Summary
Протокол описывает методологию внеклеточной регистрации в моторной коре (МК) для выявления внеклеточных электрофизиологических свойств у свободно движущихся мышей, находящихся в сознании, а также анализ данных потенциалов локального поля (LFP) и спайков, что полезно для оценки нейронной активности сети, лежащей в основе интересующего поведения.
Abstract
Протокол направлен на раскрытие свойств возбуждения нейронов и сетевых локальных полевых потенциалов (LFP) у мышей, выполняющих специфические задачи, путем корреляции электрофизиологических сигналов со спонтанным и/или специфическим поведением. Этот метод представляет собой ценный инструмент в изучении активности нейронной сети, лежащей в основе этого поведения. В статье подробно описана и полная процедура имплантации электродов и последующей внеклеточной регистрации у мышей со свободноподвижным сознанием. Исследование включает в себя детальный метод имплантации микроэлектродных решеток, захвата сигналов LFP и нейрональных спайков в моторной коре (МК) с использованием многоканальной системы и последующего автономного анализа данных. Преимущество многоканальной регистрации у животных, находящихся в сознании, заключается в том, что можно получить и сравнить большее количество спайковых нейронов и подтипов нейронов, что позволяет оценить взаимосвязь между конкретным поведением и связанными с ним электрофизиологическими сигналами. Примечательно, что методика многоканальной внеклеточной регистрации и процедура анализа данных, описанная в настоящем исследовании, могут быть применены и к другим областям мозга при проведении экспериментов на мышах.
Introduction
Потенциал локального поля (LFP), важный компонент внеклеточных сигналов, отражает синаптическую активность больших популяций нейронов, которые формируют нейронный код длямножественного поведения. Считается, что спайки, генерируемые нейронной активностью, вносят свой вклад в LFP и важны для нейронного кодирования2. Было доказано, что изменения в спайках и LFP опосредуют некоторые заболевания мозга, такие как болезнь Альцгеймера, а также эмоции, такие как страх и т. д. Стоит отметить, что во многих исследованиях было подчеркнуто, что активность спайков значительно различается между бодрствующим и наркозным состояниями у животных5. Несмотря на то, что записи у животных, находящихся под наркозом, дают возможность оценить LFP с минимальными артефактами в строго определенных состояниях синхронизации коры головного мозга, результаты в некоторой степени отличаются от тех, которые можно найти у бодрствующих субъектов 6,7,8. Таким образом, более значимо обнаруживать нейронную активность в длительных временных масштабах и больших пространственных масштабах при различных заболеваниях в бодрствующем состоянии мозга с помощью электродов, имплантированных в мозг. Эта рукопись содержит информацию для начинающих о том, как создать систему микропривода и установить параметры с помощью общего программного обеспечения для быстрого и простого вычисления сигналов спайков и LFP, чтобы начать запись и анализ.
Несмотря на то, что неинвазивная регистрация функций мозга, например, с помощью электроэнцефалограммы (ЭЭГ) и потенциалов, связанных с событиями (ERP), регистрируемых с кожи головы, широко используется в исследованиях на людях и грызунах, данные ЭЭГ и ERP имеют низкие пространственные и временные свойства и, таким образом, не могут обнаружить точные сигналы, производимые близлежащей дендритной синаптической активностью вопределенной области мозга. В настоящее время, используя преимущества многоканальной записи у животных, находящихся в сознании, нейронная активность в более глубоких слоях мозга может регистрироваться хронически и прогрессивно путем имплантации системы микродрайвов в мозг приматов или грызунов во время многочисленных поведенческих тестов 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Короче говоря, исследователи могут сконструировать систему микроприводов, которая может быть использована для независимого позиционирования электродов или тетродов для воздействия на различныечасти мозга. Например, Chang et al. описали методы регистрации спайков и LFP у мышей путем сборки легкого и компактного микропривода12. Кроме того, коммерчески доступны микромеханические кремниевые зонды с изготовленными по индивидуальному заказу вспомогательными компонентами для регистрации нескольких одиночных нейронов и LFP у грызунов во время выполнения поведенческих задач13. Несмотря на то, что для сборки систем микроприводов использовались различные конструкции, они по-прежнему имеют ограниченный успех с точки зрения сложности и веса всей системы микроприводов. Например, Lansink et al. показали многоканальную микроприводную систему со сложной структурой для записи из одной области мозга14. Sato et al. сообщили о многоканальной системе микропривода, демонстрирующей функцию автоматического гидравлического позиционирования15. Основные недостатки этих микроприводных систем заключаются в том, что они слишком тяжелые, чтобы мыши могли свободно двигаться, и их сложно собрать новичкам. Несмотря на то, что многоканальная внеклеточная запись показала себя подходящей и эффективной технологией для измерения нейронной активности во время поведенческих тестов, новичкам нелегко записывать и анализировать сигналы, полученные сложной системой микропривода. Учитывая, что у свободно движущихся мышей сложно запустить весь процесс работы многоканальной внеклеточной регистрации и анализа данных16,17, в настоящей статье представлены упрощенные рекомендации по ознакомлению с подробным процессом создания микроприводной системы с использованием общедоступных компонентов и настроек; Кроме того, в общем программном обеспечении предусмотрены параметры для быстрого и простого вычисления сигналов спайка и LFP. Кроме того, в этом протоколе мышь может свободно перемещаться за счет использования гелиевого баллона, что способствует компенсации веса головной сцены и системы микропривода. В целом, в настоящем исследовании мы описываем, как легко построить систему микроприводов и оптимизировать процессы записи и анализа данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все мыши были получены коммерческим путем и содержались в цикле 12 ч свет/12 ч темнота (свет включается в 08:00 утра по местному времени) при комнатной температуре 22-25 °C и относительной влажности 50%-60%. Мыши имели доступ к постоянному снабжению пищей и водой. Все эксперименты проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Южно-Китайского педагогического университета и были одобрены Институциональным комитетом по этике животных. Для экспериментов использовались самцы мышей C57BL/6J в возрасте 3-5 месяцев.
