Summary
Denne protokol beskriver en stor dyretræningstestmodel til vurdering af det kardiovaskulære systems funktionelle kapacitet til evaluering af effektiviteten af nye terapier i prækliniske omgivelser. Det kan sammenlignes med en klinisk træningstest.
Abstract
På trods af fremskridt inden for behandlinger er hjerte-kar-sygdomme stadig en af de største årsager til dødelighed og sygelighed på verdensplan. Genterapibaseret terapeutisk angiogenese er en lovende tilgang til behandling af patienter med betydelige symptomer på trods af optimal farmakologisk terapi og invasive procedurer. Imidlertid har mange lovende kardiovaskulære genterapiteknikker ikke opfyldt forventningerne i kliniske forsøg. En forklaring er et misforhold mellem prækliniske og kliniske endepunkter, der bruges til at måle effekt. I dyremodeller har vægten normalt været på let kvantificerbare endepunkter, såsom antallet og arealet af kapillærkarrene beregnet ud fra histologiske sektioner. Bortset fra dødelighed og sygelighed er endepunkter i kliniske forsøg subjektive, såsom træningstolerance og livskvalitet. Imidlertid måler de prækliniske og kliniske endepunkter sandsynligvis forskellige aspekter af den anvendte terapi. Ikke desto mindre er begge typer endepunkter nødvendige for at udvikle vellykkede terapeutiske tilgange. I klinikker er hovedmålet altid at lindre patienternes symptomer og forbedre deres prognose og livskvalitet. For at opnå bedre prædiktive data fra prækliniske studier skal effektparametermålinger matches bedre med målinger i kliniske studier. Her introducerer vi en protokol for en klinisk relevant løbebåndsøvelsestest hos grise. Denne undersøgelse har til formål at: (1) tilvejebringe en pålidelig øvelsestest på svin, der kan bruges til at evaluere sikkerheden og den funktionelle effekt af genterapi og andre nye terapier, og (2) bedre matche endepunkterne mellem prækliniske og kliniske undersøgelser.
Introduction
Kroniske hjerte-kar-sygdomme er væsentlige årsager til dødelighed og sygelighed på verdensplan 1,2. Selvom de nuværende behandlinger er effektive for de fleste patienter, kan mange stadig ikke drage fordel af de nuværende behandlinger på grund af for eksempel diffus kronisk sygdom eller comorbiditeter. Derudover lindres hjertesymptomer hos nogle patienter ikke af de tilgængelige behandlinger, og deres hjerte-kar-sygdom skrider frem på trods af optimal medicinsk behandling3. Der er således et klart behov for at udvikle nye behandlingsmuligheder for alvorlige hjerte-kar-sygdomme.
I løbet af de sidste mange år er nye molekylære veje og måder at manipulere disse mål blevet opdaget på, hvilket gør genterapi, celleterapi og andre nye terapier til en realistisk mulighed for behandling af alvorlige hjerte-kar-sygdomme4. Men efter lovende prækliniske resultater har mange kardiovaskulære applikationer ikke opfyldt forventningerne i kliniske forsøg. På trods af den dårlige effekt i kliniske forsøg har flere forsøg etableret gode sikkerhedsprofiler for nye behandlinger 5,6,7,8,9. At bringe nye kardiovaskulære terapier til patienter vil således kræve forbedrede tilgange og bedre prækliniske modeller, undersøgelsesindstillinger og endepunkter i prækliniske undersøgelser, der kan forudsige klinisk effekt.
I dyremodeller har vægten normalt været på let kvantificerbare endepunkter, såsom antallet og arealet af kapillærbeholdere beregnet ud fra histologiske sektioner eller parametre fra billeddannelse af venstre ventrikel i hvile og under farmakologisk stress. I kliniske forsøg har mange endepunkter været mere subjektive, såsom træningstolerance eller symptomlindring4. Det er således sandsynligt, at endepunkterne i prækliniske undersøgelser og kliniske forsøg måler forskellige aspekter af den anvendte terapi. For eksempel korrelerer en stigning i mængden af blodkar ikke altid med bedre perfusion, hjertefunktion eller træningstolerance. Ikke desto mindre er begge typer endepunkter nødvendige for at udvikle vellykkede terapeutiske tilgange10. Alligevel er hovedmålet altid at lindre symptomer og forbedre patientens prognose og livskvalitet. For at opnå dette skal effektparametermålinger matches bedre mellem prækliniske og kliniske undersøgelser4.
