Summary
Detta protokoll beskriver en testmodell för träning av stora djur för att bedöma det kardiovaskulära systemets funktionella kapacitet för att utvärdera effektiviteten av nya terapier i den prekliniska miljön. Det är jämförbart med ett kliniskt träningstest.
Abstract
Trots framstegen i behandlingar är hjärt-kärlsjukdomar fortfarande en av de största orsakerna till dödlighet och sjuklighet över hela världen. Genterapibaserad terapeutisk angiogenes är ett lovande tillvägagångssätt för behandling av patienter med signifikanta symtom, trots optimal farmakologisk terapi och invasiva procedurer. Men många lovande kardiovaskulära genterapitekniker har misslyckats med att uppnå förväntningarna i kliniska prövningar. En förklaring är en obalans mellan prekliniska och kliniska effektmått som används för att mäta effekt. I djurmodeller har tyngdpunkten vanligtvis legat på lätt kvantifierbara slutpunkter, såsom antalet och arean av kapillärkärlen beräknade från histologiska sektioner. Förutom dödlighet och sjuklighet är endpoints i kliniska prövningar subjektiva, såsom träningstolerans och livskvalitet. De prekliniska och kliniska effektmåtten mäter dock sannolikt olika aspekter av den tillämpade terapin. Ändå krävs båda typerna av slutpunkter för att utveckla framgångsrika terapeutiska metoder. På kliniker är huvudmålet alltid att lindra patienternas symtom och förbättra deras prognos och livskvalitet. För att uppnå bättre prediktiva data från prekliniska studier måste endpoint-måtten vara bättre anpassade till de i kliniska studier. Här introducerar vi ett protokoll för ett kliniskt relevant löpbandsövningstest på grisar. Denna studie syftar till att: (1) tillhandahålla ett tillförlitligt träningstest på grisar som kan användas för att utvärdera säkerheten och den funktionella effekten av genterapi och andra nya terapier, och (2) bättre matcha effektmåtten mellan prekliniska och kliniska studier.
Introduction
Kroniska hjärt- och kärlsjukdomar är betydande orsaker till dödlighet och sjuklighet i världen 1,2. Även om nuvarande behandlingar är effektiva för majoriteten av patienterna, kan många fortfarande inte dra nytta av de nuvarande terapierna på grund av till exempel diffus kronisk sjukdom eller comorbiditeter. Dessutom lindras inte hjärtsymtomen hos vissa patienter av tillgängliga behandlingar, och deras hjärt-kärlsjukdom fortskrider trots optimal medicinsk behandling3. Det finns därför ett tydligt behov av att utveckla nya behandlingsalternativ för allvarliga hjärt-kärlsjukdomar.
Under de senaste åren har nya molekylära vägar och sätt att manipulera dessa mål upptäckts, vilket gör genterapi, cellterapi och andra nya terapier till ett realistiskt alternativ för behandling av allvarliga hjärt-kärlsjukdomar4. Men efter lovande prekliniska resultat har många kardiovaskulära applikationer misslyckats med att uppfylla förväntningarna i kliniska prövningar. Trots den dåliga effekten i kliniska prövningar har flera studier etablerat goda säkerhetsprofiler för nya terapier 5,6,7,8,9. Att introducera nya kardiovaskulära terapier till patienter kommer därför att kräva förbättrade tillvägagångssätt och bättre prekliniska modeller, studieinställningar och slutpunkter i prekliniska studier som kan förutsäga klinisk effekt.
I djurmodeller har tonvikten vanligtvis legat på lätt kvantifierbara effektmått, såsom antalet och arean av kapillärkärl beräknat från histologiska sektioner eller parametrar från vänster kammare avbildning i vila och under farmakologisk stress. I kliniska prövningar har många effektmått varit mer subjektiva, såsom träningstolerans eller symtomlindring4. Således är det troligt att effektmåtten i prekliniska studier och kliniska prövningar mäter olika aspekter av den tillämpade terapin. Till exempel korrelerar en ökning av mängden blodkärl inte alltid med bättre perfusion, hjärtfunktion eller träningstolerans. Båda typerna av endpoints krävs dock för att utveckla framgångsrika terapeutiska metoder10. Ändå är huvudmålet alltid att lindra symtomen och förbättra patientens prognos och livskvalitet. För att uppnå detta måste effektmåtten matchas bättre mellan prekliniska och kliniska studier4.
