal membran; DHODH = dihidroorotat dehidrojenaz. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: 13C 5-glutamin izleme ile ileri ve geri kompleks II aktivitesinin ölçülmesi. İleri kompleks II aktivitesini ölçmek için (solda), 13 C 5-glutaminin 13 C 4-süksinat ve 13C 4-fumarat içine dahil edilmesi izlenir. Ters kompleks II aktivitesini ölçmek için (sağda), 13 C 5-glutaminin 13 C 3-süksinat ve 13C 3-fumarat içine dahil edilmesi izlenir. Kısaltmalar: SDH = süksinat dehidrojenaz; CytC = sitokrom C. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: MitoSox Kırmızısı'nın süperoksit ile reaksiyonu. MitoSox'un mitokondriyal süperoksitlerle reaksiyonu 2-OH-MitoE2 + 'yı oluşturur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Mitokondriyal fonksiyonu ölçmek için proliferasyona dayalı testler (A) Bir DHODH inhibitörü olan 5 uM brequinar ile tedavi edilen 143B osteosarkom hücrelerinin çoğalması, ±100 ug / mL idrar ile ortamda. Veriler SEM ± ortalamadır; Koşul başına N = 3. (B) Bir kompleks I inhibitörü olan 2 uM rotenon ile tedavi edilen 143B osteosarkom hücrelerinin ±5 mM piruvat içeren ortamda çoğalması. Veriler SEM ± ortalamadır; Koşul başına N = 3. (C) Kompleks bir V inhibitörü olan 5 uM oligomisin ile tedavi edilen 143B osteosarkom hücrelerinin, tek merkezi karbon kaynağı olarak 10 mM glikoz veya 10 mM galaktoz içeren ortamda çoğalması. Veriler SEM ± ortalamadır; Koşul başına N = 3. * Graphpad Prizma'da tek yönlü bir ANOVA testi kullanarak p < 0,05'i gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Kompleks II aktivitesini ölçmek için 13C 5-glutamin izleme. DMSO ve 500 nM antimisin A ile muamele edilmiş Caki1 ve DLD1 hücrelerinde süksinat oksidasyonu ve fumarat indirgemesi (SDH ters) Veriler SEM ± ortalamayı temsil eder; Koşul başına N = 3. GraphPad Prizma'da eşlenmemiş bir t-testi kullanarak p < 0,05'i gösterir. Kısaltmalar: SDH = süksinat oksidasyonu; SDH ters = fumarat indirgeme. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 8
Şekil 8: Süperoksiti tespit etmek için LCMS bazlı MitoSox testi. tBuOOH ± NAC varlığında 30 dakika boyunca MitoSox ile tedavi edilen Caki1 hücrelerinden izole edilen 2-OH-Mito E2 + 'nın ekstrakte edilmiş iyon kromatogramı. Kısaltmalar: LCMS = sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi; NAC = N-asetil sistein. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Bu protokolde kullanılan reaktiflerin, tamponların ve ortamların bileşimi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Ortaya çıkan araştırmalar, memeli mitokondrilerinin moleküler oksijen tüketmeden işlev görebileceğini gösterdiğinden, araştırmacıların mitokondriyal fonksiyonu doğru bir şekilde ölçmek için OCR ölçümlerinin ötesinde ortogonal tahliller kullanmaları son derece önemlidir. Burada, mitokondriyal NAD + / NADH dengesini, adaptif terminal elektron alıcılarının kullanımını, ATP üretimini, de novo pirimidin biyosentezini ve mitokondriyal türevli ROS'u ölçerek kompleks I, kompleks II, kompleks V ve DHODH aktivitelerini doğrudan değerlendirmek için kullanılabilecek bir dizi tahlil derledik. Özellikle, bu testler mitokondriyal fonksiyonu OCR ölçümlerinden daha doğrudan ölçer. Ayrıca, bu testler araştırmacılara hipoksi sırasında mitokondriyal fonksiyonu ölçmek için izlenebilir yollar sağlar; bunun için OCR ölçümleri, tercih edilen terminal elektron alıcısı olarak fumaratın kullanılması nedeniyle büyük ölçüde alakasızdır. Son olarak, burada açıklanan proliferasyona dayalı yöntemler, klasik respirometri deneylerinden daha uygun maliyetlidir, bu nedenle memeli sistemlerinde mitokondriyal fonksiyonu incelemek için geniş çapta erişilebilir bir yol sağlar.