1. Сборка системы микропривода
- Соедините две платы, разработанные компьютером, с помощью двух столбиков и винта, который удерживает подвижный микропривод, и прикрепите разъем к одной плате (рис. 1A, Bi-iii). Приводите в движение микропривод, закручивая винт (0,5 мм/круг).
- Убедитесь, что микропривод может нести два набора из восьми направляющих трубок (длина ~3 см, внутренний диаметр ~50 мкм, внешний диаметр ~125 мкм) для каждой стороны области MC, а затем обрежьте его до одинаковой длины (не менее 15 мм; Рисунок 1Biv, v).
- Отрежьте 16 нихромовых проволок (длиной ~5 см) диаметром 35 мкм, а затем последовательно загрузите их в направляющие трубки с последующим нанесением клея для их фиксации (рис. 1Bi, vi, vii).
- Снимите изоляцию провода, последовательно прикрепите каждый открытый провод к каждому контакту разъема в соответствии с картой каналов, а также к опорному электроду и заземляющему электроду, а затем медленно нанесите токопроводящую краску на каждый контакт (рис. 1Bviii-x).
- Покройте штифты эпоксидной смолой (рис. 1Axi, xii), а затем выполните золотое покрытие с помощью тестера импеданса, чтобы уменьшить импеданс концов электродов до ~350 кОм (рис. 1Bxiii, xiv). Установите параметры импедансометра следующим образом: −10,08 мкА постоянного тока в течение 1 с раствором для золочения, включая 5 мМ PtCl4.
- Наконец, переместите микропривод наверх, закрутив винт. Проверьте габаритные размеры модифицированной системы микроприводов, как показано на рисунке 1A (примерно 15 мм в длину, 10 мм в ширину, 20 мм в высоту, вес ~1 г). Ознакомьтесь с подробными техническими характеристиками спроектированной компьютером платы и подвижного компонента на рисунке 1Ai, ii.
2. Имплантация электродных решеток
- Перед началом операции простерилизуйте операционные наборы, наденьте стерильные перчатки и наденьте стерильный белый халат врача.
- Чтобы купировать боль, используйте подкожную инъекцию мелоксикама (5 мг/кг) для мыши в индукционной камере. Затем обезболивают мышь внутрибрюшинной (в/в) инъекцией пентобарбитала (80 мг/кг) в индукционную камеру18,19. Применяют дополнительную дозу пентобарбитала (20 мг/кг/ч), если щипковый рефлекс пальца ноги все еще присутствует.
- Зафиксируйте мышь в стереотаксическом аппарате и поддерживайте ее ректальную температуру на уровне 37 °C с помощью регулятора температуры.
- Нанесите тетрациклиновую глазную мазь на оба глаза мыши и снова смените стерильные перчатки перед операцией.
- Сбрейте шерсть мыши и продезинфицируйте место операции тремя чередующимися циклами бетадинового скраба и спирта с помощью стерильного аппликатора с ватным наконечником концентрическими кругами, начиная с центра и двигаясь наружу (рис. 2i, ii). Сделайте небольшой разрез по средней линии (~15 мм), чтобы обнажить череп. Немедленно нанесите 1% лидокаин локально на мышцы шеи для облегчения боли. Затем удалите остатки ткани ножницами и очистите череп ватными палочками, покрытыми физиологическим раствором (рис. 2iii).
- С помощью стеклянного микроэлектрода, заполненного чернилами, отмечают желаемые места двустороннего МЦ для имплантации (рис. 2iv, v). Согласно предыдущему исследованию 20, расположение двусторонней МЦ выглядит следующим образом: 0,74 мм кпереди от брегмы и1,25 мм латеральнее средней линии.
- Вставьте четыре винта из нержавеющей стали (диаметром 0,8 мм) для защиты системы микропривода, а затем соедините все винты вместе с опорным и заземляющим электродами, а затем покрыте смешанным стоматологическим цементом для формирования стенок (Рисунок 2vi-xi).
- Осторожно просверлите два небольших отверстия (~1,5мм2) с левой и правой стороны скоординированного черепа в области MC (Рисунок 2xii). Используйте стереотаксические координаты двусторонней МС: 0,74 мм кпереди от брегмы, 1,25 мм латеральнее средней линии и 0,5 мм вентрально от твердой мозговой оболочки.
- Осторожно извлеките твердую мозговую оболочку из отверстий тонкими щипцами (Рисунок 2xiii).
