Summary
Den nåværende protokollen beskriver en stor dyretreningstestmodell for å vurdere kardiovaskulærsystemets funksjonelle kapasitet for å evaluere effektiviteten av nye terapier i preklinisk setting. Det kan sammenlignes med en klinisk treningstest.
Abstract
Til tross for fremgang i behandlinger, er kardiovaskulære sykdommer fortsatt en av de største årsakene til dødelighet og sykelighet over hele verden. Genterapibasert terapeutisk angiogenese er en lovende tilnærming for behandling av pasienter med signifikante symptomer, til tross for optimal farmakologisk terapi og invasive prosedyrer. Imidlertid har mange lovende kardiovaskulære genterapiteknikker ikke klart å oppnå forventningene i kliniske studier. En forklaring er manglende samsvar mellom prekliniske og kliniske endepunkter som brukes for å måle effekt. I dyremodeller har hovedvekten vanligvis vært på lett kvantifiserbare endepunkter, som antall og areal av kapillærkarene beregnet fra histologiske seksjoner. Bortsett fra dødelighet og sykelighet er endepunkter i kliniske studier subjektive, som treningstoleranse og livskvalitet. Imidlertid måler de prekliniske og kliniske endepunktene sannsynligvis forskjellige aspekter ved den anvendte terapien. Likevel er begge typer endepunkter nødvendige for å utvikle vellykkede terapeutiske tilnærminger. I klinikker er hovedmålet alltid å lindre pasientens symptomer og forbedre prognosen og livskvaliteten. For å oppnå bedre prediktive data fra prekliniske studier må endepunktmålinger samsvare bedre med målingene i kliniske studier. Her introduserer vi en protokoll for en klinisk relevant treningstest på tredemølle hos gris. Denne studien tar sikte på å: (1) gi en pålitelig treningstest hos griser som kan brukes til å evaluere sikkerheten og funksjonell effekt av genterapi og andre nye terapier, og (2) bedre matche endepunktene mellom prekliniske og kliniske studier.
Introduction
Kroniske hjerte- og karsykdommer er viktige årsaker til dødelighet og sykelighet på verdensbasis 1,2. Selv om dagens behandlinger er effektive for de fleste pasienter, er det fortsatt mange som ikke kan dra nytte av dagens behandling på grunn av for eksempel diffus kronisk sykdom eller komorbiditeter. I tillegg, hos noen pasienter, blir hjertesymptomer ikke lettet av de tilgjengelige behandlingene, og deres kardiovaskulære sykdom utvikler seg til tross for optimal medisinsk behandling3. Det er derfor et klart behov for å utvikle nye behandlingsmuligheter for alvorlige hjerte- og karsykdommer.
I løpet av de siste årene har nye molekylære veier og måter å manipulere disse målene blitt oppdaget, noe som gjør genterapi, celleterapi og andre nye terapier til et realistisk alternativ for behandling av alvorlige kardiovaskulæresykdommer. Men etter lovende prekliniske resultater har mange kardiovaskulære applikasjoner ikke klart å oppfylle forventningene i kliniske studier. Til tross for dårlig effekt i kliniske studier, har flere studier etablert gode sikkerhetsprofiler for nye terapier 5,6,7,8,9. Dermed vil det å bringe nye kardiovaskulære terapier til pasienter kreve forbedrede tilnærminger og bedre prekliniske modeller, studieinnstillinger og endepunkter i prekliniske studier som kan forutsi klinisk effekt.
I dyremodeller har det vanligvis vært lagt vekt på lett kvantifiserbare endepunkter, som antall og areal av kapillærkar beregnet ut fra histologiske snitt eller parametere fra venstre ventrikkelavbildning i hvile og under farmakologisk stress. I kliniske studier har mange endepunkter vært mer subjektive, for eksempel treningstoleranse eller symptomlindring4. Det er derfor sannsynlig at endepunktene i prekliniske studier og kliniske studier måler ulike aspekter ved anvendt terapi. For eksempel korrelerer en økning i mengden blodkar ikke alltid med bedre perfusjon, hjertefunksjon eller treningstoleranse. Likevel er begge typer endepunkter nødvendige for å utvikle vellykkede terapeutiske tilnærminger10. Likevel er hovedmålet alltid å lindre symptomer og å forbedre pasientens prognose og livskvalitet. For å oppnå dette må endepunktsmålinger samsvare bedre mellom prekliniske og kliniske studier4.
