Summary
プロトコルは自由に動く意識のマウスの細胞外の電気生理学的な特性を明らかにするための運動皮質(MC)の細胞外記録の方法論を、またローカル視野の潜在性(LFPs)および興味の行動の根底にあるネットワークの神経活動を評価するために有用であるスパイクのデータ分析記述する。
Abstract
プロトコルは自発的および/または特定の行動と電気生理学的な信号を関連付けることによって特定の仕事を遂行するマウスをすることのニューロンの発火およびネットワークローカル電界電位(LFP)の特性を明らかにすることを向ける。この手法は、これらの行動の根底にあるニューロンネットワーク活動を研究する上で貴重なツールとなります。本稿では、自由に動く意識のあるマウスにおける電極の埋め込みとそれに伴う細胞外記録の詳細かつ完全な手順について解説しています。この研究には、微小電極アレイを埋め込むための詳細な方法、マルチチャンネルシステムを使用して運動皮質(MC)内のLFPとニューロンスパイク信号をキャプチャし、その後のオフラインデータ分析が含まれます。意識のある動物におけるマルチチャンネル記録の利点は、より多くのスパイクニューロンおよびニューロンサブタイプを取得して比較できることであり、これにより、特定の行動と関連する電気生理学的信号との関係を評価できる。特に、本研究で説明したマルチチャンネル細胞外記録技術およびデータ解析手順は、行動マウスの実験を行う際に、他の脳領域にも適用できる。
Introduction
細胞外シグナルの重要な構成要素である局所電界電位(LFP)は、複数の行動の神経コードを形成するニューロンの大きな集団のシナプス活動を反映しています1。ニューロンの活動によって生じるスパイクはLFPに寄与すると考えられており、ニューラルコーディング2にとって重要である。スパイクとLFPの変化は、アルツハイマー病などのいくつかの脳疾患や、恐怖などの感情を媒介することが証明されています3,4。多くの研究で、動物の覚醒状態と麻酔状態の間でスパイク活性が大きく異なることが強調されていることは注目に値します5。麻酔をかけた動物での記録は、高度に定義された皮質同期状態で最小限のアーチファクトでLFPを評価する機会を提供しますが、結果は覚醒した被験者に見られるものとはある程度異なります6,7,8。したがって、脳に埋め込まれた電極を用いて、覚醒した脳状態で様々な疾患の神経活動を長い時間スケールと大きな空間スケールで検出することは、より有意義です。この原稿では、記録と分析を開始するために、スパイク信号とLFP信号を迅速かつ簡単に計算するための一般的なソフトウェアを使用して、マイクロドライブシステムを作成し、パラメータを設定する方法に関する初心者向けの情報を提供します。
頭皮から記録された脳波(EEG)やイベント関連電位(ERP)などによる脳機能の非侵襲的記録は、ヒトやげっ歯類の研究で広く使用されてきましたが、EEGおよびERPデータは空間的および時間的特性が低いため、特定の脳領域内の近くの樹状突起シナプス活動によって生成される正確な信号を検出することはできません1.現在、意識のある動物のマルチチャンネル記録を利用することで、霊長類やげっ歯類の脳にマイクロドライブシステムを移植することで、脳の深層部の神経活動を慢性的かつ漸進的に記録することができます1,2,3,4,5,6,7,8,9 .簡単に言うと、研究者は、脳の異なる部分を標的とするために、電極または四極管の独立した位置決めに使用できるマイクロドライブシステムを構築することができる10,11。例えば、Changらは、軽量でコンパクトなマイクロドライブ12を組み立てることによって、マウスのスパイクおよびLFPを記録する技術を記述した。さらに、行動課題中のげっ歯類における複数の単一ニューロンおよびLFPを記録するために、カスタムメイドの付属部品を備えた微細加工されたシリコンプローブが市販されている13。マイクロドライブシステムの組み立てにはさまざまな設計が使用されてきましたが、マイクロドライブシステム全体の複雑さと重量の点で、これらの成功はまだ限られています。例えば、Lansinkらは、単一の脳領域から記録するための複雑な構造を有するマルチチャンネルマイクロドライブシステムを示した14。佐藤らは、自動油圧位置決め機能15を表示するマルチチャンネルマイクロドライブシステムを報告した。これらのマイクロドライブシステムの主な欠点は、マウスが自由に動くには重すぎることと、初心者には組み立てが難しいことです。マルチチャンネルの細胞外記録は、行動テスト中の神経活動を測定するのに適しており効率的な技術であることが示されていますが、複雑なマイクロドライブシステムによって取得された信号を初心者が記録および分析することは容易ではありません。自由に動くマウス16,17では、マルチチャンネルの細胞外記録とデータ解析の全操作プロセスを開始することが困難であることを考慮し、本稿では、簡略化されたガイドラインを提示し、一般的に入手可能なコンポーネントと設定を使用してマイクロドライブシステムを作成する詳細なプロセスを紹介します。また、スパイク信号とLFP信号を高速かつ簡単に計算するための共通ソフトウェアのパラメータも提供されています。さらに、このプロトコルでは、ヘリウムバルーンの使用によりマウスを自由に動かすことができ、ヘッドステージとマイクロドライブシステムの重量を相殺することに貢献します。本研究では、マイクロドライブシステムを簡単に構築し、記録とデータ解析のプロセスを最適化する方法について概説する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