Kültürlenmiş hücrelerde mitokondriyal fonksiyonu ölçmek için bu tahlilleri kullanırken dikkat edilmesi gereken önemli noktalar vardır. Proliferasyon tahlilleri ile ilgili olarak, her hücre hattının iki katına çıkma oranı için tohumlanan hücre sayısını ayarlamak önemlidir. Hücreler en az% 10 birleşime ve üç ila dört katına çıkmasına izin verecek kadar alana sahip olarak tohumlanmalıdır, böylece proliferasyondaki farklılıklar ölçülebilir. Her bir tahlil için bir diğer husus, her bir ETC kompleksinin aktiviteleri için kontrol olarak kullanılan küçük moleküllerin konsantrasyonudur. Farklı hücre hatları bu inhibitörlere karşı farklı hassasiyetler gösterebildiğinden, optimal konsantrasyonu belirlemek için bu küçük moleküllerin dozunu test etmek çok önemlidir.

OCR ölçümleri ve burada açıklanan tüm tahliller de dahil olmak üzere in vitro mitokondriyal fonksiyonu inceleyen testlerin evrensel bir sınırlaması, kültür ortamının metabolik bileşimidir. Standart hücre kültürü ortamı, sistemleri yüzeysel olarak yüksek mitokondriyal fonksiyon seviyelerine önyargılı hale getirme eğilimindedir. Örneğin, suprafizyolojik glutamin seviyeleri, mitokondriyal NADH sentezini besleyen ve sonuç olarak oksidatif fosforilasyonu artıran TCA döngüsü25'in anaplerozunu arttırır. Benzer şekilde, kısmi oksijen basıncı memeli dokularında 3 mmHg ile 100 mmHg (yaklaşık% 0.1 -% 13O2) arasında değişir, ancak in vitro26,27 atmosferiktir (140 mmHg, yaklaşık% 21). Bu fazlaO2, mitokondriyal solunum kapasitesini ve süperoksit üretimini en üst düzeye çıkarır28. Son zamanlarda, kültür medyasını daha fizyolojik29,30 olacak şekilde tasarlamak için çaba sarf edilmiştir. Özellikle, insan plazması benzeri ortamdaki hücrelerin kültürlenmesi, bazı kanser hücre hatlarında mitokondriyal solunumuazaltır 30, T hücrelerinde mitokondriyal ROS31 ve kanser terapötiklerine mitokondriyal adaptasyonlar32. Bu nedenle, kullanılan kültür ortamının bileşimine dikkat etmek ve mitokondriyal fonksiyonu nasıl etkileyebileceğini anlamak çok önemlidir.

Mitokondriyal fonksiyonun yorumlanmasında bir diğer önemli ve evrensel sınırlama, mitokondri sayısındaki farklılıkların potansiyelidir. Bu nedenle, mitokondriyal içeriğin, mtDNA33'ün nicelleştirilmesi, mitokondriyal kütlenin membran potansiyeline duyarsız boyalar34 ile ölçülmesi veya mitokondriyal belirteçlerin batı lekelenmesi yoluyla ölçülmesi kritik öneme sahiptir. Bu kritik bir kontroldür, böylece mitokondri sayısındaki bir azalma, mitokondriyal fonksiyondaki bir azalma ile karıştırılmaz.