Kardiorespiratorisk kondisjon gjenspeiler sirkulasjons- og respirasjonssystemets evne til å gi oksygen under vedvarende fysisk aktivitet, og kvantifiserer dermed den funksjonelle kapasiteten til et individ. Funksjonsevne er en viktig prognostisk markør da den er en sterk uavhengig prediktor for risiko for kardiovaskulær dødelighet og dødelighet av alle årsaker11. Forbedringer i kardiorespiratorisk kondisjon er forbundet med redusert risiko for dødelighet12. Treningstester er egnet for å evaluere aerob ytelse og behandlingsrespons i kardiovaskulære sykdommer. Avhengig av tilgjengeligheten utføres tester på sykkelergometer eller tredemølle. En gradvis økning i arbeidsbelastningen per minutt brukes vanligvis, og brå økninger unngås; Dette fører til en lineær fysiologisk respons. De viktigste variablene i treningstestene inkluderer total treningstid, metabolske ekvivalenter (MET) oppnådd, hjertefrekvens og endringer på en elektrokardiogramlinje (EKG) mellom QRS-komplekset (Q-, R- og S-bølger) og T-bølge (ST-segmentet). Kliniske stresstester har lave kostnader og er lett tilgjengelige13. Av disse grunner har stresstester, som 6 min gangtest, blitt mye brukt i klinikker og bør også brukes i preklinisk evaluering av nye terapier.
Så vidt vi vet, finnes det ingen velbeskrevne store dyremodeller for å evaluere funksjonell effekt av genterapi eller andre nye terapier. Derfor gir den klinisk relevante treningstesten et utmerket perspektiv for å evaluere effektiviteten av disse nye terapiene i preklinisk setting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter er godkjent av Animal Experiment Board ved Universitetet i Øst-Finland. Denne protokollen beskriver en klinisk relevant treningstest for tredemølle for griser for å evaluere sikkerheten og effekten av nye terapier for hjertesykdommer. Kvinnelige tamsvin som veier 25-80 kg ble brukt til denne studien. Dyrene ble hentet fra en kommersiell kilde (se materialtabell).
1. Sette opp løpebanen
- Sett opp løpebanen slik at dyrene bare kan bevege seg én vei. Bruk porter og luker for å hindre at dyrene beveger seg tilbake. Plantegningen av løpebanen er vist i figur 1, og et eksempel på en løpebane er i figur 2.
- Forsikre deg om at tredemøllen (se materialfortegnelse) har nok plass til å tillate skråningsendringer.
- Sørg for at tredemøllen har en justerbar bredde for å forhindre at dyret snur seg under løpet.
- Bruk gjennomsiktig plast til å lage frontveggen på tredemøllen. Dette forhindrer dyret i å løpe vekk fra tredemøllen, men lar fortsatt dyret se gjennom veggen.
MERK: Det er viktig at dyrene kan se gjennom frontveggen, da vår erfaring tilsier at griser er mer motiverte til å løpe hvis de ser sine medgriser på den andre siden av veggen. - Plasser en EKG-monitor og defibrillator (se materialfortegnelse) ved siden av tredemøllen.
MERK: Fatale arytmier kan oppstå under stresstesten, spesielt hvis grisen har myokardiskemi14,15,16. - Sørg for at løpebanen inneholder et vannpunkt hvor dyrene kan drikke og kjøle seg ned etter løpeturen.
2. Akklimatiseringsperiode for grisene før testen
- Hus dyrene i 2 uker før du starter forsøkene.
- I løpet av 1. akklimatiseringsuke, sørg for at dyrene blir vant til sine handlere og nytt boligmiljø, unntatt løpebanen.
