Mehrkanalige extrazelluläre Aufzeichnung bei frei beweglichen Mäusen

Summary

Das Protokoll beschreibt die Methodik der extrazellulären Aufzeichnung im motorischen Kortex (MC), um extrazelluläre elektrophysiologische Eigenschaften in frei beweglichen bewussten Mäusen aufzudecken, sowie die Datenanalyse von lokalen Feldpotentialen (LFPs) und Spikes, die für die Bewertung der neuronalen Netzwerkaktivität nützlich ist, die dem interessierenden Verhalten zugrunde liegt.

Abstract

Das Protokoll zielt darauf ab, die Eigenschaften des neuronalen Feuerns und der lokalen Feldpotentiale (LFPs) in sich verhaltenden Mäusen aufzudecken, die bestimmte Aufgaben ausführen, indem die elektrophysiologischen Signale mit spontanem und/oder spezifischem Verhalten korreliert werden. Diese Technik stellt ein wertvolles Werkzeug dar, um die neuronale Netzwerkaktivität zu untersuchen, die diesen Verhaltensweisen zugrunde liegt. Der Artikel bietet ein detailliertes und vollständiges Verfahren für die Elektrodenimplantation und die daraus resultierende extrazelluläre Aufzeichnung in frei beweglichen bewussten Mäusen. Die Studie umfasst eine detaillierte Methode zur Implantation der Mikroelektrodenarrays, die Erfassung der LFP- und neuronalen Spiking-Signale im motorischen Kortex (MC) mit einem Mehrkanalsystem und die anschließende Offline-Datenanalyse. Der Vorteil der Mehrkanalaufzeichnung bei bewussten Tieren besteht darin, dass eine größere Anzahl von Spiking-Neuronen und neuronalen Subtypen erhalten und verglichen werden kann, was die Bewertung des Zusammenhangs zwischen einem bestimmten Verhalten und den damit verbundenen elektrophysiologischen Signalen ermöglicht. Insbesondere die in der vorliegenden Studie beschriebene Mehrkanal-extrazelluläre Aufzeichnungstechnik und das Datenanalyseverfahren können bei der Durchführung von Experimenten an sich verhaltenden Mäusen auch auf andere Hirnareale angewendet werden.

Introduction

Das lokale Feldpotential (LFP), ein wichtiger Bestandteil extrazellulärer Signale, spiegelt die synaptische Aktivität großer Populationen von Neuronen wider, die den neuronalen Code für mehrere Verhaltensweisen bilden¹. Spikes, die durch neuronale Aktivität erzeugt werden, tragen zum LFP bei und sind wichtig für die neuronale Kodierung². Es wurde nachgewiesen, dass Veränderungen in Spikes und LFPs verschiedene Gehirnerkrankungen wie Alzheimer sowie Emotionen wie Angst usw. ^{vermitteln.3,4}. Es ist erwähnenswert, dass viele Studien gezeigt haben, dass sich die Spike-Aktivität bei Tieren signifikant zwischen wachem und anästhesiertem Zustand unterscheidet⁵. Obwohl Aufzeichnungen in anästhesierten Tieren die Möglichkeit bieten, LFPs mit minimalen Artefakten in hochdefinierten kortikalen Synchronisationszuständen zu beurteilen, unterscheiden sich die Ergebnisse bis zu einem gewissen Grad von dem, was bei wachen Probanden zu finden ist ^6,7,8. Daher ist es sinnvoller, neuronale Aktivität über lange Zeitskalen und große räumliche Skalen bei verschiedenen Erkrankungen im Wachzustand des Gehirns mit Hilfe von Elektroden zu erfassen, die in das Gehirn implantiert werden. Dieses Manuskript enthält Informationen für Anfänger, wie man das Mikroantriebssystem herstellt und die Parameter mit gängiger Software einstellt, um die Spike- und LFP-Signale schnell und unkompliziert zu berechnen, um mit der Aufzeichnung und Analyse zu beginnen.