- Вставьте систему микропривода в центр отверстий с помощью микроманипулятора со скоростью 10 мкм/с (рис. 2xiv-xvii).
- Залейте вазелин в стенки стоматологического цемента после завершения установки системы микропривода (Рисунок 2xviii).
- Соедините нижнюю пластину системы микропривода и стенки стоматологического цемента со смешанным стоматологическим цементом (Рисунок 2xix)
- Промыть разрез физиологическим раствором с последующей местной обработкой гелем, содержащим линкомицина гидрохлорид и лидокаина гидрохлорид, для облегчения послеоперационной боли.
- Намотайте токопроводящую ленту из медной фольги на имплантированную систему микропривода (рис. 2xx).
- Переместите мышь в клетку с температурой 31-33 °C и наблюдайте за ее восстановлением после анестезии.
- Дайте мышам восстановиться в течение 1 недели при раздельном кормлении. Проверьте и обработайте разрез 3 днями непрерывного нанесения геля, содержащего линкомицина гидрохлорид и лидокаина гидрохлорид.
3. Многоканальная запись в билатеральной МЦ у свободно движущихся мышей
- Держите голову бодрствующей мыши легко и осторожно. Переместите электродные решетки вниз (глубина ~0,1 мм), закрутив винт на подвижной части системы микропривода (Рисунок 1Aii) не менее чем за 1 день.
- Держите голову бодрствующей мыши легко и осторожно. Соедините центр потолка и гелиевый баллон (заполненный примерно 0,02 л гелия) резьбой, чтобы компенсировать вес головного столика и системы микропривода (рис. 3A, B).
- Захват необработанных сигналов с помощью регистрирующих электродов и многоканальных систем путем дискретизации на частоте 30 кГц в программном обеспечении для записи, а затем оцифровка с помощью цифро-аналогового (ЦАП) преобразователя из многоканальных систем.
- Извлеките сигналы LFP из необработанных данных путем передискретизации на частоте 10 кГц в программном обеспечении для записи, а затем используйте режекторный фильтр из программного обеспечения для записи, чтобы удалить линейный шум 50 Гц.
- Записывайте необработанные данные в стабильном состоянии со свободно движущейся мыши в течение не менее 60 секунд. После завершения записи медленно отсоедините соединение между насадкой и системой микропривода и верните мышь обратно в домашнюю клетку.
- Сохраните записанные данные в компьютере и проанализируйте их в автономном режиме (рис. 4 и рис. 5).
- После завершения эксперимента выполните эвтаназию в соответствии с рекомендациями института, а затем подтвердите расположение электродов с помощью источника питания на выходе 3 В, чтобы выполнить электролитическое поражение в течение 1 минуты с последующим гистологическим анализом. Разрежьте мозг мыши на кусочки размером 30 мкм с помощью замораживающего микротома, соберите срезы MC, а затем сделайте снимки с помощью микроскопа (рис. 3C, D).
4. Сортировка и анализ шипов
- Нажмите File > Open > Nev files в программном обеспечении для сортировки пиков, чтобы открыть данные о пиках, отобранные на частоте 30 кГц (рис. 4Ai).
- Нажмите кнопку «Информация», чтобы выбрать несортированный канал, а затем выберите «Сортировать» > « Изменить метод сортировки» > «Использовать K-средние». Нажмите кнопку Valley-Seeking Sort > K-Secondary Sorting , чтобы получить отсортированные единицы (рис. 4Aii, iii).
- Нажмите «Файл» > « Сохранить как», сохраните отсортированные данные о пиках с расширением .nev и выберите «Файл > экспорт данных для каждой осциллограммы », чтобы экспортировать результаты PCA с расширением файла .txt (рисунок 4Aiv).
- Нажмите на File > Import Data > Blackrock File в программном обеспечении для анализа нейрофизиологических данных, чтобы открыть отсортированный файл спайков (Рисунок 4Bi).
- Щелкните Анализ > Автокоррелограммы, чтобы получить автокоррелограмму для выбранной единицы, а затем установите параметры следующим образом: минимальное значение X на −0,05 с, максимальное значение X на 0,05 с и значение Бин на 0,001 (рис. 4Bii, iii).
- Загрузите отсортированные данные о спайках, нажмите Анализ > Гистограммы межспайковых интервалов, чтобы получить гистограмму межспайкового интервала, а затем установите следующие параметры: Минимальное значение интервала 0 с, Максимальное значение интервала 0,1 с и Значение ячейки 0,001 (рис. 4Biv, v).
- Щелкните Анализ > Кросскоррелограммы, чтобы получить перекрестную коррелограмму между двумя отсортированными единичными событиями, а затем установите эталонные события и параметры следующим образом: минимальное значение X на −0,1 с, максимальное значение X на 0,1 с и значение Bin на 0,001 (рис. 4Bvi, vii).
- Нажмите « Результаты» > «Численные результаты», чтобы сохранить результаты автокоррелограммы, гистограммы межспайкового интервала и кросс-коррелограммы с .xls расширениями имен файлов (рисунок 4Bviii, ix). Проанализируйте данные и нарисуйте график.