Burada açıklanan tahliller için geçerli olan belirli sınırlamalar ve sorun giderme işlemleri de vardır. İlk olarak, farklılaşmış hücrelerin çoğalmadığı göz önüne alındığında, proliferasyona dayalı analizler bu bağlamda mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek için yararlı olmayacaktır. DHODH aktivitesini ölçmek için 13C 4-aspartat izleme protokolünün önemli bir sınırlaması, hücrelerdeki aspartat alımının son derece verimsiz olabileceğidir35. Bu potansiyel sınırlamanın üstesinden gelmek için araştırmacılar, 13 C 4-aspartat alımını kolaylaştırmak için aspartat taşıyıcı SLC1A3'ü aşırı ifade edebilirler35.

SDH aktivitesini ölçmek için 13C 5-glutamin izlemeyi kullanan protokolün bir sınırlaması, bu tahlilin hücrelerin ters aktiviteyi ölçmek için M + 3 izotopologlarını zenginleştirmek için indirgeyici karboksilasyon yolunu kullanmalarını gerektirmesidir. Bazı hücre hatları, düşük ATP sitrat liyaz ekspresyonu36, yetersiz HIF stabilizasyonu37 veya çok düşük bir α-KG: sitrat oranı38 nedeniyle indirgeyici karboksilasyon akısı yapamaz. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, SDH'yi ileri ve geri aktiviteleri ölçmek için 13C 4-aspartat izleme kullanılabilir7. Bu tahlilde, SDH ileri aktivitesi fumarat M + 2: süksinat M + 2 oranı ve süksinat M + 4: fumarat M + 4 ile ters reaksiyon ile ölçülebilir. Özellikle, bu izleme, indirgeyici karboksilasyon yolundaki enzimlerin çoğunu atlatır.

DCPIP indirgemesini okuma olarak kullanan karmaşık I aktivite testinin bir sınırlaması, mitokondrinin yapısal olarak sağlam olmamasıdır. Tahlil için NADH alımını sağlamak için mitokondrinin dondurularak çözülmesi işlemi, mitokondriyal membran39'un yapısal bütünlüğünü kesinlikle bozabilir. Bu tahlil, kompleks I aktivitesindeki değişikliklerin bozulmamış hücreler için de doğru olduğundan emin olmak için kompleks I proliferasyon testi gibi testlere paralel olarak yapılmalıdır.

Gelecekteki çalışmalarda, bu tekniklerden bazıları, fareler ve Caenorhabditis elegans gibi model organizmalar kullanılarak in vivo mitokondriyal fonksiyonları ölçmek için uyarlanabilir.Mitokondriyal fonksiyonu in vivo olarak ölçmek için kullanılan mevcut yöntemler, organizma düzeyinde OCR'ye, özellikle fare modellerini kullanırken solunum değişim oranına odaklanmıştır. Bu yöntemin açık bir sınırlaması, oksijenin mitokondriyal ETC'de her yerde bulunan bir terminal elektron alıcısı olarak rolünün ötesinde birçok biyokimyasal ve sinyal fonksiyonuna hizmet etmesidir. Örneğin, oksijen, dioksijenaz ailesindeki enzimlerin katalitik aktivitesi tarafından "tüketilir". Bu enzimler hücresel oksijen tüketim hızına katkıda bulunsalar da, mitokondriyal fonksiyona katılmazlar, düzenlemezler veya yansıtmazlar. Klasik respirometri deneyleri in vitro tipik olarak "mitokondriyal olmayan OCR" yi kontrol ederken, organizma solunum değişim oranı (RER) deneyleri bunu kontrol edemez ve RR'nin in vivo mitokondriyal fonksiyon için bir metrik olarak yorumlanmasını sınırlar. Bununla birlikte, protokollerin DHODH aktivitesini ölçmek için 13C 4-aspartat izleme, 13C5-glutamin izleme yoluyla kompleks II aktivitesi, dokulardan saflaştırılmış mitokondri üzerindeki kompleks I aktivitesi ve mitokondriyal fonksiyonu in vivo olarak ölçmek için MitoB gibi LC-MS dostu bileşikler kullanılarak mitokondriyal ROS kullanmak mümkündür. Mitokondriyal fonksiyonları sorgulamak için yapılan bu doğrudan testler, klasik respirometri deneyleriyle birlikte, araştırmacılara memeli hücrelerinde ve dokularında mitokondriyal fonksiyonun daha kapsamlı ve doğru bir değerlendirmesini sağlar.