Obwohl die nicht-invasive Aufzeichnung von Gehirnfunktionen, wie z. B. durch die Verwendung von Elektroenzephalogrammen (EEGs) und ereigniskorrelierten Potentialen (ERPs), die von der Kopfhaut aufgezeichnet werden, in großem Umfang in Studien an Menschen und Nagetieren eingesetzt wurde, haben EEG- und ERP-Daten geringe räumliche und zeitliche Eigenschaften und können daher nicht die präzisen Signale erfassen, die durch die nahe gelegene dendritische synaptische Aktivität in einem bestimmten Hirnareal erzeugt^{werden 1}. Derzeit kann durch die Nutzung der Mehrkanalaufzeichnung bei bewussten Tieren die neuronale Aktivität in den tieferen Schichten des Gehirns chronisch und progressiv aufgezeichnet werden, indem ein Mikroantriebssystem während mehrerer Verhaltenstests in das Gehirn von Primaten oder Nagetieren implantiert wird 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Kurz gesagt, Forscher können ein Mikroantriebssystem konstruieren, das für die unabhängige Positionierung der Elektroden oder Tetroden verwendet werden kann, um verschiedene Teile des Gehirns anzusprechen^10,11. Zum Beispiel beschrieben Chang et al. Techniken zur Aufzeichnung von Spikes und LFPs bei Mäusen durch Zusammenbau eines leichten und kompakten Mikroantriebs¹². Darüber hinaus sind mikrobearbeitete Siliziumsonden mit kundenspezifischen Zubehörkomponenten für die Aufzeichnung mehrerer einzelner Neuronen und LFPs in Nagetieren während Verhaltensaufgaben¹³ kommerziell erhältlich. Obwohl verschiedene Konstruktionen für die Montage von Mikroantriebssystemen verwendet wurden, haben diese in Bezug auf die Komplexität und das Gewicht des gesamten Mikroantriebssystems immer noch begrenzten Erfolg. Zum Beispiel zeigten Lansink et al. ein mehrkanaliges Mikroantriebssystem mit einer komplexen Struktur für die Aufzeichnung aus einer einzelnen Gehirnregion¹⁴. Sato et al. berichteten über ein Mehrkanal-Mikroantriebssystem, das eine automatische hydraulische Positionierungsfunktion¹⁵ aufweist. Die Hauptnachteile dieser Mikroantriebssysteme sind, dass sie für Mäuse zu schwer sind, um sich frei zu bewegen, und für Anfänger schwer zu montieren sind. Obwohl sich die mehrkanalige extrazelluläre Aufzeichnung als geeignete und effiziente Technologie zur Messung der neuronalen Aktivität bei Verhaltenstests erwiesen hat, ist es für Anfänger nicht einfach, die von dem komplexen Mikroantriebssystem erfassten Signale aufzuzeichnen und zu analysieren. Angesichts der Tatsache, dass es schwierig ist, den gesamten Betriebsprozess der mehrkanaligen extrazellulären Aufzeichnung und Datenanalyse in frei beweglichen Mäusen in Gang zu bringen^16,17, stellt dieser vorliegende Artikel vereinfachte Richtlinien vor^, um den detaillierten Prozess der Herstellung des Mikroantriebssystems unter Verwendung allgemein verfügbarer Komponenten und Einstellungen vorzustellen; Die Parameter in der gängigen Software zur schnellen und unkomplizierten Berechnung der Spike- und LFP-Signale werden ebenfalls bereitgestellt. Darüber hinaus kann sich die Maus in diesem Protokoll durch die Verwendung eines Heliumballons frei bewegen, was dazu beiträgt, das Gewicht der Kopfbühne und des Mikroantriebssystems auszugleichen. Im Allgemeinen beschreiben wir in der vorliegenden Studie, wie man auf einfache Weise ein Mikroantriebssystem aufbauen und die Prozesse der Aufzeichnung und Datenanalyse optimieren kann.

Protocol

Alle Mäuse wurden kommerziell gewonnen und in einem 12-stündigen Licht-/12-Stunden-Dunkelzyklus (Licht an um 08:00 Uhr Ortszeit) bei einer Raumtemperatur von 22-25 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 50%-60% gehalten. Die Mäuse hatten Zugang zu einer kontinuierlichen Versorgung mit Nahrung und Wasser. Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren der South China Normal University durchgeführt und von der institutionellen Tierethikkommission genehm…

Representative Results

Ein Hochpassfilter (250 Hz) wurde angewendet, um die Multi-Unit-Spikes aus den Rohsignalen zu extrahieren (Abbildung 6A). Des Weiteren wurden die aufgezeichneten Einheiten aus dem MC einer normalen Maus, sortiert nach PCA, verifiziert (Abbildung 7A-D), und die Talbreite und Wellenformdauer der Einheiten im MC der Maus wurden aufgezeichnet. Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl die Talbreite als auch die Wellenformdauer der mutmaß…

Discussion

Die Mehrkanalaufzeichnung in frei beweglichen Mäusen wurde in neurowissenschaftlichen Studien als nützliche Technologie angesehen, aber für Anfänger ist es immer noch eine ziemliche Herausforderung, die Signale aufzuzeichnen und zu analysieren. In der vorliegenden Studie stellen wir vereinfachte Richtlinien für die Herstellung von Mikroantriebssystemen und die Durchführung von Elektrodenimplantationen sowie vereinfachte Verfahren zur Erfassung und Analyse der elektrischen Signale mittels Spike-Sortiersoftw…