Kardiorespiratorisk kondition afspejler kredsløbs- og åndedrætssystemernes evne til at tilvejebringe ilt under vedvarende fysisk aktivitet, og det kvantificerer således individets funktionelle kapacitet. Funktionel kapacitet er en vigtig prognostisk markør, da det er en stærk uafhængig forudsigelse for risikoen for kardiovaskulær dødelighed og dødelighed af alle årsager11. Forbedringer i kardiorespiratorisk kondition er forbundet med en reduceret risiko for dødelighed12. Træningstest er egnede til evaluering af aerob ydeevne og behandlingsrespons i hjerte-kar-sygdomme. Afhængigt af tilgængeligheden udføres test på et cykelergometer eller et løbebånd. Minut bruges normalt, og pludselige stigninger undgås; Dette fører til et lineært fysiologisk respons. De vigtigste variabler i træningstestene inkluderer den samlede træningstid, opnåede metaboliske ækvivalenter (MET'er), puls og ændringer på et elektrokardiogram (EKG) mellem QRS-komplekset (Q-, R- og S-bølger) og T-bølge (ST-segment). Kliniske stresstest har lave omkostninger og er let tilgængelige13. Af disse grunde har stresstest, såsom 6 minutters gangtest, været meget udbredt i klinikker og bør også bruges i den prækliniske evaluering af nye terapier.
Så vidt vi ved, findes der ingen velbeskrevne store dyremodeller til evaluering af den funktionelle effekt af genterapi eller andre nye terapier. Derfor giver den klinisk relevante træningstest et fremragende perspektiv til evaluering af effektiviteten af disse nye terapier i den prækliniske indstilling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg er godkendt af Animal Experiment Board ved University of Eastern Finland. Denne protokol beskriver en klinisk relevant løbebåndsøvelsestest for svin for at evaluere sikkerheden og effekten af nye terapier til hjertesygdomme. Kvindelige tamsvin med en vægt på 25-80 kg blev anvendt til denne undersøgelse. Dyrene blev hentet fra en kommerciel kilde (se materialetabel).
1. Opsætning af løbebanen
- Opsæt løbebanen, så dyrene kun kan bevæge sig én vej. Brug porte og luger for at forhindre dyrene i at bevæge sig tilbage. Løbebanens grundplan er vist i figur 1, og et eksempel på en løbebane er vist i figur 2.
- Sørg for, at løbebåndet (se materialetabellen) har plads nok til at tillade hældningsændringer.
- Sørg for, at løbebåndet har en justerbar bredde for at forhindre dyret i at dreje under løbet.
- Brug gennemsigtig plast til at lave løbebåndets forvæg. Dette forhindrer dyret i at løbe væk fra løbebåndet, men tillader stadig dyret at se gennem væggen.
OBS: Det er vigtigt, at dyrene kan se gennem forvæggen, da vores erfaring tyder på, at grise er mere motiverede til at løbe, hvis de ser deres medgrise på den anden side af væggen. - Placer en EKG-monitor og defibrillator (se materialetabellen) ved siden af løbebåndet.
BEMÆRK: Dødelige arytmier kan forekomme under stresstesten, især hvis grisen har myokardieiskæmi14,15,16. - Sørg for, at løbebanen indeholder et vandpunkt, hvor dyrene kan drikke og køle af efter løbet.
2. Svinenes akklimatiseringsperiode før testen
- Opstald dyrene i 2 uger, før forsøgene påbegyndes.
- I løbet af 1. uge med akklimatisering skal du sørge for, at dyrene vænner sig til deres håndterere og nye staldmiljø, undtagen løbebanen.