Kardiorespiratorisk kondition återspeglar cirkulations- och andningsorganens förmåga att ge syre under långvarig fysisk aktivitet, och därmed kvantifierar den funktionella kapaciteten hos en individ. Funktionsförmåga är en viktig prognostisk markör eftersom det är en stark oberoende prediktor för risken för kardiovaskulär dödlighet och dödlighet av alla orsaker11. Förbättringar i kardiorespiratorisk kondition är förknippade med en minskad risk för dödlighet12. Träningstester är lämpliga för att utvärdera aerob prestanda och behandlingssvar vid hjärt-kärlsjukdomar. Beroende på tillgängligheten utförs tester på en cykelergometer eller ett löpband. En gradvis ökning av arbetsbelastningen per minut används vanligtvis och plötsliga ökningar undviks. Detta leder till ett linjärt fysiologiskt svar. De viktigaste variablerna i träningstesterna inkluderar den totala träningstiden, uppnådda metaboliska ekvivalenter (MET), hjärtfrekvens och förändringar på en elektrokardiogramlinje (EKG) mellan QRS-komplexet (Q-, R- och S-vågor) och T-våg (ST-segmentet). Kliniska stresstester har låga kostnader och är lättillgängliga13. Av dessa skäl har stresstester, såsom 6 minuters gångtest, använts i stor utsträckning i kliniker och bör också användas vid preklinisk utvärdering av nya terapier.
Såvitt vi vet finns det inga väl beskrivna stordjursmodeller för att utvärdera den funktionella effekten av genterapi eller andra nya terapier. Därför ger det kliniskt relevanta träningstestet ett utmärkt perspektiv för att utvärdera effektiviteten av dessa nya terapier i den prekliniska miljön.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla försök är godkända av Djurförsöksnämnden vid Östra Finlands universitet. Detta protokoll beskriver ett kliniskt relevant löpbandsträningstest för grisar för att utvärdera säkerheten och effekten av nya terapier för hjärtsjukdomar. Tamgrisar av honkön som väger 25-80 kg användes i den aktuella studien. Djuren erhölls från en kommersiell källa (se Materialförteckning).
1. Ställa in löparbanan
- Ställ in löparbanan så att djuren bara kan röra sig åt ett håll. Använd grindar och luckor för att förhindra att djuren flyttar tillbaka. Löparbanans planritning visas i figur 1 och ett exempel på en löparbana i figur 2.
- Se till att löpbandet (se materialförteckning) har tillräckligt med utrymme för att tillåta lutningsändringar.
- Se till att löpbandet har en justerbar bredd för att förhindra att djuret vrider sig under körningen.
- Använd transparent plast för att göra löpbandets främre vägg. Detta förhindrar att djuret springer bort från löpbandet, men låter fortfarande djuret se genom väggen.
OBS: Det är viktigt att djuren kan se genom framväggen, eftersom vår erfarenhet tyder på att grisar är mer motiverade att springa om de ser sina medgrisar på andra sidan väggen. - Placera en EKG-monitor och defibrillator (se Materialförteckning) bredvid löpbandet.
OBS: Dödliga arytmier kan inträffa under stresstestet, särskilt om grisen har myokardischemi14,15,16. - Se till att löparbanan innehåller en vattenpunkt där djuren kan dricka och svalka sig efter körningen.
2. Acklimatiseringsperiod för svinen före testet
- Hus djuren i 2 veckor innan försöken påbörjas.