- I løpet av den andre uken av akklimatiseringsperioden, sørg for at dyrene blir vant til løpebanen.
- Begynn å vane slik at dyrene blir kjent med løpebanen. Hold først alle portene åpne, slik at dyrene kan gå fritt på sporet og utforske miljøet.
- Når dyrene er mer kjent med sporet, slå på tredemøllen og la dyret løpe i korte perioder av gangen, for eksempel 7 min. Lengden på kjøretidene må forlenges daglig.
MERK: Husk å belønne dyrene i akklimatiseringsperioden. For eksempel ble grisene belønnet med usaltet popcorn i denne studien.
3. Treningstesten
MERK: Griser bør fastes minst 2 timer før treningstesten eller bare gis en liten porsjon mat før løpet.
- Slå på tredemøllen og sett stigningen til 5% -10%.
- Så snart dyret er på tredemøllen, start tredemøllen med en starthastighet på 2 km/t.
- Øk hastigheten med 0,5 km/t hver 60 s til 5 km/t er nådd. Total kjøretid er 15 min.
- Hvis dyret ikke kan løpe hele tiden med maksimal hastighet, utfør trinnene nedenfor.
- Hvis grisen ikke løper så fort som en valgt hastighet, skyv den forsiktig fra baksiden, da dette kan gi dyret følelsen av at det trenger å løpe raskere uten å bremse.
- Prøv forsiktig å skyve dyret maksimalt tre ganger; Deretter senker du hastigheten med 0,5 km/t om gangen til grisen takler hastigheten. Ikke senk farten til under 2 km/t.
- Hvis dyret nekter å løpe selv i lav hastighet, slå av tredemøllen og stopp testen.
4. EKG-overvåking under treningstesten
- Plasser EKG-elektroder (se materialfortegnelse) på anatomiske steder som har minimal bevegelse under løpeturen, for eksempel scapulas eller brystet.
MERK: Bruk EKG-elektroder designet for treningstester for å oppnå bedre vedheft til huden. Husk å barbere håret fra området der EKG-elektrodene skal plasseres. - Registrer hjertefrekvensendringene under løpet.
MERK: Vår erfaring tilsier at ST-segmentanalyser ofte er kompliserte på grunn av bevegelse og andre artefakter. Rytmeovervåking kan også gjøres ved hjelp av en implanterbar sløyfeopptaker eller pacemaker.
5. Innsamling av opplysninger
- Registrer løpeavstand, total tid og hastighet hver gang hastigheten endres.
MERK: Moderne tredemøller kan samle inn mange andre data, så det er viktig å gjøre deg kjent med tredemøllehåndboken for å utnytte utstyrets fulle potensiale. - Legg merke til mulige endringer i dyreadferd, for eksempel limping.
MERK: Hvis nødvendig, kontakt en veterinær og sørg for at dyret får nødvendig analgesi. Fjern dyret fra fremtidige øvelser til det gjenoppretter helt.
6. Post-prosessuell omsorg
- Sørg for at dyret har tilgang til vannpunktet.
- Belønn dyret, for eksempel med godbiter eller leker.
- Overvåk dyret i 30 minutter etter løpet for mulige bivirkninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Man må ha erfaring med å jobbe med store dyr for å lykkes med denne protokollen. Forskere må kunne vurdere om et dyr slutter å løpe på grunn av tretthet eller mangel på motivasjon. Registrering av hastighet og distanse kan bidra til å evaluere dette, da dyr som mangler motivasjon vanligvis slutter å løpe helt, mens trøtte dyr fortsetter å løpe etter å ha senket hastigheten (figur 3). Om nødvendig kan protokollen gjentas neste dag hvis resultatene virker upålitelige.
En representativ tidslinje for adenoassosiert virus (AAV)-behandlede dyr er vist i figur 4. Tidslinjen kan variere avhengig av studieinnstillingen, spesielt med hensyn til sakrifikasjonstidspunktet. Legg merke til akklimatiseringsperioden når du planlegger forsøkene.
