Summary
O presente protocolo descreve um modelo de teste de exercício em animais de grande porte para avaliar a capacidade funcional do sistema cardiovascular para avaliar a eficiência de novas terapias no contexto pré-clínico. É comparável a um teste de exercício clínico.
Abstract
Apesar dos avanços nos tratamentos, as doenças cardiovasculares ainda são uma das maiores causas de mortalidade e morbidade no mundo. A angiogênese terapêutica baseada em terapia gênica é uma abordagem promissora para o tratamento de pacientes com sintomas significativos, apesar da terapia farmacológica ideal e dos procedimentos invasivos. No entanto, muitas técnicas promissoras de terapia gênica cardiovascular falharam em atingir as expectativas em ensaios clínicos. Uma explicação é uma incompatibilidade entre os desfechos pré-clínicos e clínicos usados para medir a eficácia. Em modelos animais, a ênfase tem sido geralmente em desfechos facilmente quantificáveis, como o número e a área dos vasos capilares calculados a partir de cortes histológicos. Além da mortalidade e morbidade, os desfechos nos ensaios clínicos são subjetivos, como tolerância ao exercício e qualidade de vida. No entanto, os desfechos pré-clínicos e clínicos provavelmente medem diferentes aspectos da terapia aplicada. No entanto, ambos os tipos de desfechos são necessários para desenvolver abordagens terapêuticas bem-sucedidas. Nas clínicas, o principal objetivo é sempre aliviar os sintomas dos pacientes e melhorar seu prognóstico e qualidade de vida. Para obter melhores dados preditivos de estudos pré-clínicos, as medidas de desfecho devem ser mais bem combinadas com aquelas em estudos clínicos. Aqui, apresentamos um protocolo para um teste de exercício em esteira rolante clinicamente relevante em porcos. Este estudo visa: (1) fornecer um teste de exercício confiável em suínos que possa ser usado para avaliar a segurança e eficácia funcional da terapia gênica e outras novas terapias, e (2) combinar melhor os desfechos entre estudos pré-clínicos e clínicos.
Introduction
As doenças cardiovasculares crônicas são importantes causas de mortalidade e morbidade em todo omundo1,2. Embora os tratamentos atuais sejam eficazes para a maioria dos pacientes, muitos ainda não podem se beneficiar das terapias atuais devido, por exemplo, a doenças crônicas difusas ou comorbidades. Além disso, em alguns pacientes, os sintomas cardíacos não são aliviados pelos tratamentos disponíveis, e sua doença cardiovascular progride apesar da terapia medicamentosa ideal3. Assim, há uma clara necessidade de desenvolver novas opções de tratamento para doenças cardiovasculares graves.
Durante os últimos anos, novas vias moleculares e maneiras de manipular esses alvos foram descobertas, tornando a terapia gênica, a terapia celular e outras novas terapias uma opção realista para o tratamento de doenças cardiovasculares graves4. No entanto, após resultados pré-clínicos promissores, muitas aplicações cardiovasculares não conseguiram atender às expectativas em ensaios clínicos. Apesar da baixa eficácia em ensaios clínicos, vários estudos estabeleceram bons perfis de segurança de novas terapias 5,6,7,8,9. Assim, trazer novas terapias cardiovasculares para os pacientes exigirá melhores abordagens e melhores modelos pré-clínicos, configurações de estudo e desfechos em estudos pré-clínicos que possam predizer a eficácia clínica.
Em modelos animais, a ênfase tem sido geralmente em desfechos facilmente quantificáveis, como o número e a área de vasos capilares calculados a partir de cortes histológicos ou parâmetros de imagem do ventrículo esquerdo em repouso e sob estresse farmacológico. Em ensaios clínicos, muitos desfechos têm sido mais subjetivos, como tolerância ao exercício ou alívio dos sintomas4. Assim, é provável que os desfechos em estudos pré-clínicos e ensaios clínicos meçam diferentes aspectos da terapia aplicada. Por exemplo, um aumento na quantidade de vasos sanguíneos nem sempre se correlaciona com melhor perfusão, função cardíaca ou tolerância ao exercício. No entanto, ambos os tipos de desfechos são necessários para o desenvolvimento de abordagens terapêuticasbem-sucedidas 10. Ainda assim, o principal objetivo é sempre aliviar os sintomas e melhorar o prognóstico e a qualidade de vida do paciente. Para isso, as medidas dos desfechos devem ser mais bem pareadas entre os estudos pré-clínicos e clínicos4.