5. Анализ LFP
- Нажмите на File Import Data > Blackrock File в программном обеспечении для анализа нейрофизиологических данных, чтобы открыть данные непрерывного сигнала, дискретизированные на частоте 10 кГц (рис. 5Ai).
- Нажмите на Analysis > Spectrum for Continuous (Анализ спектр для непрерывного ), чтобы проанализировать спектр мощности для LFP из выбранного канала. Установите параметры следующим образом: Число значений частоты на 8,192, Значение множественных конусов на 3-5, Нормализация процента от общей спектральной плотности мощности (PSD) и Диапазон частот от 1 Гц до 100 Гц (рис. 5Aii, iii).
- Нажмите на Analysis > Coherence for Continuous (Анализ когерентность для непрерывного), чтобы проанализировать когерентность для двух LFP с левой и правой сторон MC. Задайте опорный канал и параметры следующим образом: Рассчитайте значения когерентности, число значений частоты — 8 192, значение Multiple Tapers — 3–5 и диапазон частот от 1 Гц до 100 Гц (рис. 5, v).
- Нажмите на Analysis > Corr. with Cont. Variables , чтобы проанализировать корреляцию между двумя LFP с левой и правой сторон MC. Установите опорный канал (данные LFP) и параметры следующим образом: минимальное значение X на −0,1 с, максимальное значение X на 0,1 с и значение Bin на 0,001 (рис. 5Avi, vii).
- Нажмите на Results > Numerical Results , чтобы сохранить результаты PSD, когерентности и корреляции с расширением имени файла .xls (рисунок 5Aviii, ix).
- Выберите канал, для которого необходимо извлечь репрезентативные трассы для каждой полосы частот, нажмите кнопку Edit > Digital Filtering of Continuous Variables (Редактировать цифровую фильтрацию непрерывных переменных), чтобы получить каждую полосу частот, а затем установите параметры следующим образом: Filter Freq. Response as Bandpass, Filter Implementation at Infinite impulse response (IIR) Butterworth) и Filter Order (Порядок фильтрации) на 2. Наконец, установите интересующий диапазон частот (рис. 5Bi-iv).
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь использовались следующие диапазоны частот: дельта (δ, 1-4 Гц), тета (θ, 5-12 Гц), бета (β, 13-30 Гц), низкая гамма (низкая γ, 30-70 Гц) и высокая гамма (высокая γ, 70-100 Гц) осцилляции. - Проанализируйте данные и нарисуйте график.
6. Корреляции между спайком и LFP
- Нажмите «Файл» > «Импортировать данные» > Blackrock File в программном обеспечении для анализа нейрофизиологических данных, чтобы открыть данные непрерывного сигнала и данные о спайках.
- Нажмите « Анализ» > «Анализ когерентности», чтобы проанализировать когерентность между пиками и LFP из выбранного канала. Задайте эталонную переменную (время пика) и параметры следующим образом: Расчет при значениях когерентности, Число значений частоты 512, Значение множественных конусов на 3-5 и диапазон частот от 1 Гц до 100 Гц (Рисунок 5Ci, ii).
- Нажмите на Results > Numerical Results , чтобы сохранить результат согласованности поля spike с расширением файла .xls (рис. 5Ciii, iv).
- Проанализируйте данные и нарисуйте график.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Фильтр высоких частот (250 Гц) был применен для извлечения многозначных пиков из необработанных сигналов (рис. 6A). Кроме того, были верифицированы записанные единицы измерения из МС обычной мыши, отсортированные по PCA (рис. 7A-D), а также были записаны ширина долины и длительность сигнала единиц в МС мыши. Результаты показали, что как ширина долины, так и длительность формы волны предполагаемых пирамидных нейронов MC (Pyn) у мышей выше, чем у предполагаемых интернейронов (IN) (рис. 7E, F; тест Манна-Уитни с двумя образцами; для ширины долины предполагаемый Pyn: 0,636 мс ± 0,004 мс, предполагаемый IN: 0,614 мс ± 0,001 мс, p = 0,002; для длительности сигнала предполагаемый Pyn: 0,095 мс ± 0,004 мс, предполагаемый IN: 0,054 мс ± 0,002 мс, p = 1,402 x 10−16), что соответствует характеристикам Pyn и IN в предыдущих исследованиях21. Мы также вычислили кросс-коррелограмму между предполагаемыми пиками Pyn и IN, установив предполагаемые пики Pyn в качестве эталона, и обнаружили положительный пик на ~18 мс (рис. 7G), указывающий на то, что предполагаемый всплеск Pyn происходит до предполагаемого всплеска IN с окном ~18 мс.