- I løbet af 2. uge af akklimatiseringsperioden skal du sørge for, at dyrene vænner sig til løbebanen.
- Begynd at vænne sig, så dyrene bliver fortrolige med løbebanen. Først skal du holde alle porte åbne, så dyrene kan gå frit på banen og udforske miljøet.
- Når dyrene er mere fortrolige med banen, skal du tænde løbebåndet og lade dyret løbe i korte perioder ad gangen, f.eks. 7 min. Længden af køretiderne skal forlænges dagligt.
OBS: Husk at belønne dyrene i akklimatiseringsperioden. For eksempel blev grisene belønnet med usaltede popcorn i denne undersøgelse.
3. Træningstesten
BEMÆRK: Grise skal fastes mindst 2 timer før træningstesten eller kun gives en lille portion mad før løbeturen.
- Tænd løbebåndet og indstil hældningen til 5% -10%.
- Så snart dyret er på løbebåndet, skal du starte løbebåndet med en starthastighed på 2 km / t.
- Forøg hastigheden med 0,5 km/t hver 60. sek., indtil 5 km/t er nået. Den samlede køretid er 15 min.
- Hvis dyret ikke kan løbe hele tiden med maksimal hastighed, skal du udføre nedenstående trin.
- Hvis grisen ikke løber så hurtigt som en valgt hastighed, skal du forsigtigt skubbe den bagfra, da dette kan give dyret følelsen af, at det skal løbe hurtigere uden at bremse.
- Prøv forsigtigt at skubbe dyret maksimalt tre gange; Derefter sænkes hastigheden med 0,5 km / t ad gangen, indtil grisen kan klare hastigheden. Sæt ikke farten ned til under 2 km/t.
- Hvis dyret nægter at løbe selv med langsom hastighed, skal du slukke løbebåndet og stoppe testen.
4. EKG-overvågning under træningstesten
- Placer EKG-elektroder (se materialetabellen) på anatomiske steder, der har minimal bevægelse under løbet, såsom skulderblade eller brystet.
BEMÆRK: Brug EKG-elektroder designet til træningstest for at opnå bedre vedhæftning til huden. Husk at barbere hår fra det område, hvor EKG-elektroderne skal placeres. - Registrer pulsændringerne under løbet.
BEMÆRK: Vores erfaring tyder på, at ST-segmentanalyser ofte er komplicerede på grund af bevægelse og andre artefakter. Rytmeovervågning kan også udføres ved hjælp af en implanterbar loopoptager eller pacemaker.
5. Dataindsamling
- Registrer kørselsafstanden, den samlede tid og hastigheden, hver gang hastigheden ændres.
BEMÆRK: Moderne løbebånd kan indsamle mange andre data, så det er vigtigt at gøre dig bekendt med løbebåndsmanualen for at udnytte udstyrets fulde potentiale. - Bemærk mulige ændringer i dyrs adfærd, såsom haltning.
BEMÆRK: Kontakt om nødvendigt en dyrlæge og sørg for, at dyret får den nødvendige analgesi. Fjern dyret fra fremtidige øvelser, indtil det fuldt ud genvinder.
6. Pleje efter proceduren
- Sørg for, at dyret har adgang til vandpunktet.
- Beløn dyret, for eksempel med godbidder eller legetøj.
- Overvåg dyret i 30 minutter efter kørslen for mulige bivirkninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Man skal have erfaring med at arbejde med store dyr for at lykkes med denne protokol. Forskere skal være i stand til at vurdere, om et dyr holder op med at løbe på grund af træthed eller manglende motivation. Registrering af hastighed og afstand kan hjælpe med at evaluere dette, da dyr, der mangler motivation, normalt holder helt op med at løbe, mens trætte dyr fortsætter med at løbe efter at have sænket hastigheden (figur 3). Om nødvendigt kan protokollen gentages den næste dag, hvis resultaterne virker upålidelige.
Figur 4 viser en repræsentativ tidslinje for AAV-behandlede dyr (adeno-associeret virus). Tidslinjen kan variere afhængigt af studieindstillingen, især med hensyn til offertidspunktet. Bemærk akklimatiseringsperioden, når du planlægger eksperimenterne.