すべてのマウスを商業的に入手し、室温22〜25°C、相対湿度50%〜60%で12時間の明/12時間の暗サイクル(現地時間午前8:00に点灯)で維持した。マウスは、餌と水を継続的に供給することができた。すべての実験は、華南師範大学の実験動物の飼育と使用に関するガイドラインに従って実施され、施設動物倫理委員会によって承認されました。生後3-5ヶ月の雄のC57BL/6Jマウスを用いた。
1. マイクロドライブシステム組立
- 2つのスタルと可動マイクロドライブを固定するネジを使用して、2つのコンピュータ設計ボードを接続し、コネクタを1つのボードに取り付けます(図1A、Bi-iii)。ネジ(0.5 mm/円)をひねってマイクロドライブを駆動します。
- マイクロドライブがMC領域の両側に8本のガイドチューブ(長さ~3 cm、内径~50 μm、外径~125 μm)を2セット搭載できることを確認し、同じ長さ(少なくとも15 mm; 図1Biv, v)。
- 直径35μmのNiクロム線(~5cm)を16本切断し、ガイドチューブに連続して装填し、接着剤を塗布して固定します(図1Bi、vi、vii)。
- ワイヤの絶縁体を剥がし、チャネル マップに従ってコネクタから各ピンに露出した各ワイヤ、基準電極、および接地電極を連続的に撚り合わせ、各ピンに導電性塗料をゆっくりとコーティングします(図 1Bviii-x)。
- エポキシ樹脂を使用してピンを覆い(図1Axi、xii)、インピーダンステスターを介して金メッキを行い、電極チップのインピーダンスを~350kΩに低減します(図1Bxiii、xiv)。インピーダンステスターのパラメータを次のように設定します:-10.08 μAの直流、1秒間、金めっき溶液、5 mM PtCl4を含む。
- 最後に、ネジをひねってマイクロドライブを上部に移動します。 図1A に示すように変更したマイクロドライブシステムの全体的なサイズを確認します(長さ約15 mm、幅10 mm、高さ20 mm、重量~1 g)。コンピュータ設計基板と可動部品の詳細な仕様を 図1Ai、ii.で確認する。
2. 電極アレイの埋め込み
- 手術キットを滅菌し、滅菌手袋を着用し、手術開始前に医師の滅菌白衣を着用してください。
- 痛みを管理するには、誘導チャンバー内のマウスにメロキシカム注射剤(5 mg / kg)の皮下注射を使用します。.次に、誘導チャンバー18,19でペントバルビタール(80 mg / kg)の腹腔内(i.p.)注射によってマウスに麻酔をかけます。つま先のつまみ反射がまだ存在する場合は、ペントバルビタール(20 mg / kg / h)の追加用量を適用します。.
- マウスを脳定位固定装置に固定し、温度コントローラーを使用して直腸温度を37°Cに保ちます。
- テトラサイクリン眼軟膏をマウスの両眼に塗布し、手術前に滅菌手袋を再度交換します。
- マウスの毛皮を剃り、先端が滅菌した綿のアプリケーターを使用して、中心から外側に向かって同心円状にベタジンスクラブとアルコールを交互に3回交互に手術部位を消毒します(図2i、ii)。頭蓋骨を露出させるために、小さな正中線切開(~15 mm)を行います。すぐに、痛みを和らげるために1%リドカインを首の筋肉に局所的に塗布します。.次に、ハサミを使用して残存組織を取り除き、生理食塩水でコーティングされた綿棒を使用して頭蓋骨を洗浄します(図2iii)。
- インクを充填したガラス微小電極を使用して、両側MCの埋め込みに必要な位置に印を付けます(図2iv、v)。以前の研究20に基づくと、両側MCの位置は次のとおりです:ブレグマの前方0.74 mm、正中線の外側1.25 mm。
- マイクロドライブシステムを保護するために4本のステンレス鋼ネジ(直径0.8 mm)を埋め込み、すべてのネジを基準電極と接地電極でリンクし、次に混合歯科用セメントで覆って壁を形成します(図2vi-xi)。
- MC領域の調整された頭蓋骨の左側と右側の両方に頭蓋骨ドリルを使用して、2つの小さな穴(~1.5 mm2)を慎重に開けます(図2xii)。左右MCの脳定位座標を使用します:ブレグマの前方0.74 mm、正中線の外側1.25 mm、硬膜の腹側0.5 mm。
- 細かい鉗子で硬膜を穴から慎重に取り外します(図2xiii)。
- マイクロマニピュレーターを使用して、マイクロドライブシステムを10 μm/sで穴の中央に挿入します(図2xiv-xvii)。
- マイクロドライブシステムの挿入が終わったら、ワセリンを歯科用セメントの壁に充填します(図2xviii)。
- マイクロドライブシステムの底板と歯科用セメントの壁を混合歯科用セメントで接合します(図2xix)
- 切開部を生理食塩水で洗浄した後、リンコマイシン塩酸塩と塩酸リドカインを含むゲルで局所処理を行い、術後の痛みを和らげます。
- 導電性銅箔テープを埋め込み型マイクロドライブシステムに巻き付けます(図2xx)。