Resultatene kan sammenlignes med andre organstruktur og funksjonsmålinger, for eksempel hjerteekko, for å se hvordan treningstoleranse relaterer seg til disse andre målingene. For eksempel korrelerer endringen i løpsavstand med endringen i ejeksjonsfraksjon. Med lav ejeksjonsfraksjon kan ikke et dyr løpe i full fart gjennom hele treningstesten (figur 5). Analyserte variabler kan variere avhengig av studieinnstillingene. Denne protokollen gjør det mulig å sammenligne total løpedistanse, hastighetsvariasjon, MET, hjertefrekvensvariasjon og arytmier.
EKG registreres under treningstesten (figur 6). ST-segmentanalyse er vanskelig på grunn av artefakter. Endringer i hjertefrekvensintervaller kan måles fra EKG gjennom hele treningstesten.
Figur 1: Plantegning av løpebanen. Stedet for dyr som ikke løper er merket med (A). Ett dyr om gangen ledes til tredemøllen [sone (C)] gjennom en korridor (B). Porten mellom sonene (A) og (B) er stengt for å sikre at bare ett dyr om gangen går til løpebanen og de andre dyrene holder seg i sone (A). Det er viktig at andre dyr holder seg i sone (A), da dyret på tredemøllen kan se de andre dyrene i sone (A), noe som motiverer dem til å løpe. Porten mellom tredemøllen og sonen (B) er lukket for å sikre at dyret ikke kan trekke seg tilbake fra tredemøllen. Tredemøllen betjenes fra sone (D), og dyret returneres til sone (A) gjennom sone (D) etter løpet. I dette tilfellet er et vannpunkt hvor dyr kan drikke og kjøle seg ned etter kjøringen installert i sone (A). Symboler: svarte piler indikerer rotasjonsretningen, og kvartsirkler indikerer porter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative bilder av løpebanen . (A) Betydningen av bare én tilgjengelig rute for dyrene. (B) Tredemøllen, som skal ha en justerbar bredde for å hindre dyr i å snu under løpet. (C) Et lukket rom ment for et annet dyr i tillegg til det løpende dyret. Dyr er mer motiverte til å løpe når de ser et medlem av arten sin. (D) Et eksempel på et vannpunkt for dyrene der dyrene kan kjøle seg ned og drikke etter stresstesten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Løpsdistanse og hastighet . a) representative data fra den totale løpsdistansen til fire friske griser. Gjennomsnittlig total løpsavstand for forsøksdyrene var 970 m, og standardavviket for de totale avstandene var 80 m. (B) Data om hastighetsvariasjon mellom griser. Hastigheten senkes med 0,5 km/t-intervaller til grisen takler hastigheten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representativ tidslinje. Merk at tidspunktene kan variere mellom studiene. Det er imidlertid bemerkelsesverdig at dyr skal komme til forsøksdyrsenteret 3 uker før forsøket starter på grunn av akklimatiseringsperioden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Korrelasjon av løpsavstanden med endringen i ejeksjonsfraksjon. Korrelasjon av endringen i løpeavstand med endringen i ejeksjonsfraksjon. Ejeksjonsfraksjonen i hvile ble målt med Biplane Simpon-metoden. Endringen i ejeksjonsfraksjon fra baseline korrelerer med endringen i løpedistansen til griser med pacemakerindusert hjertesvikt, med r = 0,2831, p = 0,0284 og R2 = 0,0801. Til tross for lav r og R2 har endringen i venstre ventrikkels ejeksjonsfraksjonsprosent (LVEF%) en tendens til å påvirke løpsavstanden. Det er viktig å merke seg at flere faktorer påvirker de målte variablene, noe som påvirker resultatene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Representative EKG-bånd av en frisk gris. Det øverste EKG-panelet viser et EKG 3 min etter starten av treningstesten. Den nederste EKG-stripen viser et EKG etter å ha løpt i 10 min. EKG kan brukes til å evaluere forskjellene i hjertefrekvensen til forsøksdyrene. Hjertefrekvensen til det øverste EKG-panelet er 176 slag per minutt, og på bunnen er EKG-stripen 250 slag per minutt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne store dyretreningstesten etterligner testen som brukes i klinikker, og reduserer gapet i endepunkter mellom prekliniske studier og kliniske studier. Det kan brukes til å evaluere effekten av nye behandlinger for alvorlige kardiovaskulære sykdommer, som arteriosklerose obliterans, hjertesvikt og iskemiske hjertesykdommer. Tidspunktene som brukes i denne protokollen kan variere avhengig av den testede behandlingen. Denne protokollen er standardisert basert på lang erfaring med å jobbe med store dyr og kan brukes til å evaluere sikkerheten og effekten av kardiovaskulær genterapi og andre nye terapeutiske tilnærminger.