Resultaterne kan sammenlignes med andre organstruktur- og funktionsmålinger, såsom hjerteekko, for at se, hvordan træningstolerance relaterer til disse andre målinger. For eksempel korrelerer ændringen i køreafstand med ændringen i udstødningsfraktionen. Med en lav udstødningsfraktion kan et dyr ikke løbe med fuld hastighed under hele træningstesten (figur 5). Analyserede variabler kan variere afhængigt af undersøgelsesindstillingerne. Denne protokol muliggør sammenligning af total løbedistance, hastighedsvariation, MET'er, pulsvariation og arytmier.
EKG registreres under træningstesten (figur 6). ST-segmentanalyse er vanskelig på grund af artefakter. Ændringer i pulsintervaller kan måles fra EKG gennem hele træningstesten.
Figur 1: Plantegning af løbebanen. Stedet for dyr, der ikke løber, er markeret med (A). Et dyr ad gangen ledes til løbebåndet [zone (C)] gennem en korridor (B). Porten mellem zone A og B er lukket for at sikre, at kun ét dyr ad gangen går til løbebanen, og de øvrige dyr forbliver i zone A. Det er vigtigt, at andre dyr bliver i zone (A), da dyret på løbebåndet kan se de andre dyr i zone (A), hvilket motiverer dem til at løbe. Porten mellem løbebåndet og zone (B) er lukket for at sikre, at dyret ikke kan bakke ud af løbebåndet. Løbebåndet betjenes fra zone (D), og dyret returneres til zone (A) gennem zone (D) efter løbet. I det foreliggende tilfælde er et vandpunkt, hvor dyrene kan drikke og køle af efter løbegården, installeret i zone A. Symboler: sorte pile angiver rotationsretningen, og kvartcirkler angiver porte. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative billeder af løbebanen . A) Betydningen af kun én tilgængelig rute for dyrene. B) løbebåndet, som skal have en justerbar bredde for at forhindre dyr i at vende sig under løbet. C) Et lukket rum, der er beregnet til et andet dyr ud over det løbende dyr. Dyr er mere motiverede til at løbe, når de ser et medlem af deres art. D) Et eksempel på et vandpunkt for dyrene, hvor dyrene kan køle af og drikke efter stresstesten. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Løbedistance og hastighed . A) Repræsentative data fra de samlede løbedistancer for fire sunde svin. Den gennemsnitlige samlede løbeafstand for forsøgsdyrene var 970 m, og standardafvigelsen for de samlede afstande var 80 m. (B) Data om hastighedsvariation mellem svin. Hastigheden sænkes med 0,5 km/t intervaller, indtil grisen kan klare hastigheden. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentativ tidslinje. Bemærk, at tidspunkterne kan variere mellem undersøgelserne. Det er dog bemærkelsesværdigt, at dyr skal ankomme til laboratoriedyrcentret 3 uger før forsøget påbegyndes på grund af akklimatiseringsperioden. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Korrelation mellem køreafstanden og ændringen i udstødningsfraktionen. Korrelation mellem ændringen i køreafstand og ændringen i udstødningsfraktion. Uddrivningsfraktionen i hvile blev målt ved Biplan Simpon-metoden. Ændringen i udstødningsfraktionen fra baseline korrelerer med ændringen i løbeafstanden for svin med pacemaker-induceret hjertesvigt, med r = 0,2831, p = 0,0284 ogR2 = 0,0801. På trods af den lave r og R2 har ændringen i venstre ventrikels uddrivningsfraktionsprocent (LVEF%) tendens til at påvirke køreafstande. Det er vigtigt at bemærke, at flere faktorer påvirker de målte variabler, der påvirker resultaterne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Repræsentative EKG-bånd fra en sund gris. Det øverste EKG-panel viser et EKG 3 min efter træningstestens begyndelse. Den nederste EKG-strimmel viser et EKG efter at have kørt i 10 min. EKG kan bruges til at evaluere forskellene i forsøgsdyrenes hjertefrekvens. Hjertefrekvensen på det øverste EKG-panel er 176 slag i minuttet, og på den nederste EKG-strimmel er 250 slag i minuttet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne store dyreøvelsestest efterligner den test, der anvendes i klinikker, hvilket reducerer kløften i endepunkter mellem de prækliniske undersøgelser og kliniske forsøg. Det kan anvendes til at evaluere effekten af nye behandlinger for alvorlige hjerte-kar-sygdomme, såsom arteriosklerose obliterans, hjertesvigt og iskæmiske hjertesygdomme. De tidspunkter, der anvendes i denne protokol, kan variere afhængigt af den testede behandling. Denne protokol er blevet standardiseret baseret på en lang erfaring med at arbejde med store dyr og kan bruges til at evaluere sikkerheden og effekten af kardiovaskulær genterapi og andre nye terapeutiske tilgange.