- マウスを31〜33°Cに保たれたケージに移動し、麻酔からの回復をモニターします。
- マウスを1週間回復させ、別々の給餌を行います。塩酸リンコマイシンと塩酸リドカインを含むゲルを3日間連続して塗布して切開部を確認し、治療します。
3. 自由動マウスの両側MCにおけるマルチチャンネル記録
- 目覚めているマウスの頭を軽く慎重に持ちます。少なくとも1日前に、マイクロドライブシステム(図1Aii)の可動部分のネジをひねって、電極アレイ(~0.1mmの深さ)を下に移動します。
- 目覚めているマウスの頭を軽く慎重に持ちます。ヘッドステージの中央とヘリウムバルーン(約0.02Lのヘリウム充填)をネジでリンクして、ヘッドステージとマイクロドライブシステムの重量を相殺します(図3A、B)。
- 録音ソフトウェアで30kHzでサンプリングすることにより、記録電極とマルチチャンネルシステムを使用して生信号をキャプチャし、マルチチャンネルシステムからデジタルアナログ(DA)コンバーターを使用してデジタル化します。
- 録音ソフトウェアで 10 kHz でリサンプリングして生データから LFP 信号を抽出し、録音ソフトウェアのノッチ フィルターを使用して 50 Hz のライン ノイズを除去します。
- 自由に動くマウスから安定した状態で生データを少なくとも60秒間記録します。記録が終了したら、ヘッドステージとマイクロドライブシステム間の接続をゆっくりと取り外し、マウスをホームケージに戻します。
- 記録したデータをコンピュータに保存し、オフラインで解析します(図4 、 図5)。
- 実験終了後、研究所のガイドラインに従って安楽死を行い、3V出力の電源で電極の位置を確認し、1分間の電解病変を行い、その後組織学的解析を行います。凍結ミクロトームを用いてマウスの脳を30μmのスライスに切断し、MC切片を採取した後、顕微鏡で画像を撮影します(図3C、D)。
4. スパイクの選別と分析
- スパイクソーティングソフトウェアで [File]>[Open > Nev files ]をクリックして、30 kHzでサンプリングされたスパイクデータを開きます(図4Ai)。
- 「情報」をクリックしてソートされていないチャネルを選択し、「 ソート」>「ソート方法の変更」>「K-Meansの使用」を選択します。 K-Means Sorting>Valley-Seeking Sorting ボタンを押して、ソートされたユニットを取得します(図4Aii、iii)。
- [File] > [Save as] をクリックし、ソートされたスパイク データをファイル名拡張子 .nev で保存し、[File] > [Export Per-Waveform Data] を選択して、.txtファイル名拡張子で PCA 結果をエクスポートします(図 4Aiv)。
- 神経生理学的データ解析用のソフトウェアで[ File]>[Import Data > Blackrock File ]をクリックして、ソートされたスパイクファイルを開きます(図4Bi)。
- [ 解析]>[オートコレログラム ]をクリックして、選択したユニットのオートコレログラムを取得し、パラメータを-0.05秒のX最小値、0.05秒のX最大値、0.001のビン値に設定します(図4Bii、iii)。
- ソートされたスパイクデータをロードし、[ Analysis] > Interspike Interval Histograms をクリックしてスパイク間隔ヒストグラムを取得し、パラメータを0秒の最小間隔値、0.1秒の最大間隔値、0.001のBin値に設定します(図4Biv、v)。
- Analysis > Crosscorrelogramsをクリックして、ソートされた2つの単位事象間のクロス相関図を取得し、参照事象とパラメータを-0.1秒のX最小値、0.1秒のX最大値、0.001のビン値に設定します(図4Bvi、vii)。
- [結果] > [数値結果] をクリックして、オートコレログラム、スパイク間間隔ヒストグラム、およびクロス相関図の結果を.xlsファイル名拡張子で保存します(図 4Bviii、ix)。データを解析し、グラフを描画します。
5. LFP分析
- 神経生理学的データ解析用のソフトウェアで[ File][Import Data > Blackrock File ]をクリックして、10 kHzでサンプリングされた連続信号データを開きます(図5Ai)。
- [ Analysis > Spectrum for Continuous ] をクリックして、選択したチャネルからの LFP のパワー スペクトルを解析します。パラメータを次のように設定します:8,192の周波数値の数、3-5の複数のテーパー値、総パワースペクトル密度(PSD)のパーセンテージの正規化、および1Hzから100Hzまでの周波数範囲(図5Aii、iii)。
- [ Analysis > Coherence for Continuous ] をクリックして、MC の左側と右側から 2 つの LFP のコヒーレンスを解析します。 リファレンスチャンネルとパラメータを次のように設定します。 コヒーレンス値、周波数値の数を8,192、マルチテーパー値を3〜5、周波数範囲を1Hzから100Hzで計算します(図5Aiv、 v).