Grisehjertet og kardiovaskulærsystemet ligner menneskelig fysiologi, anatomi og funksjon. Derfor har griser ofte blitt brukt til å modellere kardiovaskulære sykdomsmekanismer og terapeutiske prosedyrer17. Oppfølgingstiden i våre grisestudier har vært opptil 12 måneder18; Håndteringen av dyrene blir imidlertid stadig mer utfordrende etter hvert som de vokser i løpet av de lange oppfølgingsperiodene.
Denne metoden består av ulike kritiske trinn, som er avgjørende for testens suksess og umulig å korrigere etterpå. For det første har griser individuelle forskjeller i løpemotivasjonen. Å få dyr motivert til å løpe og opprettholde tilstrekkelig motivasjon gjennom hele testen er viktig. Dette sikrer at alle tidspunkter er sammenlignbare. Å opprettholde grisenes løpemotivasjon krever spesifikk kunnskap om deres individuelle atferdsegenskaper. Dyr må akklimatiseres til tredemølle og testmiljø før treningstesten. Grisene læres å gå på tredemølle, og deres vellykkede forestillinger blir belønnet. En annen måte å øke løpemotivasjonen på er å holde andre testdyr i synsfeltet til løperen.
Å unngå typiske anatomiske feil, for eksempel forskjellige benproblemer, er viktig. De vanligste anatomiske feilene er hovsykdommer, medfødte lemmer deformiteter og problemer forårsaket av ulykker, som kuttskader, scapularskader, brudd og sår. Disse skyldes hovedsakelig habitater, ulykker, arvelige faktorer og avvik i fôring19. En svakhet i beina fører til ukoordinert gange, noe som gjør det umulig å delta på treningstester. Også, hvis ben svakhet oppstår under studien, må dyret utelukkes fra testen. Benproblemer kan unngås ved å velge griser med intakte benstrukturer. Under forskningen kan benskader forebygges ved å ha gode forhold i griseriet. Harde, etsende overflater må unngås, og generell hygiene må opprettholdes. Grisene må mates moderat slik at de ikke vokser for raskt, siden dette belaster bena. I tillegg må grisene plasseres i pennene nøye for å unngå ulykker, og de bør ha nok stimuli, for eksempel leker, slik at tyggene ikke er rettet mot andre griser.
Under treningstesten ble EKG registrert med 3-avlednings-EKG eller implanterbar sløyferegistrator. Det er ikke så nøyaktig som et 12-avlednings-EKG, men kan fortsatt vurdere flere variabler, for eksempel arytmier og hjertefrekvens. Flere typer feil og forstyrrelser kan forfalske EKG. For eksempel kan feil tilkoblede elektroder, dårlig kontakt mellom hud og elektroder og skjelettmuskulaturkontraksjoner forårsake feil. Elektrodene må holde seg godt på plass gjennom hele testen. Dette er utfordrende ettersom huden varmes opp og svetter under løping. Kontakten mellom huden og elektrodene kan forbedres ved å barbere hår, desinfisere og fjerne døde hudceller. Bevegelsen av muskler forårsaker også artefakter som påvirker EKG13. Dette kan utfordre tolkningen av ST-segmenter. I tillegg kan EKG-ledninger forstyrre løpingen. Imidlertid kan disse problemene reduseres ved å banke EKG-ledningene fast på huden. EKG kan også registreres med implanterbar sløyfeopptaker eller pacemaker. Ved hjelp av en implanterbar sløyfeopptaker løser mange problemer som 3-avledning EKG-bruk har. Installasjon av den implanterbare sløyfeopptakeren er imidlertid en invasiv operasjon med risiko, for eksempel infeksjoner.