- Under den 1: a veckan av acklimatisering, se till att djuren vänjer sig vid sina hanterare och ny bostadsmiljö, exklusive löparbanan.
- Under den 2: a veckan av acklimatiseringsperioden, se till att djuren blir vana vid löparbanan.
- Börja vänja så att djuren blir bekanta med löparbanan. Håll först alla grindar öppna, så att djuren kan gå fritt på banan och utforska miljön.
- När djuren är mer bekanta med banan, slå på löpbandet och låt djuret springa korta perioder åt gången, till exempel 7 min. Längden på körtiderna måste förlängas dagligen.
OBS: Kom ihåg att belöna djuren under acklimatiseringsperioden. Till exempel belönades grisarna med osaltade popcorn i den aktuella studien.
3. Övningstestet
OBS: Grisar ska fastas minst 2 timmar före träningstestet eller ges endast en liten portion mat före körningen.
- Slå på löpbandet och ställ lutningen till 5% -10%.
- Så snart djuret är på löpbandet, starta löpbandet med en starthastighet på 2 km / h.
- Öka hastigheten med 0,5 km/h var 60:e sekund tills 5 km/h uppnås. Den totala speltiden är 15 min.
- Om djuret inte kan springa hela tiden med maximal hastighet, utför stegen nedan.
- Om grisen inte springer så fort som en vald hastighet, tryck försiktigt på den bakifrån, eftersom det kan ge djuret en känsla av att det behöver springa snabbare utan att sakta ner.
- Försök försiktigt trycka djuret högst tre gånger; Därefter sänks hastigheten med 0,5 km/h i taget tills grisen klarar av hastigheten. Sakta inte ner till under 2 km/h.
- Om djuret vägrar att springa även med långsam hastighet, stäng av löpbandet och stoppa testet.
4. EKG-övervakning under träningstestet
- Placera EKG-elektroder (se materialförteckning) på anatomiska platser som har minimal rörelse under körningen, såsom skulderblad eller bröstkorgen.
OBS: Använd EKG-elektroder avsedda för träningstester för att uppnå bättre vidhäftning till huden. Kom ihåg att raka hår från området där EKG-elektroderna ska placeras. - Registrera hjärtfrekvensförändringarna under körningen.
OBS: Vår erfarenhet tyder på att ST-segmentanalyser ofta är komplicerade på grund av rörelse och andra artefakter. Rytmövervakning kan också göras med hjälp av en implanterbar slinginspelare eller pacemaker.
5. Insamling av uppgifter
- Registrera körsträcka, total tid och hastighet varje gång hastigheten ändras.
OBS: Moderna löpband kan samla in mycket annan data, så det är viktigt att bekanta dig med löpbandshandboken för att utnyttja utrustningens fulla potential. - Observera eventuella förändringar i djurbeteende, såsom haltning.
OBS: Om det behövs, kontakta en veterinär och se till att djuret får nödvändig smärtlindring. Ta bort djuret från framtida övningar tills det återhämtar sig helt.
6. Vård efter procedur
- Se till att djuret har tillgång till vattenpunkten.
- Belöna djuret, till exempel med godis eller leksaker.
- Övervaka djuret i 30 minuter efter körningen för eventuella biverkningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Man måste ha erfarenhet av att arbeta med stora djur för att lyckas med detta protokoll. Forskare måste kunna utvärdera om ett djur slutar springa på grund av trötthet eller brist på motivation. Registrering av hastighet och avstånd kan hjälpa till att utvärdera detta, eftersom djur som saknar motivation vanligtvis slutar springa helt, medan trötta djur fortsätter att springa efter att ha sänkt hastigheten (figur 3). Vid behov kan protokollet upprepas nästa dag om resultaten verkar opålitliga.
En representativ tidslinje för adenoassocierade virus (AAV)-behandlade djur visas i figur 4. Tidslinjen kan variera beroende på studieinställningen, särskilt när det gäller offertidpunkten. Observera acklimatiseringsperioden när du planerar experimenten.