- MC の左側と右側から 2 つの LFP 間の相関関係を分析するには 、[Analysis > Corr. with Cont. Variables ] をクリックします。 基準チャンネル(LFPデータ)とパラメータを、X最小値を-0.1秒、X最大値を0.1秒、ビン値を0.001に設定します(図5Avi、 vii)。
- [結果]>[数値結果]をクリックして、PSD、コヒーレンス、および相関の結果を.xlsファイル名拡張子で保存します(図5Aviii、ix)。
- 各周波数帯域について代表的なトレースを抽出する必要があるチャンネルを選択し、[連続変数のデジタルフィルタリング>編集]をクリックして各周波数帯域を取得し、パラメータを[Filter Freq. Response as Bandpass]、[Filter Implementation]を無限インパルス応答(IIR)Butterworth、[Filter Order]の値を2に設定します。最後に、対象となる周波数範囲を設定します(図5Bi-iv)。
注:ここで使用された周波数範囲は、デルタ(δ、1-4 Hz)、シータ(θ、5-12 Hz)、ベータ(β、13-30 Hz)、低ガンマ(低γ、30-70 Hz)、および高ガンマ(高γ、70-100 Hz)の発振です。 - データを分析してグラフを描画します。
6. スパイクとLFPの相関関係
- 神経生理学的データ解析用のソフトウェアで 、>データのインポート>ブラックロックファイルの ファイルをクリックして、連続信号データとスパイクデータを開きます。
- [Analysis] > [Coherence Analysis] をクリックして 、選択したチャネルのスパイクと LFP の間のコヒーレンスを解析します。参照変数(スパイクタイミング)とパラメータを次のように設定します:コヒーレンス値、周波数値の数を512、マルチテーパー値を3〜5、周波数範囲を1Hz〜100Hzで計算します(図5Ci、ii)。
- [結果]>[数値結果]をクリックして、スパイクフィールドの一貫性の結果を.xlsファイル名拡張子で保存します(図5Ciii、iv)。
- データを分析してグラフを描画します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ハイパス(250Hz)フィルタを適用して、生の信号からマルチユニットスパイクを抽出しました(図6A)。さらに、PCAでソートした正常マウスのMCから記録された単位を検証し(図7A-D)、マウスのMCにおける単位の谷幅と波形持続時間を記録した。その結果、マウスのMC推定錐体ニューロン(Pyn)の谷幅と波形持続時間の両方が、推定介在ニューロン(IN)の谷幅と波形持続時間の両方が高いことが示されました(図7E、F;2サンプルのMann-Whitney検定;谷幅、推定Pyn:0.636 ms ± 0.004 ms、推定IN:0.614 ms ± 0.001 ms、p = 0.002; 波形の持続時間については、 推定Pyn:0.095 ms ± 0.004 ms、推定IN:0.054 ms ± 0.002 ms、p = 1.402 x 10−16)であり、先行研究におけるPynとINの特徴に対応する21。また、推定 Pyn スパイクを基準として設定して、推定 Pyn と IN の間のクロスコレログラムを計算したところ、~18 ミリ秒で正のピークが見つかり(図 7G)、推定 Pyn スパイクが推定 IN スパイクの前に ~18 ミリ秒のウィンドウで発生することが示されました。
神経生理学的データ解析のために、ソフトウェアのIIRフィルターによってLFPから各周波数帯域の代表的なトレースをフィルタリングしました(図6A)。LFP解析では、正常マウスの左右MCのLFPはパワースペクトルが類似しており、左右のMC間の活動が同期していることが示唆された(図8A、B、2標本のMann-Whitney検定、δの場合、左MC:50.71±1.136、右MC:50.47±1.213、 p = 0.70、θの場合、左MC:2.197±0.187、右MC: 2.068 ± 0.193、 p = 0.40;βの場合、左MC:0.222±0.058、右MC:0.206±0.055、 p = 0.70;低γの場合、左MC:0.114 ± 0.034、右MC:0.093±0.018、 p = 0.70;高γの場合、左MC:0.054±0.027、右MC:0.04±0.015、 p = 0.40)。次に、左右のMC間のコヒーレンスと相関を計算し (図8C、D;左MC LFPは、右MC LFPの後、-1.167 ms±0.667 ms)~1.2 ms以内に続き、正常マウスの左MCのLFP(1-100 Hz)に同期した推定PynまたはINスパイクの大きさを計算しました(図8E)。これは、Pynと比較して、推定INのより強い低γコヒーレンスを示しました。
図1:電極とマルチチャンネル記録システムの図。 (A)マイクロドライブシステムのイメージ。私。コンピュータ設計基板の図面と仕様。ii. 可動マイクロドライブの概略図。(B)マイクロドライブシステムとマルチチャンネル可動式単電極ステップ。私。Niクロム線;電極の構成部分と、 iii. コンピュータ設計基板の組み立てコネクタと8本のガイドチューブを含む電極の予備組み立て。v.マイクロドライブの反対側。vi、vii。Niクロム線はガイドチューブに連続して装填されます。VIII-Xです。露出した各ワイヤは各ピンに連続して絡み合い、続いて各ピンに導電性塗料をコーティングします。xi,xii.ピンはエポキシ樹脂で覆われています。XIII、XIV。 金めっき。(C)自由に動くマウスのMCにおける細胞外記録の実験的デザイン。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:段階的な外科的処置。 i、ii.マウスの毛皮を剃り、ベタジンスクラブとアルコールを交互に3回投与して手術部位を消毒します。 マウスの頭蓋骨をきれいにします。iv. レベリング。v.脳の位置をマークします。ステンレス鋼のネジの位置に印を付けます。ステンレス鋼のネジを挿入します。ネジを基準電極と接地電極とリンクします。ix,xです。歯科用セメントを混ぜます。歯科用セメントで壁を作ります。xii、xiii。両側MCの上に2つの小さな穴を開け、続いて硬膜を取り外します。xiv. マイクロドライブシステムを準備します。xv-xixです。マイクロドライブシステムを移植し、その後、リンコマイシン塩酸塩と塩酸リドカインを含むゲルで局所治療を行い、術後の痛みを和らげます。 マイクロドライブシステムを導電性銅箔テープで保護します。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:意識のあるマウスの頭部固定記録の図。 (A)自由に動く記録の模式図。(B)自由に動く記録からの画像の詳細。私。埋め込まれたマイクロドライブシステムの平面形状。ii. ヘッドステージIII、IV.マイクロドライブシステムとヘッドステージが接続されています。v.ヘリウムバルーンは、ヘッドステージとマイクロドライブシステムの重量を相殺するために適用されます。(c)電解病変を用いて記録部位の位置を確認する説明図。(D)マウスのMCの電解病変によって標識された記録部位。