Репрезентативные трассы каждой полосы частот отфильтровывались от LFP с помощью БИХ-фильтра в программном обеспечении для анализа нейрофизиологических данных (рис. 6A). При анализе LFP LFP левого и правого MC у нормальных мышей были схожи по спектру мощности, что позволяет предположить синхронизированную активность между левым и правым MC (рис. 8A, B; два образца теста Манна-Уитни; для δ, левая MC: 50,71 ± 1,136, правая MC: 50,47 ± 1,213, p = 0,70; для θ левая MC: 2,197 ± 0,187, правая MC: 2,068 ± 0,193, p = 0,40; для β левая МК: 0,222 ± 0,058, правая МС: 0,206 ± 0,055, p = 0,70; для низких γ левая МС: 0,114 ± 0,034, правая МС: 0,093 ± 0,018, p = 0,70; для высоких γ левая МС: 0,054 ± 0,027, правая МС: 0,04 ± 0,015, p = 0,40). Затем мы рассчитали когерентность и корреляцию между левым и правым MC (рис. 8C, D; левый MC LFP следует в пределах окна ~1,2 мс после правого MC LFP, −1,167 мс ± 0,667 мс) и вычислили величину предполагаемого пика Pyn или IN, синхронизированного с LFP (1-100 Гц) в левой MC обычной мыши (рис. 8E). Это показало более сильную низкую γ когерентности для предполагаемого IN по сравнению с Pyn.
Рисунок 1: Схема электродов и многоканальной системы регистрации. (A) Иллюстрация системы микропривода. я. Чертеж и спецификация платы, разработанной компьютером. ii. Принципиальная схема подвижного микропривода. (B) Система микропривода и многоканальные подвижные одноэлектродные ступени. я. Нихромовые провода; ii. Составные части электрода; iii. Сборка плат компьютерной разработки; iv. Предварительная сборка электродов, включая соединители и восемь направляющих трубок; В. Другая сторона микропривода; VI,VII. Нихромовые проволоки последовательно загружаются в направляющие трубы; VIII-X. Каждый открытый провод последовательно обвивается с каждым штифтом, после чего на каждый штифт наносится токопроводящая краска; XI,XII. Штифты покрыты эпоксидной смолой; XIII,XIV. Золочение. (C) Экспериментальный дизайн внеклеточной записи в МС свободно движущейся мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Пошаговая хирургическая процедура. Сбрейте шерсть мыши и продезинфицируйте место операции тремя чередующимися циклами скраба с бетадином и спиртом. iii. Очистите череп мыши. iv. Выравнивание. В. Отметьте расположение мозга. vi. Отметьте положение винтов из нержавеющей стали. vii. Вставьте винты из нержавеющей стали. viii. Соедините винты вместе с опорным и заземляющим электродами. IX,X. Смешайте стоматологический цемент. xi. Постройте стену с помощью стоматологического цемента. XII,XIII. Просверлите два небольших отверстия над двусторонней МК с последующим удалением твердой мозговой оболочки. xiv. Подготовьте систему микропривода. XV-XIX вв. Имплантация системы микропривода с последующим местным лечением гелем, содержащим линкомицина гидрохлорид и лидокаина гидрохлорид для облегчения послеоперационной боли. xx. Защитите систему микропривода проводящей лентой из медной фольги. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Иллюстрация записи, зафиксированной на голове, в сознательной мыши. (A) Принципиальная схема для свободно движущейся записи. (B) Подробная информация об изображениях из свободно движущейся записи. я. План имплантируемой системы микропривода; ii. Headstage; III,IV. Система микропривода и головная сцена соединены; В. Гелиевый баллон применяется для компенсации веса головной сцены и системы микропривода. (C) Иллюстрация проверки местоположения места записи с помощью электролитического поражения. (D) Места записи, помеченные электролитическими повреждениями в МК мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Иллюстрация сортировки и анализа спайков. (A) Параметры для кластеризации данных о спайках и экспорта результатов. я. Импорт данных о спайках; ii. Выберите способ сортировки; iii. Сортировка данных о пиках с помощью алгоритма κ-средних; iv. Экспортируйте результаты из отсортированного блока. (B) Процесс анализа гистограммы межспайкового интервала, автокоррелограммы и кросс-коррелограммы отсортированной единицы. я. Импорт отсортированных данных о спайках; ii. Провести автокорреляционный анализ; iii. Задать параметры для автокоррелограммы; iv. Получить гистограмму межспайкового интервала; v. Задать параметры для гистограммы межспайкового интервала; vi. Вычислить взаимную корреляцию между пиками из отсортированных единиц; vii. Задать параметры для кросс-коррелограммы; VIII,IX. Экспортируйте результаты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Иллюстрация непрерывного анализа данных. (A) Процесс и параметры анализа сигналов LFP, которые были рассчитаны с использованием спектра мощности LFP, когерентности и корреляции между двумя LFP. i. Импорт данных LFP; ii. Рассчитать спектральную плотность мощности для LFP от двустороннего MC; Аiii. Рассчитать спектральную плотность мощности для LFP; iv,v. Вычисление когерентности между LFP; VI,VII. Вычислите корреляцию между двумя LFP. viii,ix. Экспортируйте результаты. (B) Процесс фильтрации каждого диапазона частот из сигнала LFP. i. Извлечение различных частотных диапазонов из данных LFP; II,III. Просмотр отфильтрованных LFP; iv. Сохраните отфильтрованные LFP в виде расширенного метафайла. (C) Процесс анализа когерентности между нейрональными спайками и LFP. I,II. Вычислить когерентность между LFP и отсортированными