A aptidão cardiorrespiratória reflete a capacidade dos sistemas circulatório e respiratório de fornecer oxigênio durante a atividade física sustentada e, assim, quantifica a capacidade funcional de um indivíduo. A capacidade funcional é um importante marcador prognóstico, pois é um forte preditor independente para o risco de mortalidade cardiovascular e por todas as causas11. Melhorias na aptidão cardiorrespiratória estão associadas à redução do risco de mortalidade12. Os testes ergométricos são adequados para avaliar o desempenho aeróbio e as respostas ao tratamento em doenças cardiovasculares. Dependendo da disponibilidade, os testes são realizados em cicloergômetro ou esteira. Geralmente utiliza-se um aumento gradual da carga de trabalho por minuto e evitam-se aumentos abruptos; Isso leva a uma resposta fisiológica linear. As variáveis mais importantes nos testes de exercício incluem o tempo total de exercício, equivalentes metabólicos (METs) alcançados, frequência cardíaca e alterações na linha do eletrocardiograma (ECG) entre o complexo QRS (ondas Q, R e S) e a onda T (segmento ST). Os testes clínicos de estresse têm baixo custo e são de fácil acesso13. Por essas razões, testes de esforço, como o teste de caminhada de 6 min, têm sido amplamente utilizados na clínica e também devem ser utilizados na avaliação pré-clínica de novas terapias.
Até onde sabemos, não existem modelos animais de grande porte bem descritos para avaliar a eficácia funcional da terapia gênica ou de outras terapias novas. Portanto, o teste ergométrico clinicamente relevante fornece uma excelente perspectiva para avaliar a eficácia dessas novas terapias no cenário pré-clínico.
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Protocol
Todos os experimentos são aprovados pelo Conselho de Experimentação Animal da Universidade da Finlândia Oriental. Este protocolo descreve um teste ergométrico clinicamente relevante em esteira rolante para suínos para avaliar a segurança e eficácia de novas terapias para doenças cardíacas. Foram utilizadas fêmeas de suínos domésticos pesando entre 25 e 80 kg. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais).
1. Configuração da pista de atletismo
- Configure a pista de corrida para que os animais só possam se mover em uma direção. Use portões e escotilhas para evitar que os animais se movam para trás. A planta baixa da pista de corrida é mostrada na Figura 1, e um exemplo de pista de corrida está na Figura 2.
- Certifique-se de que a esteira (consulte Tabela de Materiais) tenha espaço suficiente para permitir mudanças de inclinação.
- Certifique-se de que a esteira tenha uma largura ajustável para evitar que o animal gire durante a corrida.
- Use plástico transparente para fazer a parede frontal da esteira. Isso evita que o animal fuja da esteira, mas ainda permite que o animal veja através da parede.
NOTA: É essencial que os animais possam ver através da parede frontal, pois nossa experiência sugere que os porcos estão mais motivados a correr se virem seus companheiros porcos do outro lado da parede. - Coloque um monitor de ECG e um desfibrilador (ver Tabela de Materiais) ao lado da esteira.
OBS: Arritmias fatais podem ocorrer durante o teste ergométrico, principalmente se o porco apresentar isquemia miocárdica14,15,16. - Certifique-se de que a pista de corrida inclua um ponto de água onde os animais possam beber e se refrescar após a corrida.
2. Período de aclimatação dos suínos antes do ensaio
- Alojar os animais por 2 semanas antes de iniciar os experimentos.
- Durante a 1ª semana de aclimatação, certifique-se de que os animais se acostumem com seus tratadores e novo ambiente de alojamento, excluindo a pista de atletismo.