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:スパイクのソートと分析の図。 (A)スパイクデータをクラスタリングし、結果をエクスポートするためのパラメータ。 私。スパイクデータをインポートします。ii. ソート方法を選択します。iii. κ 平均アルゴリズムを使用してスパイク データを並べ替えます。iv. ソートされた単位から結果をエクスポートします。(B)ソートされたユニットのスパイク間間隔ヒストグラム、オートコレログラム、およびクロスコレログラムを分析するプロセス。私。ソートされたスパイクデータをインポートします。ii. 自己相関分析を実施する。iii. オートコレログラムのパラメータを設定します。iv. スパイク間間隔ヒストグラムを取得します。v. スパイク間隔ヒストグラムのパラメータを設定します。vi. ソートされたユニットからのスパイク間の相互相関を計算します。vii. クロスコレログラムのパラメータを設定します。VIII、IX。結果をエクスポートします。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:連続データ解析の図。 (A)LFPのパワースペクトル、コヒーレンス、および2つのLFP間の相関を使用して計算されたLFP信号を分析するためのプロセスとパラメータ。 i. LFP データをインポートします。ii. バイラテラル MC からの LFP のパワー スペクトル密度を計算します。Aiii.LFPのパワースペクトル密度を計算します。iv,v. LFP 間のコヒーレンスを計算する。vi、vii。2 つの LFP 間の相関関係を計算します。結果をエクスポートします。(B)LFP信号から各周波数範囲をフィルタリングするプロセス。i. LFPデータから異なる周波数帯域を抽出します。II、III.フィルタリングされた LFP を表示します。iv. フィルター処理された LFP を拡張メタファイルとして保存します。(C)ニューロンスパイクとLFPの間のコヒーレンスを解析するプロセス。 I、II.LFP とソートされたスパイクの間のコヒーレンスを計算します。III、IV.結果をエクスポートします。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:記録された信号の代表的なトレース。 スパイクは、30 kHz でサンプリングされた生データから 250 Hz でハイパス フィルター処理されました。LFP は、10 kHz でサンプリングされた生データです。δは、LFPから1〜4Hzでバンドパスフィルタリングされたデルタ周波数帯域です。θ は、LFP から 5 〜 12 Hz でフィルタリングされたシータ周波数帯域です。βは、LFPから13〜30Hzでフィルタリングされたベータ周波数帯域です。低γは、LFPから30〜70Hzでフィルタリングされた低ガンマ周波数帯域でした。高γは、LFPから70〜100Hzでフィルタリングされた高ガンマ周波数帯域でした。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図7:選別されたユニットの特性とその発射パターン。 (A,B) 選別されたユニットは、同じ電極からの主成分分析(PCA)を使用してクラスター化されました。(C、D)推定興奮性ニューロン(Pyn)と推定される抑制性ニューロン(IN)の自己相関(上)とスパイク間間隔ヒストグラム(下)。(E)推定Pynの谷幅は、推定INの谷幅よりも有意に高かった(推定Pyn:n = 1,055スパイク、推定IN:n = 1,985スパイク)。(F)推定Pynの波形持続時間は、推定INの波形持続時間よりも強かった(推定Pyn:n = 1,005スパイク、推定IN:n = 1,059スパイク)。(G) 推定 Pyn と IN の相互相関。Mann-Whitney検定による統計分析。すべてのデータは、平均の平均±標準誤差、**p < 0.01、***p < 0.001として表されます。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図8:マウスの両側MCからの2つのLFPの解析と、スパイクイベントとLFPのコヒーレンス。 (A,B)マウスの各周波数帯域における両側MCの正規化されたパワースペクトル(n = 3)。(C)左右のMC間の2つのLFPのコヒーレンスの曲線(n = 3)。(D)±100msのタイムラグ(n=3)における左右MCの相関を示す2つのLFPの相互相関曲線。(E)マウスのMCにおけるスパイク場コヒーレンスの曲線。Mann-Whitney検定による統計分析。すべてのデータは、平均±平均の標準誤差として表されます。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
自由に動くマウスのマルチチャンネル記録は、神経科学研究において有用な技術であると考えられてきましたが、初心者が信号を記録して解析することはまだ非常に困難です。本研究では、マイクロドライブシステムの作成と電極注入の簡易ガイドラインと、スパイクソーティングソフトウェアと神経生理学的データ解析用ソフトウェア を介して 電気信号を捕捉および分析するための簡略化された手順を提供します。
自作のマイクロドライブシステムの品質は、自由に動くマウス14,15,16,17の安定で定性的な信号の獲得に大きく貢献することから、本研究では、マイクロドライブシステムのために、より頑丈で軽量な構造を設計・用い、初心者でもマイクロドライブシステムを構築するための製造手順を簡単かつ明確に理解することができる。さらに、設計されたマイクロドライブシステムの構造には、以前の研究で使用された大型で重いマイクロドライブシステムとは異なり、金物店で簡単に入手できる安価な材料が含まれています14,15。このマイクロドライブシステムは、不快感を軽減し、記録中に自由に動くマウスからの衝撃に耐えることができます。一方、マイクロドライブシステムのサイズと形状をさらに改良し、手術中に電極の先端を脳内まで観察、挿入、移動できるようにすることで、初心者に役立つ可能性があります。また、マイクロドライブシステムに採用されているシンプルなスライド構造は、高精度のスクリューを用いて脳内で正確に進行するため、対象となる脳領域の複数の層を精密に制御することができます。実際、これは、長期間の実験期間にわたって自由に動く動物の細胞外シグナルを捕捉するために非常に重要です。とりわけ、このマイクロドライブシステムの利点は、そのシンプルさと柔軟性です。ただし、チャネル数が少なく、単一電極のアレイを使用することは、新しいバージョンでさらに改善されるはずです。
本研究にも注目に値するいくつかの改善点があります。マイクロドライブシステムは、従来のシステムに比べて小型化され、形状も変更されているため、より広い視野と広い作業スペースを実現しました。さらに、マウスの頭蓋骨の壁は歯科用セメントとステンレス製のネジでできており、マイクロドライブシステムをマウスの頭にしっかりと取り付けることができました。さらに、歯科用セメントの壁は、硬膜とマイクロドライブシステムの可動部分のない脳表面を保護する効果があった歯科用セメントを注ぐ前に、マウスの頭蓋骨の穴を覆うためにワセリンを装填することを可能にしました。これらの改良は、初心者でも簡単かつ自信を持ってマイクロドライブシステムをマウスの脳に埋め込むことができるため、有用です。