Resultaten kan jämföras med andra organstruktur- och funktionsmätningar, såsom hjärteko, för att se hur träningstolerans relaterar till dessa andra mätningar. Till exempel korrelerar förändringen i körsträcka med förändringen i ejektionsfraktionen. Med en låg ejektionsfraktion kan ett djur inte springa med full hastighet under hela träningstestet (figur 5). Analyserade variabler kan variera beroende på studieinställningarna. Detta protokoll möjliggör jämförelse av total löpsträcka, hastighetsvariation, MET, hjärtfrekvensvariation och arytmier.
EKG registreras under övningstestet (figur 6). ST-segmentanalys är svår på grund av artefakter. Förändringar i pulsintervall kan mätas från EKG under hela träningstestet.
Figur 1: Planritning över löparbanan. Platsen för djur som inte springer är markerad med (A). Ett djur i taget leds till löpbandet [zon (C)] genom en korridor (B). Grinden mellan zonerna A och B är stängd för att säkerställa att endast ett djur åt gången går till löparbanan och att de andra djuren stannar i zon A. Det är viktigt att andra djur stannar i zon (A), eftersom djuret på löpbandet kan se de andra djuren i zon (A), vilket motiverar dem att springa. Grinden mellan löpbandet och zon (B) är stängd för att säkerställa att djuret inte kan backa från löpbandet. Löpbandet manövreras från zon (D) och djuret återförs till zon (A) genom zon (D) efter körningen. I förevarande fall installeras en vattenpunkt där djuren kan dricka och svalka sig efter rastgården i zon A. Symboler: svarta pilar anger rotationsriktningen och kvartscirklar indikerar grindar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representativa bilder av löparbanan . A) Betydelsen av endast en tillgänglig väg för djuren. (B) Löpbandet, som bör ha en justerbar bredd för att förhindra att djuren vänder sig under körningen. c) Ett slutet utrymme avsett för ett annat djur utöver det springande djuret. Djur är mer motiverade att springa när de ser en medlem av deras art. d) Ett exempel på en vattenpunkt för djuren där djuren kan svalka sig och dricka efter stresstestet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Löpsträcka och hastighet. A) Representativa uppgifter från de totala löpsträckorna för fyra friska svin. Den genomsnittliga totala löpsträckan för försöksdjuren var 970 m och standardavvikelsen för de totala avstånden var 80 m. (B) Uppgifter om hastighetsvariation mellan svin. Hastigheten sänks med 0,5 km/h intervaller tills grisen klarar hastigheten. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 4: Representativ tidslinje. Observera att tidpunkterna kan variera mellan studierna. Det är dock anmärkningsvärt att djur ska anlända till laboratoriedjurcentret 3 veckor innan experimentet påbörjas på grund av acklimatiseringsperioden. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Korrelation mellan körsträckan och förändringen i ejektionsfraktionen. Korrelation mellan förändringen i körsträcka och förändringen i ejektionsfraktion. Ejektionsfraktionen i vila mättes med Biplane Simpon-metoden. Förändringen i ejektionsfraktion från baslinjen korrelerar med förändringen i körsträckan hos grisar med pacemakerinducerad hjärtsvikt, med r = 0,2831, p = 0,0284 ochR2 = 0,0801. Trots de låga r- ochR2-nivåerna tenderar förändringen i ejektionsfraktionsprocenten för vänster kammare (LVEF%) att påverka körsträckorna. Det är viktigt att notera att flera faktorer påverkar de uppmätta variablerna, vilket påverkar resultaten. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Representativa EKG-band för en frisk gris. Den övre EKG-panelen visar ett EKG 3 minuter efter träningstestets början. Den nedre EKG-remsan visar ett EKG efter att ha körts i 10 minuter. EKG kan användas för att utvärdera skillnaderna i försöksdjurens hjärtfrekvens. Hjärtfrekvensen på den övre EKG-panelen är 176 slag per minut och på den nedre EKG-remsan är 250 slag per minut. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta stora djurövningstest efterliknar testet som används i kliniker, vilket minskar klyftan i slutpunkter mellan de prekliniska studierna och kliniska prövningar. Det kan tillämpas för att utvärdera effekten av nya behandlingar för allvarliga hjärt-kärlsjukdomar, såsom åderförkalkning obliterans, hjärtsvikt och ischemiska hjärtsjukdomar. Tidpunkterna som tillämpas i detta protokoll kan variera beroende på den testade behandlingen. Detta protokoll har standardiserats baserat på en lång erfarenhet av att arbeta med stora djur och kan användas för att utvärdera säkerheten och effekten av kardiovaskulär genterapi och andra nya terapeutiska metoder.