шипами; III,IV. Экспортируйте результаты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Репрезентативные трассы записанных сигналов. Пик был отфильтрован на частоте 250 Гц из необработанных данных, отобранных на частоте 30 кГц. LFP представлял собой необработанные данные, дискретизированные на частоте 10 кГц. δ представлял собой полосовую фильтрацию в дельта-диапазоне частот с частотой 1-4 Гц от LFP. θ — тета-полоса частот, отфильтрованная на частоте 5-12 Гц от LFP. β была бета-полоса частот, отфильтрованная на частоте 13-30 Гц от LFP. Низкий γ представлял собой полосу низких гамма-частот, отфильтрованную на частоте 30-70 Гц от LFP. Высокое γ представляло собой полосу высоких гамма-частот, отфильтрованную на частоте 70-100 Гц от LFP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Характеристики отсортированных агрегатов и схема их стрельбы. (А,Б) Отсортированные блоки были кластеризованы с помощью метода главных компонент (PCA) с одного и того же электрода. (С,Д) Автокорреляции (вверху) и гистограммы межспайковых интервалов (внизу) для предполагаемого возбуждающего нейрона (Pyn) и предполагаемого тормозного нейрона (IN). (E) Ширина долины предполагаемого Pyn была значительно выше, чем у предполагаемого IN (предполагаемый Pyn: n = 1,055 шипов, предполагаемый IN: n = 1,985 шипов). (F) Длительность сигнала предполагаемого Pyn была сильнее, чем у предполагаемого IN (предполагаемый Pyn: n = 1,005 пиков, предполагаемый IN: n = 1,059 пиков). (G) Взаимная корреляция между предполагаемыми Pyn и IN. Статистический анализ с помощью критерия Манна-Уитни. Все данные представлены в виде среднего ± стандартной ошибки среднего значения, **p < 0,01, ***p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Анализ двух LFP от двустороннего MC и когерентности между спайковыми событиями и LFP у мышей. (A,B) Нормализованные спектры мощности двустороннего МК в каждой полосе частот у мышей (n = 3). (C) Кривая когерентности двух LFP между левым и правым MC (n = 3). (D) Кривая взаимной корреляции двух LFP, показывающая корреляцию между левым и правым MC с временными задержками ±100 мс (n = 3). (E) Кривая когерентности спайкового поля в MC мыши. Статистический анализ с помощью критерия Манна-Уитни. Все данные представлены в виде среднего значения ± стандартной ошибки среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Многоканальная запись на свободно движущихся мышах считается полезной технологией в исследованиях нейробиологии, но новичкам все еще довольно сложно записывать и анализировать сигналы. В настоящем исследовании мы предоставляем упрощенные рекомендации по созданию микроприводных систем и выполнению имплантации электродов, а также упрощенные процедуры захвата и анализа электрических сигналов с помощью программного обеспечения для сортировки спайков и программного обеспечения для анализа нейрофизиологических данных.
Учитывая, что качество индивидуальной системы микропривода в значительной степени способствует получению стабильных и качественных сигналов у свободно движущихся мышей14,15,16,17, мы разработали и использовали более прочную и легкую конструкцию для системы микропривода в этом исследовании, и новички могут легко и четко следить за производственными этапами создания системы микропривода. Кроме того, в структуре спроектированной системы микропривода используются недорогие материалы, которые легко доступны в хозяйственных магазинах, в отличие от более крупных и тяжелых микроприводных систем, использовавшихся в предыдущих исследованиях14,15. Эта система микроприводов может уменьшить дискомфорт и выдержать воздействие свободно движущихся мышей во время записи. Между тем, мы еще больше улучшили размер и форму системы микропривода, что может быть полезно для начинающих, позволяя им наблюдать, вставлять и, таким образом, перемещать кончики электродов в мозг во время операции. Кроме того, простая скользящая структура, применяемая в системе микропривода, точно продвигается в мозге с помощью высокоточного винта, что означает, что эта система обеспечивает точный контроль при измерении нескольких слоев целевой области мозга; Действительно, это чрезвычайно важно для улавливания внеклеточных сигналов у свободно движущегося животного в течение длительного экспериментального периода. Прежде всего, преимуществами этой системы микроприводов являются ее простота и гибкость; Тем не менее, меньшее количество каналов и использование массива одиночных электродов должны быть дополнительно улучшены в новой версии.
В настоящем исследовании также есть несколько улучшений, которые стоит отметить. Благодаря меньшему размеру и измененной форме системы микропривода по сравнению с предыдущими системами, для работы был обеспечен более широкий обзор и более широкое рабочее пространство. Более того, стенки на черепе мыши были сделаны из стоматологического цемента и винтов из нержавеющей стали, что позволило прочно закрепить систему микропривода на голове мыши. Кроме того, зубные цементные стенки позволяли загружать вазелин для покрытия отверстий в черепе мыши перед заливкой стоматологического цемента, который оказывал защитное действие на поверхность мозга без твердой мозговой оболочки и подвижной части системы микропривода. Вместе эти улучшения полезны, так как позволяют новичкам легко и уверенно имплантировать систему микропривода в мозг мыши.