Forskere må observere dyreadferd gjennom hele testen for å sikre prosedyrens generelle sikkerhet. For eksempel er utmattelse, alvorlig tretthet, kvalme, bevissthetstap, alvorlig dyspné eller cyanotisk hud grunner til å avslutte treningstesten. Forskere må også observere endringer i EKG, for eksempel arytmier. Imidlertid, med godt trent personell og nok erfaring med å jobbe med store dyr, kan den nåværende treningsprotokollen rutinemessig brukes i prekliniske studier for å produsere klinisk relevante data som skal gjøre den kliniske overgangen til nye terapeutiske tilnærminger mer vellykket med hensyn til kliniske fordeler for pasientene.
Poole et al.20 har publisert retningslinjer for trening av dyr og treningsprotokoller for kardiovaskulære studier. I disse protokollene trener grisene på tredemølle i ca. 30 minutter etter oppvarming. I løpet av disse 30 minuttene er målpulssonen for testdyrene 65% -75% av maksimal hjertefrekvens. Hjertefrekvensen endres enten ved å endre hastigheten eller hellingen på tredemøllen. Protokollen til Poole et al. og 15 minutters treningstest presentert i dette manuskriptet har flere likheter, for eksempel akklimatiseringsperioden, tredemøllekrav, vekten av utvalgte forsøksdyr og positiv forsterkning ved å belønne dyret etter øvelsen. I begge protokollene kan forsøksdyrene vokse ut av tredemøllens kapasitet, noe som begrenser oppfølgingstiden.
Hovedforskjellen mellom protokollen beskrevet av Poole et al. og treningstesten presentert i dette manuskriptet er formålet med testingen. Protokollen beskrevet av Poole et al. er designet for å fremkalle klassiske treningstilpasninger notert hos mennesker. Derfor fokuserer den på trening med moderat intensitet, mens treningstestmetoden på 15 minutter tar sikte på å gjøre en nesten maksimal innsats for å bedre evaluere kardiorespiratorisk kondisjon. Dette oppnås når det subjektive anstrengelsesnivået er omtrent 90% av maksimal hjertefrekvens13. En 15 minutters treningstest etterligner testen som brukes i klinikker ved gradvis å øke anstrengelsesnivået til det er nær maksimum. På grunn av forskjellen i protokollens mål, varierer treningsfrekvensen til testdyrene. Poole et al. beskriver at griser kan løpe opptil fire ganger i uken for å oppnå bedre kardiovaskulære tilpasninger forårsaket av trening. Den 15 minutters treningstesten evaluerer den funksjonelle effekten av genterapi og andre nye terapier, og derfor er den nødvendige frekvensen betydelig lavere og avhenger av behandlingens krav. Et eksempel på disse kravene er beskrevet i figur 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatteren takker Minna Törrönen, Riikka Venäläinen, Heikki Karhunen og Inkeri Niemi fra National Laboratory Animal Center for deres hjelp i dyrearbeidet. Denne studien er støttet av Finnish Academy, ERC og CardioReGenix EU Horizon grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Defibrillator | Zoll M series | TO9K116790 | All portable defribrillators will work |
| Defibrillator pads | Philips | M3713A | All pads work, as long as the pads are compatible with the defibrillator |
| ECG electrodes | Several providers | Prefer ECG electrodes designed for exercise tests | |
| Loop recorder | Abbott Oy | DM3500 | Optional for rhythm monitoring |
| Patient monitor | Schiller Argus LCM Plus | 7,80,05,935 | All portable ecg monitors will work |
| Pigs | Emolandia Oy | ||
| Treadmill | NordicTrack | All treadmills with adjustable incline and speed are suitable for the exercise test. The treadmill should be as long and wide as possible. | |
| Ultrasound system | Philips EPIQ 7 ultrasound | ||
| Various building materials | Several providers | For building fences, ramps and gates according to the Figure 1 and Figure 2 | |
| Various treats for the animals |
References
- Virani, S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), e139 (2020).
