Многоканальная внеклеточная запись у свободно движущихся мышей

Summary

Протокол описывает методологию внеклеточной регистрации в моторной коре (МК) для выявления внеклеточных электрофизиологических свойств у свободно движущихся мышей, находящихся в сознании, а также анализ данных потенциалов локального поля (LFP) и спайков, что полезно для оценки нейронной активности сети, лежащей в основе интересующего поведения.

Abstract

Протокол направлен на раскрытие свойств возбуждения нейронов и сетевых локальных полевых потенциалов (LFP) у мышей, выполняющих специфические задачи, путем корреляции электрофизиологических сигналов со спонтанным и/или специфическим поведением. Этот метод представляет собой ценный инструмент в изучении активности нейронной сети, лежащей в основе этого поведения. В статье подробно описана и полная процедура имплантации электродов и последующей внеклеточной регистрации у мышей со свободноподвижным сознанием. Исследование включает в себя детальный метод имплантации микроэлектродных решеток, захвата сигналов LFP и нейрональных спайков в моторной коре (МК) с использованием многоканальной системы и последующего автономного анализа данных. Преимущество многоканальной регистрации у животных, находящихся в сознании, заключается в том, что можно получить и сравнить большее количество спайковых нейронов и подтипов нейронов, что позволяет оценить взаимосвязь между конкретным поведением и связанными с ним электрофизиологическими сигналами. Примечательно, что методика многоканальной внеклеточной регистрации и процедура анализа данных, описанная в настоящем исследовании, могут быть применены и к другим областям мозга при проведении экспериментов на мышах.

Introduction

Потенциал локального поля (LFP), важный компонент внеклеточных сигналов, отражает синаптическую активность больших популяций нейронов, которые формируют нейронный код для^{множественного поведения}. Считается, что спайки, генерируемые нейронной активностью, вносят свой вклад в LFP и важны для нейронного кодирования². Было доказано, что изменения в спайках и LFP опосредуют некоторые заболевания мозга, такие как болезнь Альцгеймера, а также эмоции, такие как страх и ^{т. д}. Стоит отметить, что во многих исследованиях было подчеркнуто, что активность спайков значительно различается между бодрствующим и наркозным состояниями у животных⁵. Несмотря на то, что записи у животных, находящихся под наркозом, дают возможность оценить LFP с минимальными артефактами в строго определенных состояниях синхронизации коры головного мозга, результаты в некоторой степени отличаются от тех, которые можно найти у бодрствующих субъектов ^6,7,8. Таким образом, более значимо обнаруживать нейронную активность в длительных временных масштабах и больших пространственных масштабах при различных заболеваниях в бодрствующем состоянии мозга с помощью электродов, имплантированных в мозг. Эта рукопись содержит информацию для начинающих о том, как создать систему микропривода и установить параметры с помощью общего программного обеспечения для быстрого и простого вычисления сигналов спайков и LFP, чтобы начать запись и анализ.