Materials

2.54 mm pin header	YOUXIN Electronic Co., Ltd.	1 x 5	Applying for the movable micro-drive which can slide on its stulls.
Adobe Illustrator CC 2017	Adobe	N/A	To optimize images from GraphPad.
BlackRock Microsystems	Blackrock Neurotech	Cerebus	This systems includes headsatge, DA convert, amplifier and computer.
Brass nut	Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd.	M0.8 brass nut	The nut fixes the position of screw.
Brass screw	Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd.	M0.8 x 11 mm brass screw	A screw that hold the movable micro-drive.
C57BL/6J	Guangdong Zhiyuan Biomedical Technology Co., LTD.	N/A	12 weeks of age.
Centrifuge tube	Biosharp	15 mL; BS-150-M	To store mice brain with sucrose sulutions.
Conducting paint	Structure Probe, Inc.	7440-22-4	To improve the lead-connecting quality between connector pins and Ni-wires.
Conductive copper foil tape	3M	1181	To reduce interferenc.
Connector	YOUXIN Electronic Co., Ltd.	2 x 10P	To connect the headtage to micro-drive system.
DC Power supply	Maisheng	MS-305D	A power device for  electrolytic lesion.
Dental cement	Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd.	N/A	To fix the electrode arrays on mouse's skull after finishing the implantation.
Digital analog converter	Blackrock	128-Channel	A device that converts digital data into analog signals.
Epoxy resin	Alteco	N/A	To cover pins.
Excel	Microsoft	N/A	To summarize data after analysis.
Eye scissors	JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd.	N/A	For surgery or cutting the Ni-chrome wire.
Fine forceps	JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd.	N/A	For surgery.
Forceps	JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd.	N/A	For surgery or assembling the mirco-drive system.
Freezing microtome	Leica	CM3050 S	Cut the mouse’s brain into slices
Fused silica capillary tubing	Zhengzhou INNOSEP Scientific Co., Ltd.	TSP050125	To  serve as the guide tubes for Ni-chrome wires.
Glass microelectrode	Sutter Instrument Company	BF100-50-10	To mark the desired locations for implantation using the filled ink.
GraphPad Prism 7	GraphPad Software	N/A	To analyze and visualize the results.
Guide-tube	Polymicro technologies	1068150020	To load Ni-chrome wires.
Headstage	Blackrock	N/A	A tool of transmitting signals.
Helium balloon	Yili Festive products Co., Ltd.	24 inch	To offset the weight of headstage and micro-drive system.
Ink	Sailor Pen Co.,LTD.	13-2001	To mark the desired locations for implantation.
Iodine tincture	Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd.	N/A	To disinfect mouse's scalp.
Lincomycin in Hydrochloride and Lidocaine  hydrochloride gel	Hubei kangzheng pharmaceutical co., ltd.	10g	A drug used to reduce inflammation.
Meloxicam	Vicki Biotechnology Co., Ltd.	71125-38-7	To reduce postoperative pain in mice.
Micromanipulators	Scientifica	Scientifica IVM Triple	For electrode arrays implantation.
Microscope	Nikon	ECLIPSE Ni-E	Capture the images of brain sections
nanoZ impedance tester	Plexon	nanoZ	To measure impedance or performing electrode impedance spectroscopy (EIS) for multichannel microelectrode arrays.
NeuroExplorer	Plexon	NeuroExplorer	A tool for analyzing the electrophysiological data.
NeuroExplorer	Plexon, USA	N/A	A software.
Ni-chrome wire	California Fine Wire Co.	M472490	35 μm Ni-chrome wire.
Offline Sorter	Plexon	Offline Sorter	A tool for sorting the recorded multi-units.
PCB board	Hangzhou Jiepei Information Technology Co., Ltd.	N/A	Computer designed board.
Pentobarbital	Sigma	P3761	To anesthetize mice.
Pentobarbital sodium	Sigma	57-33-0	To anesthetize the mouse.
Peristaltic pump	Longer	BT100-1F	A device used for perfusion
Polyformaldehyde	Sangon Biotech	A500684-0500	The main component of fixative solution for fixation of mouse brains
PtCl4	Tianjin Jinbolan Fine Chemical Co., Ltd.	13454-96-1	Preparation for gold plating liquid.
Saline	Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd.	N/A	To clean the mouse's skull.
Silver wire	Suzhou Xinye Electronics Co., Ltd.	2 mm diameter	Applying for ground and reference electrodes.
Skull drill	RWD Life Science	78001	To drill carefully two small holes on mouse's skull.
Stainless steel screws	YOUXIN Electronic Co., Ltd.	M0.8 x 2	To protect the micro-drive system and link the ground and reference electrodes.
Stereotaxic apparatus	RWD Life Science	68513	To perform the stereotaxic coordinates of bilateral motor cortex.
Sucrose	Damao	57-50-1	To dehydrate the mouse brains  after perfusion.
Super glue	Henkel AG & Co.	PSK5C	To fix the guide tube and Ni-chrome wire.
Temperature controller	Harvard Apparatus	TCAT-2	To maintain mouse's rectal temperature at 37°C
Tetracycline eye ointment	Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd.	N/A	To protect the mouse's eyes during surgery.
Thread	Rapala	N/A	To link ballon and headstage.
Vaseline	Unilever plc	N/A	To cover the gap between electrode arrays and mouse's skull.