マルチチャンネルの細胞外記録では、数学的に複雑なプログラミング言語17を用いて記録されたシグナルを解析することに別の困難があると広く信じられている。したがって、特にスパイクソーティング、LFPデータ解析、および電気生理学で一般的に使用されるソフトウェアを使用したそれらの間の関係の計算に関して、初心者に明確なガイドラインを提供します。さらに、PCA法でクラスタリングした単電極アッセイから記録されたユニットは、ソートされたニューロンのスパイク間間隔や谷とピークの間の幅など、解析のための多くの特徴を持つことを強くお勧めします。重要なのは、スパイクを含む信号とLFPの関係が、複数の動作を媒介するために重要であるということです。また、神経生理学的データ分析用のソフトウェアで信頼できるスクリプトを使用して、スパイク-スパイク、LFP-LFP、およびスパイク-LFPの相関を測定するための一連の簡単な図も提供します。これらの図により、初心者は自由に動くマウスで記録された信号の処理と分析をすばやく開始できます。さらに、この独自のソフトウェアで処理された結果とデータは、Fieldtripなどのオープンソースのツールボックスと組み合わせて使用し、事前に追加の分析を行うことができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
本研究は、中国国家自然科学基金会(31871170、32170950、31970915)、広東省自然科学基金会(2021A1515010804および2023A1515010899)、広東省自然科学基金会大規模栽培プロジェクト(2018B030336001)、広東省助成金:脳疾患治療のための主要技術(2018B030332001)の助成金を受けて行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.54 mm pin header | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 1 x 5 | Applying for the movable micro-drive which can slide on its stulls. |
| Adobe Illustrator CC 2017 | Adobe | N/A | To optimize images from GraphPad. |
| BlackRock Microsystems | Blackrock Neurotech | Cerebus | This systems includes headsatge, DA convert, amplifier and computer. |
| Brass nut | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 brass nut | The nut fixes the position of screw. |
| Brass screw | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 x 11 mm brass screw | A screw that hold the movable micro-drive. |
| C57BL/6J | Guangdong Zhiyuan Biomedical Technology Co., LTD. | N/A | 12 weeks of age. |
| Centrifuge tube | Biosharp | 15 mL; BS-150-M | To store mice brain with sucrose sulutions. |
| Conducting paint | Structure Probe, Inc. | 7440-22-4 | To improve the lead-connecting quality between connector pins and Ni-wires. |
| Conductive copper foil tape | 3M | 1181 | To reduce interferenc. |
| Connector | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 2 x 10P | To connect the headtage to micro-drive system. |
| DC Power supply | Maisheng | MS-305D | A power device for electrolytic lesion. |
| Dental cement | Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. | N/A | To fix the electrode arrays on mouse's skull after finishing the implantation. |
| Digital analog converter | Blackrock | 128-Channel | A device that converts digital data into analog signals. |
| Epoxy resin | Alteco | N/A | To cover pins. |
| Excel | Microsoft | N/A | To summarize data after analysis. |
| Eye scissors | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or cutting the Ni-chrome wire. |
| Fine forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery. |
| Forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or assembling the mirco-drive system. |
| Freezing microtome | Leica | CM3050 S | Cut the mouse’s brain into slices |
| Fused silica capillary tubing | Zhengzhou INNOSEP Scientific Co., Ltd. | TSP050125 | To serve as the guide tubes for Ni-chrome wires. |
| Glass microelectrode | Sutter Instrument Company | BF100-50-10 | To mark the desired locations for implantation using the filled ink. |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad Software | N/A | To analyze and visualize the results. |