- Durante a 2ª semana do período de aclimatação, certifique-se de que os animais se acostumem com a pista de corrida.
- Comece a se acostumar para que os animais se familiarizem com a pista de corrida. Primeiro, mantenha todos os portões abertos, para que os animais possam andar livremente na pista e explorar o ambiente.
- Quando os animais estiverem mais familiarizados com a pista, ligue a esteira e deixe o animal correr por curtos períodos de cada vez, como 7 min. A duração dos tempos de execução deve ser estendida diariamente.
OBS: Lembre-se de recompensar os animais durante o período de aclimatação. Por exemplo, os porcos foram recompensados com pipoca sem sal no presente estudo.
3. O teste ergométrico
NOTA: Os porcos devem estar em jejum pelo menos 2 h antes do teste ergométrico ou receber apenas uma pequena porção de alimento antes da corrida.
- Ligue a esteira e ajuste a inclinação para 5%-10%.
- Assim que o animal estiver na esteira, inicie a esteira com uma velocidade inicial de 2 km/h.
- Aumente a velocidade em 0,5 km/h a cada 60 s até atingir 5 km/h. O tempo total de execução é de 15 min.
- Caso o animal não consiga correr o tempo todo na velocidade máxima, execute os passos abaixo.
- Se o porco não estiver correndo tão rápido quanto uma velocidade selecionada, empurre-o suavemente de costas, pois isso pode dar ao animal a sensação de que ele precisa correr mais rápido sem desacelerar.
- Tente empurrar suavemente o animal no máximo três vezes; Depois disso, diminua a velocidade em 0,5 km/h de cada vez até que o porco consiga lidar com a velocidade. Não diminua a velocidade para menos de 2 km/h.
- Se o animal se recusar a correr mesmo em velocidade lenta, desligue a esteira e pare o teste.
4. Monitorização eletrocardiográfica durante o teste ergométrico
- Coloque eletrodos de ECG (consulte Tabela de Materiais) em locais anatômicos que tenham movimento mínimo durante a corrida, como escápulas ou tórax.
NOTA: Use eletrodos de ECG projetados para testes de exercício para obter uma melhor adesão à pele. Lembre-se de raspar o cabelo da área onde os eletrodos de ECG serão colocados. - Registre as alterações da frequência cardíaca durante a corrida.
NOTA: Nossa experiência sugere que as análises do segmento ST são muitas vezes complicadas devido ao movimento e outros artefatos. O monitoramento do ritmo também pode ser feito usando um gravador de loop implantável ou marca-passo.
5. Coleta de dados
- Registre a distância de corrida, o tempo total e a velocidade sempre que a velocidade for alterada.
NOTA: As esteiras modernas podem coletar muitos outros dados, por isso é essencial se familiarizar com o manual da esteira para utilizar todo o potencial do equipamento. - Observe possíveis mudanças no comportamento animal, como mancar.
OBS: Se necessário, entre em contato com um veterinário e certifique-se de que o animal receba a analgesia necessária. Retire o animal de exercícios futuros até que ele se recupere totalmente.
6. Cuidados pós-procedimento
- Certifique-se de que o animal tenha acesso ao ponto de água.
- Recompense o animal, por exemplo, com guloseimas ou brinquedos.
- Monitorar o animal por 30 min após a corrida para possíveis efeitos adversos.
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Representative Results
É preciso ter experiência no trabalho com animais de grande porte para ter sucesso com esse protocolo. Os pesquisadores precisam ser capazes de avaliar se um animal para de correr devido à fadiga ou falta de motivação. O registro da velocidade e da distância pode ajudar a avaliar isso, pois geralmente, animais sem motivação param de correr totalmente, enquanto animais fatigados continuam correndo após diminuir a velocidade (Figura 3). Se necessário, o protocolo pode ser repetido no dia seguinte se os resultados parecerem não confiáveis.
Uma linha do tempo representativa para animais tratados com vírus adenoassociado (AAV) é mostrada na Figura 4. O cronograma pode variar dependendo do local do estudo, especialmente em relação ao momento do sacrifício. Observe o período de aclimatação ao planejar os experimentos.