Svinehjertet og kardiovaskulærsystemet ligner menneskelig fysiologi, anatomi og funktion. Derfor er svin ofte blevet brugt til at modellere kardiovaskulære sygdomsmekanismer og terapeutiske procedurer17. Opfølgningstiden i vores svineforsøg har været op til 12 måneder18; Håndteringen af dyrene bliver dog stadig mere udfordrende, efterhånden som de vokser i de lange opfølgningsperioder.
Denne metode består af forskellige kritiske trin, som er afgørende for testens succes og umulige at korrigere bagefter. For det første har grise individuelle forskelle i deres løbende motivation. Det er vigtigt at få dyrene motiveret til at løbe og opretholde tilstrækkelig motivation gennem hele testen. Dette sikrer, at alle tidspunkter er sammenlignelige. Opretholdelse af grises løbemotivation kræver specifik viden om deres individuelle adfærdskarakteristika. Dyrene skal akklimatiseres til løbebåndet og testmiljøet inden træningstesten. Grise læres at gå på løbebåndet, og deres vellykkede forestillinger belønnes. En anden måde at øge deres løbemotivation på er at holde andre forsøgsdyr i løberens synsfelt.
Det er vigtigt at undgå typiske anatomiske fejl, såsom forskellige benproblemer. De mest almindelige anatomiske fejl er hovsygdomme, medfødte lemmer deformiteter og problemer forårsaget af ulykker, såsom lacerationer, scapular skader, brud og sår. Disse skyldes for det meste levesteder, ulykker, arvelige faktorer og afvigelser i fodring19. En svaghed i benene fører til ukoordineret gang, hvilket gør det umuligt at deltage i træningstest. Hvis der opstår bensvaghed under undersøgelsen, skal dyret udelukkes fra testen. Benproblemer kan undgås ved at vælge grise med intakte benstrukturer. Under forskningen kan benskader forebygges ved at have gode forhold i svinestalden. Hårde, ætsende overflader skal undgås, og den generelle hygiejne skal opretholdes. Grise skal fodres moderat, så de ikke vokser for hurtigt, da dette spænder deres ben. Derudover skal svin placeres omhyggeligt i deres penne for at undgå ulykker, og de skal have tilstrækkelige stimuli, såsom legetøj, så deres tygning ikke er rettet mod andre grise.
Under træningstesten blev EKG registreret med et 3-leds EKG eller implanterbar loopoptager. Det er ikke så nøjagtigt som et EKG med 12 ledninger, men kan stadig vurdere flere variabler, såsom arytmier og puls. Flere typer fejl og forstyrrelser kan forfalske EKG'er. For eksempel kan forkert tilsluttede elektroder, dårlig kontakt mellem hud og elektroder og skeletmuskelkontraktioner forårsage fejl. Elektroderne skal forblive solidt på plads under hele prøvningen. Dette er udfordrende, da huden varmer op og sveder under løb. Kontakt mellem huden og elektroderne kan forbedres ved barbering af hår, desinfektion og fjernelse af døde hudceller. Bevægelsen af muskler forårsager også artefakter, der påvirker EKG'er13. Dette kan udfordre fortolkningen af ST-segmenter. Derudover kan EKG-ledninger forstyrre løbet. Disse problemer kan dog reduceres ved at banke EKG-ledningerne fast på huden. EKG'er kan også registreres med en implanterbar loopoptager eller pacemaker. Brug af en implanterbar loopoptager løser mange problemer, som brug af EKG med 3 ledninger har. Installation af den implanterbare loopoptager er imidlertid en invasiv operation med risici, såsom infektioner.