- Townsend, N., et al.
- Knuuti, J., et al. 2019 ESC Guidelines for the diagnosis and management of chronic coronary syndromes: The Task Force for the diagnosis and management of chronic coronary syndromes of the European Society of Cardiology (ESC). European Heart Journal. 41 (3), 407-477 (2020).
- Ylä-Herttuala, S., Baker, A. H. Cardiovascular gene therapy: past, present, and future. Molecular Therapy. 25 (5), 1096-1106 (2017).
- Hedman, M., et al. Eight-year safety follow-up of coronary artery disease patients after local intracoronary VEGF gene transfer. Gene Therapy. 16 (5), 629-634 (2009).
- Rosengart, T. K., et al. Long-term follow-up of a phase 1 trial of angiogenic gene therapy using direct intramyocardial administration of an adenoviral vector expression the VEGF121 cDNA for the treatment of diffuse coronary artery disease. Human Gene Therapy. 24 (2), 203-208 (2013).
- Muona, K., Mäkinen, K., Hedman, M., Manninen, H., Ylä-Herttuala, S. 10-year safety follow-up in patients with local VEGF gene transfer to ischemic lower limb. Gene Therapy. 19 (4), 392-395 (2012).
- Leikas, A. J., et al. Long-term safety and efficacy of intramyocardial adenovirus-mediated VEGF-DΔNΔC gene therapy eight-year follow-up of phase I KAT301 study. Gene Therapy. 29 (5), 289-293 (2022).
- Telukuntla, K. S., Suncion, V. Y., Schulman, U. H., Hare, J. M. The advancing field of cell-based therapy: insights and lessons from clinical trials. Journal of the American Heart Association. 2 (5), e000338 (2013).
- Ylä-Herttuala, S., Bridges, C., Katz, M. G., Korpisalo, P. Angiogenic gene therapy in cardiovascular diseases: dream or vision. European Heart Journal. 38 (18), 1365-1371 (2017).
- Lähteenvuo, J., Ylä-Herttuala, S. Advances and challenges in cardiovascular gene therapy. Human Gene Therapy. 28 (11), 1024-1032 (2017).
- Ross, R., et al. Importance of assessing cardiorespiratory fitness in clinical practice: a case for fitness as a clinical vital sign: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 134 (24), e653-e699 (2016).
- Sietsema, K. E., Stringer, W. W., Sue, D. Y., Ward, S. Wasserman & Whipp's Principles of Exercise Testing and Interpretation. 6th. , Wolters Kluwer. Philadelphia. (2021).
- Darmadi, M. A., et al. Exercise-induced sustained ventricular tachycardia without structural heart disease: a case report. The American Journal of Case Reports. 21, e928242 (2020).
- Casella, G., Pavesi, P. C., Sangiorgio, P., Rubboli, A., Bracchetti, D. Exercise-induced ventricular arrhythmias in patients with healed myocardial infarction. International Journal of Cardiology. 40 (3), 229-235 (1993).
- Gimeno, J. R., et al. Exercise-induced ventricular arrhythmias and risk of sudden cardiac death in patients with hypertrophic cardiomyopathy. European Heart Journal. 30 (21), 2599-2605 (2009).
- Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (5), 432-438 (2014).
- Korpela, H., et al. AAV2-VEGF-B gene therapy failed to induce angiogenesis in ischemic porcine myocardium due to inflammatory responses. Gene Therapy. 29 (10-11), 643-652 (2022).
- Swindle, M. M. Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging, and Experimental Techniques. 2nd edition. , CRC Press. Taylor & Francis Group. (2007).
- Poole, D. C., et al. Guidelines for animal exercise and training protocols for cardiovascular studies. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), H1100-H1138 (2020).