Disclosures

Yazarların bildirecek çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

Bu yazıda üretilen figürler BioRender.com ile oluşturulmuştur. Bu makale hakkında geri bildirim sağladığı için Amy Walker'a minnettarız. J.B.S., Worcester Biyomedikal Araştırma Vakfı Bursu tarafından desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 1.5 mL tube Cell Treat 667443
2.0 mL tube Cell Treat 229446
6-well plate Cell Treat 229106
12-well plate Cell Treat 229112
13C4-aspartate Sigma-Aldrich 604852
13C5-Glutamine Cambridge Isotope Laboratories 285978-14-5
15 mL centrifuge tube Cell Treat 667411
50 mL centrifuge tube Cell Treat 667421
150 mm tissue culture dish Cell Treat 229651
1x Phosphate-buffered saline Gibco 10010049
2,6-dichlorophenolindophenol Honeywell 33125
Ammonium Carbonate Sigma-Aldrich 37999
Antimycin Sigma-Aldrich A8674
Ascentis Express C18 Sigma-Aldrich 53825-U
Bottle top filter 500 mL, 0.22 µm, PES 9 9 mm membrane diameter Cell Treat 229717
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A3294
Brequinar Sigma-Aldrich SML0113
Cell Lifter, Double End Flat and Narrow Blade Cell Treat 229305
CentriVap -105 Cold Trap Labconco 7385020
Complete Protease Inhibitor Tablets Sigma-Aldrich  4693116001
Coulter Counter Cups Fisher Scientific 07-000-694
Decylubiquinone Sigma-Aldrich D7911
DMSO Invitrogen D12345
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11995-065
EDTA Sigma-Aldrich E6758
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Eppendorf Centrifuge 5425R Eppendorf 2231000908
Eppendorf Centrifuge 5910 Ri Eppendorf 5943000343
Galactose Sigma-Aldrich G5388
Glucose Sigma-Aldrich G7021
Glucose-free DMEM Gibco 11966025
Glutamine-free DMEM Thermo Fisher 11960044
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F4135
Hepes Sigma-Aldrich H3375
HPLC-grade 35% Ammonium hydroxide Thermo Scientific 460801000
HPLC-grade Acetonitrile Sigma-Aldrich 900667
HPLC-grade Chloroform Sigma-Aldrich 366927
HPLC-grade formic acid Thermo Scientific 28905
HPLC-grade Isopropanol Sigma-Aldrich 563935
HPLC-grade MeOH Sigma-Aldrich 900688
HPLC-grade Water Sigma-Aldrich 270733
Human Osteosarcome Cell Line 143B ATCC CRL-8303
Hydrochloric Acid Sigma-Aldrich 320331-500ML
Isotone buffer Beckman Coulter 8546719
K2HPO4 Sigma-Aldrich P2222
Mannitol Sigma-Aldrich M4125
MitoSox Red Invitrogen M36008
N-acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich A9165
Oligomycin Sigma-Aldrich 75351-5MG
Pencillin Streptomycin Gibco 15140-122
Potter-Elvehjem Tissue Grinder, Size 21 Kimble 885502-0021
Pyruvate Sigma-Aldrich P5280
Pyruvate-free DMEM media Gibco 11965175
Q Exactive Plus Mass Spectrometer Thermo Scientific 726030
ReCO2ver Incubator Baker
Refrigerated Centrivap Benchtop Vacuum Concentrator Labconco 7310020
RIPA Buffer Millipore Sigma 20188
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
SeQuant ZIC-pHILIC 5μm 150 x 2.1 mm analytical column Sigma-Aldrich 1.50460.0001
SeQuant ZIC-pHILIC guard kit Millipore Sigma 1.50438.0001
Sodium Hydroxide, Pellets Millipore Sigma 567530-250GM
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
SW, TRACEFINDER 5.1 SP3 Thermo Scientific OPTON-31001
Tert-butyl hydroperoxide solution Sigma-Aldrich 458139
Tris Sigma-Aldrich 93352
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco 25-200-114
Uridine Sigma-Aldrich U3003
VANQUISH HORIZON / FLEX HPLC Thermo Scientific VF-S01-A-02
Z2 Coulter Particle count and size analyzer Beckman Coulter BZ10131270