Grishjärtat och hjärt-kärlsystemet liknar mänsklig fysiologi, anatomi och funktion. Därför har grisar ofta använts för att modellera kardiovaskulära sjukdomsmekanismer och terapeutiska procedurer17. Uppföljningstiden i våra grisstudier har varit upp till 12 månader18; Hanteringen av djuren blir dock allt mer utmanande när de växer under de långa uppföljningsperioderna.
Denna metod består av olika kritiska steg, som är väsentliga för testets framgång och omöjliga att korrigera efteråt. För det första har grisar individuella skillnader i sin löpmotivation. Att få djuren motiverade att springa och upprätthålla tillräcklig motivation under hela testet är viktigt. Detta säkerställer att alla tidpunkter är jämförbara. För att upprätthålla grisarnas löpmotivation krävs specifik kunskap om deras individuella beteendeegenskaper. Djuren måste vänjas vid löpbandet och testmiljön före träningstestet. Grisar lärs att gå på löpbandet, och deras framgångsrika prestationer belönas. Ett annat sätt att öka sin löpmotivation är att hålla andra försöksdjur i löparens synfält.
Att undvika typiska anatomiska brister, såsom olika benproblem, är viktigt. De vanligaste anatomiska bristerna är hovsjukdomar, medfödda lemdeformiteter och problem orsakade av olyckor, såsom sårskador, skulderbladsskador, frakturer och sår. Dessa beror främst på livsmiljöer, olyckor, ärftliga faktorer och avvikelser vid utfodring19. En svaghet i benen leder till okoordinerad gång, vilket gör det omöjligt att delta i träningstester. Om bensvaghet uppträder under studien måste djuret också uteslutas från testet. Benproblem kan undvikas genom att välja grisar med intakta benstrukturer. Under forskningen kan benskador förebyggas genom att ha goda förhållanden i grisen. Hårda, frätande ytor måste undvikas och allmän hygien måste upprätthållas. Grisar måste matas måttligt så att de inte blir viktiga för snabbt, eftersom detta anstränger benen. Dessutom måste grisar placeras i sina pennor noggrant för att undvika olyckor, och de bör ha tillräckligt med stimuli, till exempel leksaker, så att deras tuggning inte riktas mot andra grisar.
Under träningstestet registrerades EKG med ett 3-avlednings-EKG eller implanterbar slingspelare. Det är inte lika exakt som ett 12-avlednings-EKG, men kan fortfarande bedöma flera variabler, såsom arytmier och hjärtfrekvens. Flera typer av fel och störningar kan förfalska EKG. Till exempel kan felaktigt anslutna elektroder, dålig kontakt mellan huden och elektroderna och skelettmuskelkontraktioner orsaka fel. Elektroderna måste förbli stadigt på plats under hela testet. Detta är utmanande eftersom huden värms upp och svettas under löpning. Kontakten mellan huden och elektroderna kan förbättras genom att raka hår, desinficera och ta bort döda hudceller. Dessutom orsakar rörelsen av muskler artefakter som påverkar EKG13. Detta kan utmana tolkningen av ST-segment. Dessutom kan EKG-ledningar störa körningen. Dessa problem kan dock minskas genom att knacka på EKG-ledningarna ordentligt på huden. EKG kan också registreras med en implanterbar slinginspelare eller pacemaker. Att använda en implanterbar slinginspelare löser många problem som 3-avlednings EKG-användning har. Att installera den implanterbara slingspelaren är dock en invasiv operation med risker, såsom infektioner.