Широко распространено мнение, что в многоканальных внеклеточных записях еще одна трудность заключается в анализе записанных сигналов с помощью математически сложного языка программирования17. Таким образом, мы даем четкие рекомендации для начинающих, особенно с точки зрения сортировки спайков, анализа данных LFP и вычисления взаимосвязи между ними с помощью широко используемого в электрофизиологии программного обеспечения. Кроме того, мы настоятельно рекомендуем, чтобы записанная единица из одноэлектродного анализа, кластеризованная методами PCA, имела большое количество признаков для анализа, таких как отсортированные интервалы между нейронами и ширина между его впадиной и пиком, поскольку эти значения полезны для начинающих для уменьшения смещения при автоматической кластеризации единиц с помощью программного обеспечения автономного сортировщика. Важно отметить, что взаимосвязь между сигналами, включающими пики, и LFP имеет решающее значение для опосредования множественного поведения. Мы также предоставляем серию простых иллюстраций для измерения корреляций спайк-спайк, LFP-LFP и спайк-LFP с использованием надежных скриптов в программном обеспечении для анализа нейрофизиологических данных; Эти иллюстрации позволят новичкам быстро приступить к обработке и анализу записанных сигналов на свободно движущихся мышах. Кроме того, результаты и данные, обработанные с помощью этого проприетарного программного обеспечения, могут быть использованы в сочетании с набором инструментов с открытым исходным кодом, таким как Fieldtrip, для предварительного дополнительного анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (31871170, 32170950 и 31970915), Фонда естественных наук провинции Гуандун (2021A1515010804 и 2023A1515010899), Гуандунского фонда естественных наук для крупного проекта по выращиванию (2018B030336001) и Гранта Гуандуна: ключевые технологии для лечения заболеваний головного мозга (2018B030332001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.54 mm pin header | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 1 x 5 | Applying for the movable micro-drive which can slide on its stulls. |
| Adobe Illustrator CC 2017 | Adobe | N/A | To optimize images from GraphPad. |
| BlackRock Microsystems | Blackrock Neurotech | Cerebus | This systems includes headsatge, DA convert, amplifier and computer. |
| Brass nut | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 brass nut | The nut fixes the position of screw. |
| Brass screw | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 x 11 mm brass screw | A screw that hold the movable micro-drive. |
| C57BL/6J | Guangdong Zhiyuan Biomedical Technology Co., LTD. | N/A | 12 weeks of age. |
| Centrifuge tube | Biosharp | 15 mL; BS-150-M | To store mice brain with sucrose sulutions. |
| Conducting paint | Structure Probe, Inc. | 7440-22-4 | To improve the lead-connecting quality between connector pins and Ni-wires. |
| Conductive copper foil tape | 3M | 1181 | To reduce interferenc. |
| Connector | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 2 x 10P | To connect the headtage to micro-drive system. |
| DC Power supply | Maisheng | MS-305D | A power device for electrolytic lesion. |
| Dental cement | Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. | N/A | To fix the electrode arrays on mouse's skull after finishing the implantation. |
| Digital analog converter | Blackrock | 128-Channel | A device that converts digital data into analog signals. |
| Epoxy resin | Alteco | N/A | To cover pins. |
| Excel | Microsoft | N/A | To summarize data after analysis. |
| Eye scissors | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or cutting the Ni-chrome wire. |
| Fine forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery. |
| Forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or assembling the mirco-drive system. |
| Freezing microtome | Leica | CM3050 S | Cut the mouse’s brain into slices |
| Fused silica capillary tubing | Zhengzhou INNOSEP Scientific Co., Ltd. | TSP050125 | To serve as the guide tubes for Ni-chrome wires. |
| Glass microelectrode | Sutter Instrument Company | BF100-50-10 | To mark the desired locations for implantation using the filled ink. |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad Software | N/A | To analyze and visualize the results. |
| Guide-tube | Polymicro technologies | 1068150020 | To load Ni-chrome wires. |
| Headstage | Blackrock | N/A | A tool of transmitting signals. |
| Helium balloon | Yili Festive products Co., Ltd. | 24 inch | To offset the weight of headstage and micro-drive system. |
| Ink | Sailor Pen Co.,LTD. | 13-2001 | To mark the desired locations for implantation. |
| Iodine tincture | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To disinfect mouse's scalp. |
| Lincomycin in Hydrochloride and Lidocaine hydrochloride gel | Hubei kangzheng pharmaceutical co., ltd. | 10g | A drug used to reduce inflammation. |
| Meloxicam | Vicki Biotechnology Co., Ltd. | 71125-38-7 | To reduce postoperative pain in mice. |
| Micromanipulators | Scientifica | Scientifica IVM Triple | For electrode arrays implantation. |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni-E | Capture the images of brain sections |
| nanoZ impedance tester | Plexon | nanoZ | To measure impedance or performing electrode impedance spectroscopy (EIS) for multichannel microelectrode arrays. |
| NeuroExplorer | Plexon | NeuroExplorer | A tool for analyzing the electrophysiological data. |
| NeuroExplorer | Plexon, USA | N/A | A software. |
| Ni-chrome wire | California Fine Wire Co. | M472490 | 35 μm Ni-chrome wire. |
| Offline Sorter | Plexon | Offline Sorter | A tool for sorting the recorded multi-units. |
| PCB board | Hangzhou Jiepei Information Technology Co., Ltd. | N/A | Computer designed board. |
| Pentobarbital | Sigma | P3761 | To anesthetize mice. |
| Pentobarbital sodium | Sigma | 57-33-0 | To anesthetize the mouse. |
| Peristaltic pump | Longer | BT100-1F | A device used for perfusion |
| Polyformaldehyde | Sangon Biotech | A500684-0500 | The main component of fixative solution for fixation of mouse brains |
| PtCl4 | Tianjin Jinbolan Fine Chemical Co., Ltd. | 13454-96-1 | Preparation for gold plating liquid. |
| Saline | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To clean the mouse's skull. |
| Silver wire | Suzhou Xinye Electronics Co., Ltd. | 2 mm diameter | Applying for ground and reference electrodes. |
| Skull drill | RWD Life Science | 78001 | To drill carefully two small holes on mouse's skull. |
| Stainless steel screws | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | M0.8 x 2 | To protect the micro-drive system and link the ground and reference electrodes. |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 68513 | To perform the stereotaxic coordinates of bilateral motor cortex. |
| Sucrose | Damao | 57-50-1 | To dehydrate the mouse brains after perfusion. |
| Super glue | Henkel AG & Co. | PSK5C | To fix the guide tube and Ni-chrome wire. |
| Temperature controller | Harvard Apparatus | TCAT-2 | To maintain mouse's rectal temperature at 37°C |
| Tetracycline eye ointment | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To protect the mouse's eyes during surgery. |
| Thread | Rapala | N/A | To link ballon and headstage. |
| Vaseline | Unilever plc | N/A | To cover the gap between electrode arrays and mouse's skull. |
References
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).