| Guide-tube | Polymicro technologies | 1068150020 | To load Ni-chrome wires. |
| Headstage | Blackrock | N/A | A tool of transmitting signals. |
| Helium balloon | Yili Festive products Co., Ltd. | 24 inch | To offset the weight of headstage and micro-drive system. |
| Ink | Sailor Pen Co.,LTD. | 13-2001 | To mark the desired locations for implantation. |
| Iodine tincture | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To disinfect mouse's scalp. |
| Lincomycin in Hydrochloride and Lidocaine hydrochloride gel | Hubei kangzheng pharmaceutical co., ltd. | 10g | A drug used to reduce inflammation. |
| Meloxicam | Vicki Biotechnology Co., Ltd. | 71125-38-7 | To reduce postoperative pain in mice. |
| Micromanipulators | Scientifica | Scientifica IVM Triple | For electrode arrays implantation. |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni-E | Capture the images of brain sections |
| nanoZ impedance tester | Plexon | nanoZ | To measure impedance or performing electrode impedance spectroscopy (EIS) for multichannel microelectrode arrays. |
| NeuroExplorer | Plexon | NeuroExplorer | A tool for analyzing the electrophysiological data. |
| NeuroExplorer | Plexon, USA | N/A | A software. |
| Ni-chrome wire | California Fine Wire Co. | M472490 | 35 μm Ni-chrome wire. |
| Offline Sorter | Plexon | Offline Sorter | A tool for sorting the recorded multi-units. |
| PCB board | Hangzhou Jiepei Information Technology Co., Ltd. | N/A | Computer designed board. |
| Pentobarbital | Sigma | P3761 | To anesthetize mice. |
| Pentobarbital sodium | Sigma | 57-33-0 | To anesthetize the mouse. |
| Peristaltic pump | Longer | BT100-1F | A device used for perfusion |
| Polyformaldehyde | Sangon Biotech | A500684-0500 | The main component of fixative solution for fixation of mouse brains |
| PtCl4 | Tianjin Jinbolan Fine Chemical Co., Ltd. | 13454-96-1 | Preparation for gold plating liquid. |
| Saline | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To clean the mouse's skull. |
| Silver wire | Suzhou Xinye Electronics Co., Ltd. | 2 mm diameter | Applying for ground and reference electrodes. |
| Skull drill | RWD Life Science | 78001 | To drill carefully two small holes on mouse's skull. |
| Stainless steel screws | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | M0.8 x 2 | To protect the micro-drive system and link the ground and reference electrodes. |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 68513 | To perform the stereotaxic coordinates of bilateral motor cortex. |
| Sucrose | Damao | 57-50-1 | To dehydrate the mouse brains after perfusion. |
| Super glue | Henkel AG & Co. | PSK5C | To fix the guide tube and Ni-chrome wire. |
| Temperature controller | Harvard Apparatus | TCAT-2 | To maintain mouse's rectal temperature at 37°C |
| Tetracycline eye ointment | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To protect the mouse's eyes during surgery. |
| Thread | Rapala | N/A | To link ballon and headstage. |
| Vaseline | Unilever plc | N/A | To cover the gap between electrode arrays and mouse's skull. |
References
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).