Forskere skal observere dyrs adfærd under hele testen for at sikre procedurens generelle sikkerhed. For eksempel er udmattelse, svær træthed, kvalme, bevidsthedstab, svær dyspnø eller cyanotisk hud grunde til at afslutte træningstesten. Forskere skal også observere ændringer i EKG, såsom arytmier. Men med veluddannet personale og tilstrækkelig erfaring med at arbejde med store dyr kan den nuværende træningsprotokol rutinemæssigt anvendes i prækliniske undersøgelser til at producere klinisk relevante data, der skal gøre den kliniske overgang af nye terapeutiske tilgange mere vellykket med hensyn til kliniske fordele for patienterne.
Poole et al.20 har offentliggjort retningslinjer for dyretræning og træningsprotokoller til kardiovaskulære undersøgelser. I disse protokoller træner grise på et løbebånd i ca. 30 minutter efter opvarmning. I løbet af disse 30 minutter er målpulszonen for forsøgsdyrene 65% -75% af den maksimale puls. Pulsen ændres enten ved at ændre løbebåndets hastighed eller hældning. Poole et al.'s protokol og 15 minutters træningstesten, der præsenteres i dette manuskript, har flere ligheder, såsom akklimatiseringsperioden, løbebåndskrav, vægten af udvalgte forsøgsdyr og positiv forstærkning ved at belønne dyret efter øvelsen. I begge protokoller kan testdyrene vokse ud af løbebåndets kapacitet, hvilket begrænser opfølgningstiden.
Hovedforskellen mellem protokollen beskrevet af Poole et al. og øvelsestesten præsenteret i dette manuskript er formålet med testen. Protokollen beskrevet af Poole et al. er designet til at fremkalde klassiske træningstilpasninger bemærket hos mennesker. Derfor fokuserer den på træning med moderat intensitet, mens testmetoden på 15 minutter sigter mod at gøre en næsten maksimal indsats for bedre at evaluere kardiorespiratorisk kondition. Dette opnås, når det subjektive anstrengelsesniveau er ca. 90% af den maksimale hjertefrekvens13. En 15 minutters træningstest efterligner testen, der bruges i klinikker ved gradvist at øge anstrengelsesniveauet, indtil det er tæt på maksimalt. På grund af forskellene i forsøgsprotokollernes formål er forsøgsdyrenes træningsfrekvens forskellig. Poole et al. beskriver, at grise kan løbe op til fire gange om ugen for at opnå bedre kardiovaskulære tilpasninger forårsaget af træning. Den 15 minutters træningstest evaluerer den funktionelle effekt af genterapi og andre nye terapier, hvorfor den krævede frekvens er signifikant lavere og afhænger af behandlingens krav. Et eksempel på disse krav er beskrevet i figur 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatteren vil gerne takke Minna Törrönen, Riikka Venäläinen, Heikki Karhunen og Inkeri Niemi fra National Laboratory Animal Center for deres hjælp med dyrearbejde. Denne undersøgelse er støttet af Finnish Academy, ERC og CardioReGenix EU Horizon grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Defibrillator | Zoll M series | TO9K116790 | All portable defribrillators will work |
| Defibrillator pads | Philips | M3713A | All pads work, as long as the pads are compatible with the defibrillator |
| ECG electrodes | Several providers | Prefer ECG electrodes designed for exercise tests | |
| Loop recorder | Abbott Oy | DM3500 | Optional for rhythm monitoring |
| Patient monitor | Schiller Argus LCM Plus | 7,80,05,935 | All portable ecg monitors will work |
| Pigs | Emolandia Oy | ||
| Treadmill | NordicTrack | All treadmills with adjustable incline and speed are suitable for the exercise test. The treadmill should be as long and wide as possible. | |
| Ultrasound system | Philips EPIQ 7 ultrasound | ||
| Various building materials | Several providers | For building fences, ramps and gates according to the Figure 1 and Figure 2 | |
| Various treats for the animals |
References
- Virani, S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), e139 (2020).