Несмотря на то, что неинвазивная регистрация функций мозга, например, с помощью электроэнцефалограммы (ЭЭГ) и потенциалов, связанных с событиями (ERP), регистрируемых с кожи головы, широко используется в исследованиях на людях и грызунах, данные ЭЭГ и ERP имеют низкие пространственные и временные свойства и, таким образом, не могут обнаружить точные сигналы, производимые близлежащей дендритной синаптической активностью в^{определенной области мозга}. В настоящее время, используя преимущества многоканальной записи у животных, находящихся в сознании, нейронная активность в более глубоких слоях мозга может регистрироваться хронически и прогрессивно путем имплантации системы микродрайвов в мозг приматов или грызунов во время многочисленных поведенческих тестов 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Короче говоря, исследователи могут сконструировать систему микроприводов, которая может быть использована для независимого позиционирования электродов или тетродов для воздействия на различные^{части мозга.} Например, Chang et al. описали методы регистрации спайков и LFP у мышей путем сборки легкого и компактного микропривода¹². Кроме того, коммерчески доступны микромеханические кремниевые зонды с изготовленными по индивидуальному заказу вспомогательными компонентами для регистрации нескольких одиночных нейронов и LFP у грызунов во время выполнения поведенческих задач¹³. Несмотря на то, что для сборки систем микроприводов использовались различные конструкции, они по-прежнему имеют ограниченный успех с точки зрения сложности и веса всей системы микроприводов. Например, Lansink et al. показали многоканальную микроприводную систему со сложной структурой для записи из одной области мозга¹⁴. Sato et al. сообщили о многоканальной системе микропривода, демонстрирующей функцию автоматического гидравлического позиционирования¹⁵. Основные недостатки этих микроприводных систем заключаются в том, что они слишком тяжелые, чтобы мыши могли свободно двигаться, и их сложно собрать новичкам. Несмотря на то, что многоканальная внеклеточная запись показала себя подходящей и эффективной технологией для измерения нейронной активности во время поведенческих тестов, новичкам нелегко записывать и анализировать сигналы, полученные сложной системой микропривода. Учитывая, что у свободно движущихся мышей сложно запустить весь процесс работы многоканальной внеклеточной регистрации и анализа данных^16,17, в настоящей статье представлены упрощенные рекомендации по ознакомлению с подробным процессом создания микроприводной системы с использованием общедоступных компонентов и настроек; Кроме того, в общем программном обеспечении предусмотрены параметры для быстрого и простого вычисления сигналов спайка и LFP. Кроме того, в этом протоколе мышь может свободно перемещаться за счет использования гелиевого баллона, что способствует компенсации веса головной сцены и системы микропривода. В целом, в настоящем исследовании мы описываем, как легко построить систему микроприводов и оптимизировать процессы записи и анализа данных.

Protocol

Все мыши были получены коммерческим путем и содержались в цикле 12 ч свет/12 ч темнота (свет включается в 08:00 утра по местному времени) при комнатной температуре 22-25 °C и относительной влажности 50%-60%. Мыши имели доступ к постоянному снабжению пищей и водой. Все эксперименты проводились в соо…

Representative Results

Фильтр высоких частот (250 Гц) был применен для извлечения многозначных пиков из необработанных сигналов (рис. 6A). Кроме того, были верифицированы записанные единицы измерения из МС обычной мыши, отсортированные по PCA (рис. 7A-D), а также были…

Discussion

Многоканальная запись на свободно движущихся мышах считается полезной технологией в исследованиях нейробиологии, но новичкам все еще довольно сложно записывать и анализировать сигналы. В настоящем исследовании мы предоставляем упрощенные рекомендации по созданию микроприводных си…

Materials

2.54 mm pin header	YOUXIN Electronic Co., Ltd.	1 x 5	Applying for the movable micro-drive which can slide on its stulls.
Adobe Illustrator CC 2017	Adobe	N/A	To optimize images from GraphPad.
BlackRock Microsystems	Blackrock Neurotech	Cerebus	This systems includes headsatge, DA convert, amplifier and computer.
Brass nut	Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd.	M0.8 brass nut	The nut fixes the position of screw.
Brass screw	Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd.	M0.8 x 11 mm brass screw	A screw that hold the movable micro-drive.
C57BL/6J	Guangdong Zhiyuan Biomedical Technology Co., LTD.	N/A	12 weeks of age.
Centrifuge tube	Biosharp	15 mL; BS-150-M	To store mice brain with sucrose sulutions.
Conducting paint	Structure Probe, Inc.	7440-22-4	To improve the lead-connecting quality between connector pins and Ni-wires.
Conductive copper foil tape	3M	1181	To reduce interferenc.
Connector	YOUXIN Electronic Co., Ltd.	2 x 10P	To connect the headtage to micro-drive system.
DC Power supply	Maisheng	MS-305D	A power device for  electrolytic lesion.
Dental cement	Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd.	N/A	To fix the electrode arrays on mouse's skull after finishing the implantation.
Digital analog converter	Blackrock	128-Channel	A device that converts digital data into analog signals.
Epoxy resin	Alteco	N/A	To cover pins.
Excel	Microsoft	N/A	To summarize data after analysis.
Eye scissors	JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd.	N/A	For surgery or cutting the Ni-chrome wire.
Fine forceps	JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd.	N/A	For surgery.
Forceps	JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd.	N/A	For surgery or assembling the mirco-drive system.
Freezing microtome	Leica	CM3050 S	Cut the mouse’s brain into slices
Fused silica capillary tubing	Zhengzhou INNOSEP Scientific Co., Ltd.	TSP050125	To  serve as the guide tubes for Ni-chrome wires.
Glass microelectrode	Sutter Instrument Company	BF100-50-10	To mark the desired locations for implantation using the filled ink.
GraphPad Prism 7	GraphPad Software	N/A	To analyze and visualize the results.
Guide-tube	Polymicro technologies	1068150020	To load Ni-chrome wires.
Headstage	Blackrock	N/A	A tool of transmitting signals.
Helium balloon	Yili Festive products Co., Ltd.	24 inch	To offset the weight of headstage and micro-drive system.
Ink	Sailor Pen Co.,LTD.	13-2001	To mark the desired locations for implantation.
Iodine tincture	Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd.	N/A	To disinfect mouse's scalp.
Lincomycin in Hydrochloride and Lidocaine  hydrochloride gel	Hubei kangzheng pharmaceutical co., ltd.	10g	A drug used to reduce inflammation.
Meloxicam	Vicki Biotechnology Co., Ltd.	71125-38-7	To reduce postoperative pain in mice.
Micromanipulators	Scientifica	Scientifica IVM Triple	For electrode arrays implantation.
Microscope	Nikon	ECLIPSE Ni-E	Capture the images of brain sections
nanoZ impedance tester	Plexon	nanoZ	To measure impedance or performing electrode impedance spectroscopy (EIS) for multichannel microelectrode arrays.
NeuroExplorer	Plexon	NeuroExplorer	A tool for analyzing the electrophysiological data.
NeuroExplorer	Plexon, USA	N/A	A software.
Ni-chrome wire	California Fine Wire Co.	M472490	35 μm Ni-chrome wire.
Offline Sorter	Plexon	Offline Sorter	A tool for sorting the recorded multi-units.
PCB board	Hangzhou Jiepei Information Technology Co., Ltd.	N/A	Computer designed board.
Pentobarbital	Sigma	P3761	To anesthetize mice.
Pentobarbital sodium	Sigma	57-33-0	To anesthetize the mouse.
Peristaltic pump	Longer	BT100-1F	A device used for perfusion
Polyformaldehyde	Sangon Biotech	A500684-0500	The main component of fixative solution for fixation of mouse brains
PtCl4	Tianjin Jinbolan Fine Chemical Co., Ltd.	13454-96-1	Preparation for gold plating liquid.
Saline	Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd.	N/A	To clean the mouse's skull.
Silver wire	Suzhou Xinye Electronics Co., Ltd.	2 mm diameter	Applying for ground and reference electrodes.
Skull drill	RWD Life Science	78001	To drill carefully two small holes on mouse's skull.
Stainless steel screws	YOUXIN Electronic Co., Ltd.	M0.8 x 2	To protect the micro-drive system and link the ground and reference electrodes.
Stereotaxic apparatus	RWD Life Science	68513	To perform the stereotaxic coordinates of bilateral motor cortex.
Sucrose	Damao	57-50-1	To dehydrate the mouse brains  after perfusion.
Super glue	Henkel AG & Co.	PSK5C	To fix the guide tube and Ni-chrome wire.
Temperature controller	Harvard Apparatus	TCAT-2	To maintain mouse's rectal temperature at 37°C
Tetracycline eye ointment	Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd.	N/A	To protect the mouse's eyes during surgery.
Thread	Rapala	N/A	To link ballon and headstage.
Vaseline	Unilever plc	N/A	To cover the gap between electrode arrays and mouse's skull.