Forskare måste observera djurens beteende under hela testet för att säkerställa procedurens övergripande säkerhet. Till exempel är utmattning, svår trötthet, illamående, medvetslöshet, svår dyspné eller cyanotisk hud skäl för att avsluta träningstestet. Forskare måste också observera förändringar i EKG, såsom arytmier. Men med välutbildad personal och tillräcklig erfarenhet av att arbeta med stora djur kan det nuvarande träningsprotokollet rutinmässigt användas i prekliniska studier för att producera kliniskt relevanta data som bör göra den kliniska övergången av nya terapeutiska metoder mer framgångsrik när det gäller kliniska fördelar för patienterna.
Poole et al.20 har publicerat riktlinjer för djurträning och träningsprotokoll för kardiovaskulära studier. I dessa protokoll tränar grisar på ett löpband i cirka 30 minuter efter uppvärmningen. Under dessa 30 minuter är målpulszonen för försöksdjuren 65–75 % av maxpulsen. Hjärtfrekvensen modifieras antingen genom att ändra löpbandets hastighet eller lutning. Protokollet från Poole et al. och det 15 minuters träningstest som presenteras i detta manuskript har flera likheter, såsom acklimatiseringsperioden, löpbandskrav, vikten hos utvalda försöksdjur och positiv förstärkning genom att belöna djuret efter träningen. I båda protokollen kan försöksdjuren växa ur löpbandets kapacitet, vilket begränsar uppföljningstiden.
Huvudskillnaden mellan protokollet som beskrivs av Poole et al. och övningstestet som presenteras i detta manuskript är syftet med testningen. Protokollet som beskrivs av Poole et al. är utformat för att framkalla klassiska träningsanpassningar som noteras hos människor. Därför fokuserar den på träning med måttlig intensitet, medan 15 minuters träningstestmetod syftar till att göra en nästan maximal ansträngning för att bättre utvärdera kardiorespiratorisk kondition. Detta uppnås när den subjektiva ansträngningsnivån är cirka 90% av den maximala hjärtfrekvensen13. Ett 15 minuters träningstest efterliknar testet som används i kliniker genom att gradvis öka ansträngningsnivån tills den är nära maximal. På grund av skillnaderna i protokollens syften skiljer sig försöksdjurens träningsfrekvens åt. Poole et al. beskriver att grisar kan springa upp till fyra gånger i veckan för att uppnå bättre kardiovaskulära anpassningar orsakade av träning. Övningstestet på 15 minuter utvärderar den funktionella effekten av genterapi och andra nya terapier, varför den erforderliga frekvensen är betydligt lägre och beror på behandlingens krav. Ett exempel på dessa krav har beskrivits i figur 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Författaren vill tacka Minna Törrönen, Riikka Venäläinen, Heikki Karhunen och Inkeri Niemi från Statens försöksdjurscenter för deras hjälp med djurarbete. Studien stöds av Finlands Akademi, ERC och CardioReGenix EU Horizon-bidrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Defibrillator | Zoll M series | TO9K116790 | All portable defribrillators will work |
| Defibrillator pads | Philips | M3713A | All pads work, as long as the pads are compatible with the defibrillator |
| ECG electrodes | Several providers | Prefer ECG electrodes designed for exercise tests | |
| Loop recorder | Abbott Oy | DM3500 | Optional for rhythm monitoring |
| Patient monitor | Schiller Argus LCM Plus | 7,80,05,935 | All portable ecg monitors will work |
| Pigs | Emolandia Oy | ||
| Treadmill | NordicTrack | All treadmills with adjustable incline and speed are suitable for the exercise test. The treadmill should be as long and wide as possible. | |
| Ultrasound system | Philips EPIQ 7 ultrasound | ||
| Various building materials | Several providers | For building fences, ramps and gates according to the Figure 1 and Figure 2 | |
| Various treats for the animals |
References
- Virani, S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), e139 (2020).