- Townsend, N., et al.
- Knuuti, J., et al. 2019 ESC Guidelines for the diagnosis and management of chronic coronary syndromes: The Task Force for the diagnosis and management of chronic coronary syndromes of the European Society of Cardiology (ESC). European Heart Journal. 41 (3), 407-477 (2020).
- Ylä-Herttuala, S., Baker, A. H. Cardiovascular gene therapy: past, present, and future. Molecular Therapy. 25 (5), 1096-1106 (2017).
- Hedman, M., et al. Eight-year safety follow-up of coronary artery disease patients after local intracoronary VEGF gene transfer. Gene Therapy. 16 (5), 629-634 (2009).
- Rosengart, T. K., et al. Long-term follow-up of a phase 1 trial of angiogenic gene therapy using direct intramyocardial administration of an adenoviral vector expression the VEGF121 cDNA for the treatment of diffuse coronary artery disease. Human Gene Therapy. 24 (2), 203-208 (2013).
- Muona, K., Mäkinen, K., Hedman, M., Manninen, H., Ylä-Herttuala, S. 10-year safety follow-up in patients with local VEGF gene transfer to ischemic lower limb. Gene Therapy. 19 (4), 392-395 (2012).
- Leikas, A. J., et al. Long-term safety and efficacy of intramyocardial adenovirus-mediated VEGF-DΔNΔC gene therapy eight-year follow-up of phase I KAT301 study. Gene Therapy. 29 (5), 289-293 (2022).
- Telukuntla, K. S., Suncion, V. Y., Schulman, U. H., Hare, J. M. The advancing field of cell-based therapy: insights and lessons from clinical trials. Journal of the American Heart Association. 2 (5), e000338 (2013).
- Ylä-Herttuala, S., Bridges, C., Katz, M. G., Korpisalo, P. Angiogenic gene therapy in cardiovascular diseases: dream or vision. European Heart Journal. 38 (18), 1365-1371 (2017).
- Lähteenvuo, J., Ylä-Herttuala, S. Advances and challenges in cardiovascular gene therapy. Human Gene Therapy. 28 (11), 1024-1032 (2017).
- Ross, R., et al. Importance of assessing cardiorespiratory fitness in clinical practice: a case for fitness as a clinical vital sign: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 134 (24), e653-e699 (2016).
- Sietsema, K. E., Stringer, W. W., Sue, D. Y., Ward, S. Wasserman & Whipp's Principles of Exercise Testing and Interpretation. 6th. , Wolters Kluwer. Philadelphia. (2021).
- Darmadi, M. A., et al. Exercise-induced sustained ventricular tachycardia without structural heart disease: a case report. The American Journal of Case Reports. 21, e928242 (2020).
- Casella, G., Pavesi, P. C., Sangiorgio, P., Rubboli, A., Bracchetti, D. Exercise-induced ventricular arrhythmias in patients with healed myocardial infarction. International Journal of Cardiology. 40 (3), 229-235 (1993).
- Gimeno, J. R., et al. Exercise-induced ventricular arrhythmias and risk of sudden cardiac death in patients with hypertrophic cardiomyopathy. European Heart Journal. 30 (21), 2599-2605 (2009).
- Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (5), 432-438 (2014).
- Korpela, H., et al. AAV2-VEGF-B gene therapy failed to induce angiogenesis in ischemic porcine myocardium due to inflammatory responses. Gene Therapy. 29 (10-11), 643-652 (2022).
- Swindle, M. M. Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging, and Experimental Techniques. 2nd edition. , CRC Press. Taylor & Francis Group. (2007).
- Poole, D. C., et al. Guidelines for animal exercise and training protocols for cardiovascular studies. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), H1100-H1138 (2020).