- Singer, W. Synchronization of cortical activity and its putative role in information processing and learning. Annual Review of Physiology. 55, 349-374 (1993).
- Arroyo-García, L. E., et al. Impaired spike-gamma coupling of area CA3 fast-spiking interneurons as the earliest functional impairment in the App(NL-G-F) mouse model of Alzheimer's disease. Molecular Psychiatry. 26 (10), 5557-5567 (2021).
- Ozawa, M., et al. Experience-dependent resonance in amygdalo-cortical circuits supports fear memory retrieval following extinction. Nature Communications. 11 (1), 4358 (2020).
- Vinck, M., Batista-Brito, R., Knoblich, U., Cardin, J. A. Arousal and locomotion make distinct contributions to cortical activity patterns and visual encoding. Neuron. 86 (3), 740-754 (2015).
- Beck, M. H., et al. long-term dopamine depletion causes enhanced beta oscillations in the cortico-basal ganglia loop of parkinsonian rats. Experimental Neurology. 286, 124-136 (2016).
- Magill, P. J., Bolam, J. P., Bevan, M. D. Relationship of activity in the subthalamic nucleus-globus pallidus network to cortical electroencephalogram. Journal of Neuroscience. 20 (2), 820-833 (2000).
- Magill, P. J., et al. Changes in functional connectivity within the rat striatopallidal axis during global brain activation in vivo. Journal of Neuroscience. 26 (23), 6318-6329 (2006).
- Rapeaux, A. B., Constandinou, T. G. Implantable brain machine interfaces: First-in-human studies, technology challenges and trends. Current Opinion in Biotechnology. 72, 102-111 (2021).
- Tort, A. B., et al. Dynamic cross-frequency couplings of local field potential oscillations in rat striatum and hippocampus during performance of a T-maze task. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20517-20522 (2008).
- Yamamoto, J., Wilson, M. A. Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals. Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2430-2440 (2008).
- Chang, E. H., Frattini, S. A., Robbiati, S., Huerta, P. T. Construction of microdrive arrays for chronic neural recordings in awake behaving mice. Journal of Visualized Experiments. (77), e50470 (2013).
- Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. Journal of Visualized Experiments. (61), e3568 (2012).
- Lansink, C. S., et al. A split microdrive for simultaneous multi-electrode recordings from two brain areas in awake small animals. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 129-138 (2007).
- Sato, T., Suzuki, T., Mabuchi, K. A new multi-electrode array design for chronic neural recording, with independent and automatic hydraulic positioning. Journal of Neuroscience Methods. 160 (1), 45-51 (2007).
- van Daal, R. J. J., et al. Implantation of Neuropixels probes for chronic recording of neuronal activity in freely behaving mice and rats. Nature Protocols. 16 (7), 3322-3347 (2021).
- Unakafova, V. A., Gail, A. Comparing open-source toolboxes for processing and analysis of spike and local field potentials data. Frontiers in Neuroinformatics. 13, 57 (2019).
- Mao, L., Wang, H., Qiao, L., Wang, X. Disruption of Nrf2 enhances the upregulation of nuclear factor-kappaB activity, tumor necrosis factor-alpha, and matrix metalloproteinase-9 after spinal cord injury in mice. Mediators of Inflammation. 2010, 238321 (2010).
- Jin, Z., Zhang, Z., Ke, J., Wang, Y., Wu, H. Exercise-linked irisin prevents mortality and enhances cognition in a mice model of cerebral ischemia by regulating Klotho expression. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1697070 (2021).
- Ding, X., et al. Spreading of TDP-43 pathology via pyramidal tract induces ALS-like phenotypes in TDP-43 transgenic mice. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 15 (2021).
- Cao, W., et al. Gamma oscillation dysfunction in mPFC leads to social deficits in neuroligin 3 R451C knockin mice. Neuron. 97 (6), 1253-1260 (2018).