- Singer, W. Synchronization of cortical activity and its putative role in information processing and learning. Annual Review of Physiology. 55, 349-374 (1993).
- Arroyo-García, L. E., et al. Impaired spike-gamma coupling of area CA3 fast-spiking interneurons as the earliest functional impairment in the App(NL-G-F) mouse model of Alzheimer's disease. Molecular Psychiatry. 26 (10), 5557-5567 (2021).
- Ozawa, M., et al. Experience-dependent resonance in amygdalo-cortical circuits supports fear memory retrieval following extinction. Nature Communications. 11 (1), 4358 (2020).
- Vinck, M., Batista-Brito, R., Knoblich, U., Cardin, J. A. Arousal and locomotion make distinct contributions to cortical activity patterns and visual encoding. Neuron. 86 (3), 740-754 (2015).
- Beck, M. H., et al. long-term dopamine depletion causes enhanced beta oscillations in the cortico-basal ganglia loop of parkinsonian rats. Experimental Neurology. 286, 124-136 (2016).
- Magill, P. J., Bolam, J. P., Bevan, M. D. Relationship of activity in the subthalamic nucleus-globus pallidus network to cortical electroencephalogram. Journal of Neuroscience. 20 (2), 820-833 (2000).
- Magill, P. J., et al. Changes in functional connectivity within the rat striatopallidal axis during global brain activation in vivo. Journal of Neuroscience. 26 (23), 6318-6329 (2006).
- Rapeaux, A. B., Constandinou, T. G. Implantable brain machine interfaces: First-in-human studies, technology challenges and trends. Current Opinion in Biotechnology. 72, 102-111 (2021).
- Tort, A. B., et al. Dynamic cross-frequency couplings of local field potential oscillations in rat striatum and hippocampus during performance of a T-maze task. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20517-20522 (2008).
- Yamamoto, J., Wilson, M. A. Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals. Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2430-2440 (2008).
- Chang, E. H., Frattini, S. A., Robbiati, S., Huerta, P. T. Construction of microdrive arrays for chronic neural recordings in awake behaving mice. Journal of Visualized Experiments. (77), e50470 (2013).
- Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. Journal of Visualized Experiments. (61), e3568 (2012).
- Lansink, C. S., et al. A split microdrive for simultaneous multi-electrode recordings from two brain areas in awake small animals. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 129-138 (2007).
- Sato, T., Suzuki, T., Mabuchi, K. A new multi-electrode array design for chronic neural recording, with independent and automatic hydraulic positioning. Journal of Neuroscience Methods. 160 (1), 45-51 (2007).
- van Daal, R. J. J., et al. Implantation of Neuropixels probes for chronic recording of neuronal activity in freely behaving mice and rats. Nature Protocols. 16 (7), 3322-3347 (2021).
- Unakafova, V. A., Gail, A. Comparing open-source toolboxes for processing and analysis of spike and local field potentials data. Frontiers in Neuroinformatics. 13, 57 (2019).
- Mao, L., Wang, H., Qiao, L., Wang, X. Disruption of Nrf2 enhances the upregulation of nuclear factor-kappaB activity, tumor necrosis factor-alpha, and matrix metalloproteinase-9 after spinal cord injury in mice. Mediators of Inflammation. 2010, 238321 (2010).
- Jin, Z., Zhang, Z., Ke, J., Wang, Y., Wu, H. Exercise-linked irisin prevents mortality and enhances cognition in a mice model of cerebral ischemia by regulating Klotho expression. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1697070 (2021).
- Ding, X., et al. Spreading of TDP-43 pathology via pyramidal tract induces ALS-like phenotypes in TDP-43 transgenic mice. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 15 (2021).
- Cao, W., et al. Gamma oscillation dysfunction in mPFC leads to social deficits in neuroligin 3 R451C knockin mice. Neuron. 97 (6), 1253-1260 (2018).