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews Disease Primers. 2, 16080 (2016).
  3. Chandel, N. S., et al. Reactive oxygen species generated at mitochondrial complex III stabilize hypoxia-inducible factor-1alpha during hypoxia: A mechanism of O2 sensing. Journal of Biological Chemistry. 275 (33), 25130-25138 (2000).
  4. Cadenas, E., Boveris, A., Ragan, C. I., Stoppani, A. O. M. Production of superoxide radicals and hydrogen peroxide by NADH-ubiquinone reductase and ubiquinol-cytochrome C reductase from beef-heart mitochondria. Archives of Biochemistry and Biophysics. 180 (2), 248-257 (1977).
  5. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochemical Journal. 417 (1), 1-13 (2009).
  6. Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
  7. Spinelli, J. B., et al. Fumarate is a terminal electron acceptor in the mammalian electron transport chain. Science. 374 (6572), 1227-1237 (2021).
  8. Kumar, R., et al. A redox cycle with complex II prioritizes sulfide quinone oxidoreductase-dependent H(2)S oxidation. Journal of Biological Chemistry. 298 (1), 101435 (2022).
  9. Warburg, O., Geissler, A. W., Lorenz, S. On growth of cancer cells in media in which glucose is replaced by galactose. Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physiologische Chemie. 348 (12), 1686-1687 (1967).
  10. Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants. Toxicological Sciences. 97 (2), 539-547 (2007).
  11. Attardi, G., King, M. P. Human cells lacking mtDNA: Repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
  12. Bodnar, A. G., Cooper, M., Leonard, J. V., Schapira, A. H. Respiratory-deficient human fibroblasts exhibiting defective mitochondrial DNA replication. Biochemical Journal. 305, 817-822 (1995).
  13. Gregoire, M., Morais, R., Quilliam, M. A., Gravel, D. On auxotrophy for pyrimidines of respiration-deficient chick embryo cells. European Journal of Biochemistry. 142 (1), 49-55 (1984).
  14. Mackay, G. M., Zheng, L., vanden Broek, N. J., Gottlieb, E. Analysis of cell metabolism using LC-MS and isotope tracers. Methods in Enzymology. 561, 171-196 (2015).
  15. Heinrich, P., et al. Correcting for natural isotope abundance and tracer impurity in MS-, MS/MS- and high-resolution-multiple-tracer-data from stable isotope labeling experiments with IsoCorrectoR. Scientific Reports. 8 (1), 17910 (2018).
  16. Lee, P., Chandel, N. S., Simon, M. C. Cellular adaptation to hypoxia through hypoxia inducible factors and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (5), 268-283 (2020).
  17. Bisbach, C. M., et al. Succinate can shuttle reducing power from the hypoxic retina to the O(2)-rich pigment epithelium. Cell Reports. 31 (2), 107606 (2020).
  18. Angebault, C., et al. Idebenone increases mitochondrial complex I activity in fibroblasts from LHON patients while producing contradictory effects on respiration. BMC Research Notes. 4, 557 (2011).
  19. Liao, P. C., Bergamini, C., Fato, R., Pon, L. A., Pallotti, F. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Methods in Cell Biology. 155, 3-31 (2020).
  20. Iwai, T., et al. Sodium accumulation during ischemia induces mitochondrial damage in perfused rat hearts. Cardiovascular Research. 55 (1), 141-149 (2002).
  21. Murphy, E., Eisner, D. A. Regulation of intracellular and mitochondrial sodium in health and disease. Circulation Research. 104 (3), 292-303 (2009).