- Townsend, N., et al.
- Knuuti, J., et al. 2019 ESC Guidelines for the diagnosis and management of chronic coronary syndromes: The Task Force for the diagnosis and management of chronic coronary syndromes of the European Society of Cardiology (ESC). European Heart Journal. 41 (3), 407-477 (2020).
- Ylä-Herttuala, S., Baker, A. H. Cardiovascular gene therapy: past, present, and future. Molecular Therapy. 25 (5), 1096-1106 (2017).
- Hedman, M., et al. Eight-year safety follow-up of coronary artery disease patients after local intracoronary VEGF gene transfer. Gene Therapy. 16 (5), 629-634 (2009).
- Rosengart, T. K., et al. Long-term follow-up of a phase 1 trial of angiogenic gene therapy using direct intramyocardial administration of an adenoviral vector expression the VEGF121 cDNA for the treatment of diffuse coronary artery disease. Human Gene Therapy. 24 (2), 203-208 (2013).
- Muona, K., Mäkinen, K., Hedman, M., Manninen, H., Ylä-Herttuala, S. 10-year safety follow-up in patients with local VEGF gene transfer to ischemic lower limb. Gene Therapy. 19 (4), 392-395 (2012).
- Leikas, A. J., et al. Long-term safety and efficacy of intramyocardial adenovirus-mediated VEGF-DΔNΔC gene therapy eight-year follow-up of phase I KAT301 study. Gene Therapy. 29 (5), 289-293 (2022).
- Telukuntla, K. S., Suncion, V. Y., Schulman, U. H., Hare, J. M. The advancing field of cell-based therapy: insights and lessons from clinical trials. Journal of the American Heart Association. 2 (5), e000338 (2013).
- Ylä-Herttuala, S., Bridges, C., Katz, M. G., Korpisalo, P. Angiogenic gene therapy in cardiovascular diseases: dream or vision. European Heart Journal. 38 (18), 1365-1371 (2017).
- Lähteenvuo, J., Ylä-Herttuala, S. Advances and challenges in cardiovascular gene therapy. Human Gene Therapy. 28 (11), 1024-1032 (2017).
- Ross, R., et al. Importance of assessing cardiorespiratory fitness in clinical practice: a case for fitness as a clinical vital sign: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 134 (24), e653-e699 (2016).
- Sietsema, K. E., Stringer, W. W., Sue, D. Y., Ward, S. Wasserman & Whipp's Principles of Exercise Testing and Interpretation. 6th. , Wolters Kluwer. Philadelphia. (2021).
- Darmadi, M. A., et al. Exercise-induced sustained ventricular tachycardia without structural heart disease: a case report. The American Journal of Case Reports. 21, e928242 (2020).
- Casella, G., Pavesi, P. C., Sangiorgio, P., Rubboli, A., Bracchetti, D. Exercise-induced ventricular arrhythmias in patients with healed myocardial infarction. International Journal of Cardiology. 40 (3), 229-235 (1993).
- Gimeno, J. R., et al. Exercise-induced ventricular arrhythmias and risk of sudden cardiac death in patients with hypertrophic cardiomyopathy. European Heart Journal. 30 (21), 2599-2605 (2009).
- Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (5), 432-438 (2014).
- Korpela, H., et al. AAV2-VEGF-B gene therapy failed to induce angiogenesis in ischemic porcine myocardium due to inflammatory responses. Gene Therapy. 29 (10-11), 643-652 (2022).
- Swindle, M. M. Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging, and Experimental Techniques. 2nd edition. , CRC Press. Taylor & Francis Group. (2007).
- Poole, D. C., et al. Guidelines for animal exercise and training protocols for cardiovascular studies. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), H1100-H1138 (2020).