Os resultados podem ser comparados com outras medidas de estrutura e função de órgãos, como ecocardiografia cardíaca, para ver como a tolerância ao exercício se relaciona com essas outras medidas. Por exemplo, a mudança na distância de corrida correlaciona-se com a mudança na fração de ejeção. Com uma baixa fração de ejeção, um animal não pode correr em velocidade máxima durante todo o teste de exercício (Figura 5). As variáveis analisadas podem diferir dependendo do cenário do estudo. Esse protocolo permite comparar a distância total percorrida, a variação da velocidade, os METs, a variação da frequência cardíaca e as arritmias.
O ECG é registrado durante o teste ergométrico (Figura 6). A análise do segmento ST é difícil devido a artefatos. Mudanças nos intervalos da frequência cardíaca podem ser medidas a partir do ECG durante todo o teste ergométrico.
Figura 1: Planta baixa da pista de atletismo. O local para animais que não correm está marcado com (A). Um animal de cada vez é guiado até a esteira [zona (C)] através de um corredor (B). O portão entre as zonas (A) e (B) é fechado para garantir que apenas um animal de cada vez vá para a pista de atletismo e os outros animais permaneçam na zona (A). É essencial que outros animais permaneçam na zona (A), pois o animal na esteira pode ver os outros animais na zona (A), o que os motiva a correr. O portão entre a esteira e a zona (B) é fechado para garantir que o animal não possa recuar da esteira. A esteira é operada a partir da zona (D), e o animal é devolvido à zona (A) através da zona (D) após a corrida. No presente caso, um ponto de água onde os animais podem beber e se refrescar após a corrida é instalado na zona (A). Símbolos: setas pretas indicam a direção da rotação, e quartos de círculos indicam portões. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens representativas da pista de atletismo . (A) A importância de apenas uma via disponível para os animais. (B) A esteira, que deve ter uma largura ajustável para evitar que os animais girem durante a corrida. (C) Um espaço fechado destinado a outro animal além do animal corredor. Os animais ficam mais motivados a correr quando veem um membro de sua espécie. (D) Um exemplo de um ponto de água para os animais onde os animais podem se refrescar e beber após o teste de esforço. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Distância e velocidade de corrida . (A) Dados representativos das distâncias totais de corrida de quatro suínos saudáveis. A distância média total de corrida dos animais de teste foi de 970 m, e o desvio padrão das distâncias totais foi de 80 m. (B) Dados sobre a variação de velocidade entre os suínos. A velocidade é reduzida em intervalos de 0,5 km/h até que o porco possa lidar com a velocidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Linha do tempo representativa. Vale ressaltar que os momentos podem variar entre os estudos. No entanto, é notável que os animais devem chegar ao centro de biotério 3 semanas antes de iniciar o experimento devido ao período de aclimatação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Correlação da distância percorrida com a variação da fração de ejeção. Correlação da mudança na distância percorrida com a mudança na fração de ejeção. A fração de ejeção em repouso foi medida pelo método Biplanar Simpon. A mudança na fração de ejeção em relação à linha de base correlaciona-se com a mudança na distância percorrida de suínos com insuficiência cardíaca induzida por marcapasso, com r = 0,2831, p = 0,0284 e R2 = 0,0801. Apesar dos baixos r e R2, a alteração no percentual da fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE%) tende a afetar as distâncias corridas. É importante ressaltar que diversos fatores influenciam as variáveis mensuradas, afetando os resultados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Fitas de ECG representativas de um porco saudável. O painel superior do ECG mostra um ECG 3 min após o início do teste ergométrico. A tira de ECG inferior mostra um ECG após correr por 10 min. O ECG pode ser usado para avaliar as diferenças na frequência cardíaca dos animais de teste. A frequência cardíaca do painel de ECG superior é de 176 batimentos por minuto, e na tira de ECG inferior é de 250 batimentos por minuto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este teste de exercício animal de grande porte imita o teste usado em clínicas, reduzindo a lacuna nos desfechos entre os estudos pré-clínicos e os ensaios clínicos. Pode ser aplicado para avaliar a eficácia de novos tratamentos para doenças cardiovasculares graves, como arteriosclerose obliterante, insuficiência cardíaca e cardiopatias isquêmicas. Os momentos aplicados neste protocolo podem variar de acordo com o tratamento testado. Este protocolo foi padronizado com base em uma longa experiência de trabalho com animais de grande porte e pode ser usado para avaliar a segurança e eficácia da terapia gênica cardiovascular e outras novas abordagens terapêuticas.
O coração do porco e o sistema cardiovascular são semelhantes à fisiologia, anatomia e função humana. Portanto, porcos têm sido frequentemente utilizados para modelar mecanismos de doença cardiovascular e procedimentos terapêuticos17. O tempo de seguimento em nossos estudos com suínos foi de até 12 meses18; No entanto, o manejo dos animais torna-se cada vez mais desafiador à medida que eles crescem durante os longos períodos de acompanhamento.
Este método consiste em várias etapas críticas, que são essenciais para o sucesso do teste e impossíveis de corrigir posteriormente. Primeiro, os porcos têm diferenças individuais em sua motivação para correr. Motivar os animais para correr e manter motivação suficiente durante todo o teste é essencial. Isso garante que todos os pontos de tempo sejam comparáveis. Manter a motivação dos porcos para correr requer conhecimento específico de suas características comportamentais individuais. Os animais devem ser aclimatados à esteira e ao ambiente de teste antes do teste ergométrico. Os porcos são ensinados a ir na esteira, e suas performances bem-sucedidas são recompensadas. Outra maneira de aumentar sua motivação para correr é manter outros animais de teste no campo de visão do corredor.
Evitar falhas anatômicas típicas, como problemas nas pernas, é importante. As falhas anatômicas mais comuns são doenças do casco, deformidades congênitas dos membros e problemas causados por acidentes, como lacerações, lesões escapulares, fraturas e ferimentos. Estes se devem principalmente a habitats, acidentes, fatores hereditários e aberrações na alimentação19. Uma fraqueza nas pernas leva à caminhada descoordenada, impossibilitando a realização de testes de exercício. Além disso, se aparecer fraqueza nas pernas durante o estudo, o animal deve ser excluído do teste. Problemas nas pernas podem ser evitados escolhendo porcos com estruturas de pernas intactas. Durante a pesquisa, lesões nas pernas podem ser evitadas por ter boas condições no porquinho. Superfícies duras e corrosivas devem ser evitadas e a higiene geral deve ser mantida. Os porcos devem ser alimentados moderadamente para que não ganhem peso muito rapidamente, já que isso sobrecarrega suas pernas. Além disso, os porcos devem ser colocados em seus currais com cuidado para evitar acidentes, e eles devem ter estímulos suficientes, como brinquedos, para que sua mastigação não seja direcionada a outros porcos.
Durante o teste ergométrico, o ECG foi registrado com um ECG de 3 derivações ou gravador de loop implantável. Não é tão preciso quanto um ECG de 12 derivações, mas ainda pode avaliar múltiplas variáveis, como arritmias e frequência cardíaca. Vários tipos de erros e distúrbios podem falsificar ECGs. Por exemplo, eletrodos conectados incorretamente, mau contato entre a pele e os eletrodos e contrações musculares esqueléticas podem causar erros. Os eléctrodos devem permanecer firmemente no local durante todo o ensaio. Isso é desafiador, pois a pele esquenta e transpira durante a corrida. O contato entre a pele e os eletrodos pode ser melhorado raspando o cabelo, desinfetando e removendo as células mortas da pele. Além disso, o movimento dos músculos causa artefatos que afetam o ECG13. Isso pode desafiar a interpretação dos segmentos ST. Além disso, as derivações do ECG podem interferir na corrida. No entanto, esses problemas podem ser reduzidos tocando os eletrocardiogramas firmemente na pele. Os ECGs também podem ser registrados com um gravador de loop implantável ou marca-passo. O uso de um gravador de loop implantável resolve muitos problemas que o uso de ECG de 3 derivações tem. No entanto, a instalação do gravador de loop implantável é uma operação invasiva com riscos, como infecções.
Os pesquisadores devem observar o comportamento dos animais durante todo o teste para garantir a segurança geral do procedimento. Por exemplo, exaustão, fadiga intensa, náuseas, perda de consciência, dispneia grave ou pele cianótica são razões para encerrar o teste ergométrico. Além disso, os pesquisadores devem observar alterações no ECG, como arritmias. No entanto, com pessoal bem treinado e experiência suficiente trabalhando com animais de grande porte, o protocolo atual de exercícios pode ser rotineiramente utilizado em estudos pré-clínicos para produzir dados clinicamente relevantes que devem tornar a transição clínica de novas abordagens terapêuticas mais bem-sucedida em relação aos benefícios clínicos para os pacientes.
Poole et al.20 publicaram diretrizes para exercícios com animais e protocolos de treinamento para estudos cardiovasculares. Nesses protocolos, os porcos se exercitam em esteira por aproximadamente 30 min após o aquecimento. Durante esses 30 minutos, a zona de frequência cardíaca alvo para os animais de teste é de 65%-75% da frequência cardíaca máxima. A frequência cardíaca é modificada alterando a velocidade ou a inclinação da esteira. O protocolo de Poole et al., e o teste ergométrico de 15 min apresentados neste manuscrito apresentam múltiplas semelhanças, como o período de aclimatação, a necessidade de esteira, o peso dos animais de teste selecionados e o reforço positivo pela recompensa do animal após o exercício. Em ambos os protocolos, os animais de teste podem superar a capacidade da esteira, limitando o tempo de acompanhamento.
A principal diferença entre o protocolo descrito por Poole et al., e o teste ergométrico apresentado neste manuscrito, é o objetivo do teste. O protocolo descrito por Poole et al., destina-se a eliciar adaptações clássicas de treinamento observadas em humanos. Portanto, enfoca o exercício de intensidade moderada, enquanto o método de teste ergométrico de 15 min visa fazer um esforço próximo do máximo para melhor avaliar a aptidão cardiorrespiratória. Isso é alcançado quando o nível subjetivo de esforço é de aproximadamente 90% da frequência cardíaca máxima13. Um teste ergométrico de 15 min mimetiza o teste usado em clínicas, aumentando gradualmente o nível de esforço até que ele esteja próximo do máximo. Devido à diferença nos objetivos dos protocolos, a frequência de exercício dos animais de teste é diferente. descrevem que os porcos podem correr até quatro vezes por semana para obter melhores adaptações cardiovasculares causadas pelo exercício. O teste ergométrico de 15 min avalia a eficácia funcional da terapia gênica e de outras terapias novas, razão pela qual a frequência necessária é significativamente menor e depende das necessidades do tratamento. Um exemplo desses requisitos foi descrito na Figura 4.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
O autor gostaria de agradecer a Minna Törrönen, Riikka Venäläinen, Heikki Karhunen e Inkeri Niemi do National Laboratory Animal Center por sua assistência no trabalho com animais. Este estudo é apoiado pela Academia Finlandesa, ERC e CardioReGenix EU Horizon grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Defibrillator | Zoll M series | TO9K116790 | All portable defribrillators will work |
| Defibrillator pads | Philips | M3713A | All pads work, as long as the pads are compatible with the defibrillator |
| ECG electrodes | Several providers | Prefer ECG electrodes designed for exercise tests | |
| Loop recorder | Abbott Oy | DM3500 | Optional for rhythm monitoring |
| Patient monitor | Schiller Argus LCM Plus | 7,80,05,935 | All portable ecg monitors will work |
| Pigs | Emolandia Oy | ||
| Treadmill | NordicTrack | All treadmills with adjustable incline and speed are suitable for the exercise test. The treadmill should be as long and wide as possible. | |
| Ultrasound system | Philips EPIQ 7 ultrasound | ||
| Various building materials | Several providers | For building fences, ramps and gates according to the Figure 1 and Figure 2 | |
| Various treats for the animals |
References
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