  22. Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. Isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue. Journal of Visualized Experiments. (97), e52076 (2015).
  23. Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nature Metabolism. 4 (6), 651-662 (2022).
  24. Xiao, Y., Meierhofer, D. Are hydroethidine-based probes reliable for reactive oxygen species detection. Antioxidants and Redox Signaling. 31 (4), 359-367 (2019).
  25. DeBerardinis, R. J., et al. Beyond aerobic glycolysis: Transformed cells can engage in glutamine metabolism that exceeds the requirement for protein and nucleotide synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19345-19350 (2007).
  26. Keeley, T. P., Mann, G. E. Defining physiological normoxia for improved translation of cell physiology to animal models and humans. Physiological Reviews. 99 (1), 161-234 (2019).
  27. Ast, T., Mootha, V. K. Oxygen and mammalian cell culture: Are we repeating the experiment of Dr. Ox. Nature Metabolism. 1 (9), 858-860 (2019).
  28. Gu, C., Jun, J. C. Does hypoxia decrease the metabolic rate. Frontiers in Endocrinology. 9, 668 (2018).
  29. Voorde, J., et al. Improving the metabolic fidelity of cancer models with a physiological cell culture medium. Scientific Advances. 5 (1), 7314 (2019).
  30. Cantor, J. R., et al. Physiologic medium rewires cellular metabolism and reveals uric acid as an endogenous inhibitor of UMP synthase. Cell. 169 (2), 258-272 (2017).
  31. MacPherson, S., et al. Clinically relevant T cell expansion media activate distinct metabolic programs uncoupled from cellular function. Molecular Therapy. Methods and Clinical Development. 24, 380-393 (2022).
  32. Torres-Quesada, O., Doerrier, C., Strich, S., Gnaiger, E., Stefan, E. Physiological cell culture media tune mitochondrial bioenergetics and drug sensitivity in cancer cell models. Cancers. 14 (16), 3917 (2022).
  33. Chan, S. W., Chen, J. Z. Measuring mtDNA damage using a supercoiling-sensitive qPCR approach. Methods in Molecular Biology. 554, 183-197 (2009).
  34. Doherty, E., Perl, A. Measurement of mitochondrial mass by flow cytometry during oxidative stress. Reactive Oxygen Species. 4 (10), 275-283 (2017).
  35. Birsoy, K., et al. An essential role of the mitochondrial electron transport chain in cell proliferation is to enable aspartate synthesis. Cell. 162 (3), 540-551 (2015).
  36. Beigneux, A. P., et al. ATP-citrate lyase deficiency in the mouse. Journal of Biological Chemistry. 279 (10), 9557-9564 (2004).
  37. Gameiro, P. A., et al. In vivo HIF-mediated reductive carboxylation is regulated by citrate levels and sensitizes VHL-deficient cells to glutamine deprivation. Cell Metabolism. 17 (3), 372-385 (2013).
  38. Fendt, S. M., et al. Reductive glutamine metabolism is a function of the alpha-ketoglutarate to citrate ratio in cells. Nature Communications. 4, 2236 (2013).
  39. Lee, C. P. Biochemical studies of isolated mitochondria from normal and diseased tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 1271 (1), 21-28 (1995).

Tags

JoVE'de Bu Ay Sayı 195
Memelilerde Mitokondriyal Fonksiyonu Ölçmek için Oksijenden Bağımsız Tahliller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tseyang, T., Valeros, J., Vo, P.,… More

Tseyang, T., Valeros, J., Vo, P., Spinelli, J. B. Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals. J. Vis. Exp. (195), e65184, doi:10.3791/65184 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter