Summary
Il protocollo descrive la metodologia di registrazione extracellulare nella corteccia motoria (MC) per rivelare le proprietà elettrofisiologiche extracellulari in topi coscienti che si muovono liberamente, nonché l'analisi dei dati dei potenziali di campo locale (LFP) e dei picchi, utile per valutare l'attività neurale della rete alla base dei comportamenti di interesse.
Abstract
Il protocollo ha lo scopo di scoprire le proprietà del firing neuronale e dei potenziali di campo locale (LFP) di rete in topi che si comportano svolgendo compiti specifici, correlando i segnali elettrofisiologici con il comportamento spontaneo e/o specifico. Questa tecnica rappresenta un valido strumento per studiare l'attività della rete neuronale alla base di questi comportamenti. L'articolo fornisce una procedura dettagliata e completa per l'impianto di elettrodi e la conseguente registrazione extracellulare in topi coscienti che si muovono liberamente. Lo studio include un metodo dettagliato per l'impianto degli array di microelettrodi, l'acquisizione dei segnali LFP e spiking neuronali nella corteccia motoria (MC) utilizzando un sistema multicanale e la successiva analisi dei dati offline. Il vantaggio della registrazione multicanale negli animali coscienti è che è possibile ottenere e confrontare un numero maggiore di neuroni spiking e sottotipi neuronali, il che consente di valutare la relazione tra un comportamento specifico e i segnali elettrofisiologici associati. In particolare, la tecnica di registrazione extracellulare multicanale e la procedura di analisi dei dati descritta nel presente studio possono essere applicate ad altre aree cerebrali quando si conducono esperimenti su topi comportamentali.
Introduction
Il potenziale di campo locale (LFP), una componente importante dei segnali extracellulari, riflette l'attività sinaptica di grandi popolazioni di neuroni, che formano il codice neurale per comportamenti multipli1. Si ritiene che i picchi generati dall'attività neuronale contribuiscano alla LFP e siano importanti per la codifica neurale2. È stato dimostrato che le alterazioni dei picchi e delle LFP mediano diverse malattie cerebrali, come il morbo di Alzheimer, così come le emozioni come la paura, ecc.3,4. Vale la pena notare che molti studi hanno evidenziato che l'attività dei picchi differisce significativamente tra gli stati di veglia e quelli anestetizzati negli animali5. Sebbene le registrazioni in animali anestetizzati offrano l'opportunità di valutare LFP con artefatti minimi in stati di sincronizzazione corticale altamente definiti, i risultati differiscono in una certa misura da quelli che possono essere trovati nei soggetti svegli 6,7,8. Pertanto, è più significativo rilevare l'attività neurale su lunghe scale temporali e grandi scale spaziali in varie malattie in uno stato cerebrale sveglio utilizzando elettrodi impiantati nel cervello. Questo manoscritto fornisce informazioni per i principianti su come realizzare il sistema di micro-drive e impostare i parametri utilizzando un software comune per calcolare i segnali spike e LFP in modo rapido e semplice al fine di avviare la registrazione e l'analisi.
Sebbene la registrazione non invasiva delle funzioni cerebrali, ad esempio utilizzando elettroencefalogrammi (EEG) e potenziali correlati agli eventi (ERP) registrati dal cuoio capelluto, sia stata ampiamente utilizzata negli studi sull'uomo e sui roditori, i dati EEG e ERP hanno basse proprietà spaziali e temporali e, quindi, non possono rilevare i segnali precisi prodotti dall'attività sinaptica dendritica vicina all'interno di una specifica area cerebrale1. Attualmente, sfruttando la registrazione multicanale negli animali coscienti, l'attività neurale negli strati più profondi del cervello può essere registrata cronicamente e progressivamente impiantando un sistema di micro-drive nel cervello di primati o roditori durante test comportamentali multipli 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . In breve, i ricercatori possono costruire un sistema di micro-drive che può essere utilizzato per il posizionamento indipendente degli elettrodi o dei tetrodi per colpire diverse parti del cervello10,11. Ad esempio, Chang et al. hanno descritto le tecniche per registrare picchi e LFP nei topi assemblando un micro-drive leggero e compatto12. Inoltre, sono disponibili in commercio sonde al silicio microlavorate con componenti accessori realizzati su misura per la registrazione di più singoli neuroni e LFP nei roditori durante compiti comportamentali13. Sebbene siano stati utilizzati vari design per l'assemblaggio di sistemi di microazionamento, questi hanno ancora un successo limitato in termini di complessità e peso dell'intero sistema di microazionamento. Ad esempio, Lansink et al. hanno mostrato un sistema di micro-drive multicanale con una struttura complessa per la registrazione da una singola regione del cervello14. Sato et al. hanno riportato un sistema di microazionamento multicanale che visualizza una funzione di posizionamento idraulico automatico15. I principali svantaggi di questi sistemi di microazionamento sono che sono troppo pesanti per consentire ai topi di muoversi liberamente e sono difficili da montare per i principianti. Sebbene la registrazione extracellulare multicanale abbia dimostrato di essere una tecnologia adatta ed efficiente per misurare l'attività neurale durante i test comportamentali, non è facile per i principianti registrare e analizzare i segnali acquisiti dal complesso sistema di micro-drive. Dato che è difficile avviare l'intero processo operativo della registrazione extracellulare multicanale e dell'analisi dei dati in topi che si muovono liberamente16,17, questo articolo presenta linee guida semplificate per introdurre il processo dettagliato di realizzazione del sistema di micro-drive utilizzando componenti e impostazioni comunemente disponibili; vengono inoltre forniti i parametri presenti nei comuni software per il calcolo dei segnali spike e LFP in modo rapido e diretto. Inoltre, in questo protocollo, il mouse può muoversi liberamente grazie all'uso di un palloncino ad elio, che contribuisce a compensare il peso dell'headstage e del sistema di micro-drive. In generale, nel presente studio, descriviamo come costruire facilmente un sistema di micro-azionamento e ottimizzare i processi di registrazione e analisi dei dati.
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Protocol
Tutti i topi sono stati ottenuti commercialmente e mantenuti in un ciclo di 12 ore di luce/12 ore di buio (luce accesa alle 08:00 ora locale) a una temperatura ambiente di 22-25 °C e un'umidità relativa del 50%-60%. I topi avevano accesso a una fornitura continua di cibo e acqua. Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le Linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio della South China Normal University e approvati dal Comitato Etico Istituzionale per gli Animali. Per gli esperimenti sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6J di età compresa tra 3 e 5 mesi.
1. Assemblaggio del sistema di microazionamento
- Collegare due schede progettate al computer utilizzando due stull e una vite che fissa il micro-drive mobile e collegare il connettore a una scheda (Figura 1A, Bi-iii). Azionare il microazionamento ruotando una vite (0,5 mm/cerchio).
- Assicurarsi che il microazionamento sia in grado di trasportare due set di otto tubi guida (~3 cm di lunghezza, ~50 μm di diametro interno, ~125 μm di diametro esterno) per ciascun lato della regione MC, quindi tagliarlo alla stessa lunghezza (almeno 15 mm; Figura 1Biv, v).
- Tagliare 16 fili di Ni-cromo (~5 cm di lunghezza) con un diametro di 35 μm, quindi caricarli successivamente nei tubi guida, quindi applicare la colla per fissarli (Figura 1Bi, vi, vii).
- Spellare l'isolamento del filo, intrecciare successivamente ogni filo esposto a ciascun pin del connettore seguendo la mappa dei canali, nonché gli elettrodi di riferimento e di terra, quindi rivestire lentamente la vernice conduttrice su ciascun pin (Figura 1Bviii-x).
- Coprire i pin con resina epossidica (Figura 1Axi, xii), quindi eseguire la doratura tramite un tester di impedenza per ridurre l'impedenza delle punte degli elettrodi a ~350 kOhm (Figura 1Bxiii, xiv). Impostare i parametri del tester di impedenza come segue: −10,08 μA di corrente continua per 1 s con soluzione di doratura, inclusi 5 mM PtCl4.
- Infine, sposta il micro-drive verso l'alto ruotando una vite. Controllare le dimensioni complessive del sistema di microazionamento modificato come mostrato nella Figura 1A (circa 15 mm di lunghezza, 10 mm di larghezza, 20 mm di altezza, ~1 g di peso). Controllare le specifiche dettagliate della scheda progettata al computer e del componente mobile nella Figura 1Ai, ii.
2. Impianto di array di elettrodi
- Sterilizzare i kit chirurgici, indossare guanti sterili e indossare un camice bianco sterile da medico prima dell'inizio dell'operazione.
- Per gestire il dolore, utilizzare un'iniezione sottocutanea (s.c.) di meloxicam iniettabile (5 mg/kg) per il topo in una camera di induzione. Quindi anestetizzare il topo mediante un'iniezione intraperitoneale (i.p.) di pentobarbital (80 mg/kg) in una camera di induzione18,19. Applicare una dose supplementare di pentobarbital (20 mg/kg/h) se il riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi è ancora presente.
- Fissare il topo in un apparecchio stereotassico e mantenere la temperatura rettale a 37 °C utilizzando un termoregolatore.
- Applicare un unguento per gli occhi alla tetraciclina su entrambi gli occhi del topo e cambiare nuovamente i guanti sterili prima dell'intervento chirurgico.
- Radere il pelo del topo e disinfettare il sito chirurgico con tre cicli alternati di scrub a base di betadine e alcol utilizzando un applicatore sterile con punta di cotone in cerchi concentrici partendo dal centro e spostandosi verso l'esterno (Figura 2i, ii). Praticare una piccola incisione sulla linea mediana (~15 mm) per esporre il cranio. Applicare immediatamente l'1% di lidocaina localmente sui muscoli del collo per alleviare il dolore. Quindi, rimuovere il tessuto residuo con le forbici e pulire il cranio con cotton fioc rivestiti di soluzione fisiologica (Figura 2iii).
- Utilizzando un microelettrodo di vetro riempito di inchiostro, segnare le posizioni desiderate del MC bilaterale per l'impianto (Figura 2iv, v). Sulla base di un precedente studio 20, le posizioni del MC bilaterale sono le seguenti: 0,74 mm anteriormente al bregma e1,25 mm lateralmente alla linea mediana.
- Impiantare quattro viti in acciaio inossidabile (0,8 mm di diametro) per proteggere il sistema di microazionamento, quindi collegare tutte le viti insieme agli elettrodi di riferimento e di terra, quindi coprire con cemento dentale misto per formare le pareti (Figura 2vi-xi).
- Praticare con cautela due piccoli fori (~1,5 mm2) con un trapano cranico su entrambi i lati sinistro e destro del cranio coordinato nelle regioni MC (Figura 2xii). Utilizzare le coordinate stereotassiche del MC bilaterale: 0,74 mm anteriormente al bregma, 1,25 mm lateralmente alla linea mediana e 0,5 mm ventrale alla dura.
- Rimuovere con cautela la dura madre dai fori con una pinza fine (Figura 2xiii).
- Inserire il sistema di microazionamento al centro dei fori utilizzando un micromanipolatore a 10 μm/s (Figura 2xiv-xvii).
- Riempire la vaselina nelle pareti di cemento dentale dopo aver terminato l'inserimento del sistema di microazionamento (Figura 2xviii).
- Unire la piastra inferiore del sistema di microazionamento e le pareti del cemento dentale con il cemento dentale misto (Figura 2xix)
- Lavare l'incisione con soluzione fisiologica seguita da un trattamento locale con un gel contenente lincomicina cloridrato e lidocaina cloridrato per alleviare il dolore post-operatorio.
- Avvolgere il nastro conduttivo in lamina di rame attorno al sistema di microazionamento impiantato (Figura 2xx).
- Spostare il topo in una gabbia mantenuta a 31-33 °C e monitorare il topo per il recupero dall'anestesia.
- Lasciare che i topi si riprendano per 1 settimana con un'alimentazione separata. Controllare e trattare l'incisione con 3 giorni di applicazione continua di un gel contenente lincomicina cloridrato e lidocaina cloridrato.
3. Registrazione multicanale nel MC bilaterale in topi che si muovono liberamente
- Tieni la testa di un topo sveglio con leggerezza e attenzione. Spostare verso il basso gli array di elettrodi (~0,1 mm di profondità) ruotando la vite sulla parte mobile del sistema di microazionamento (Figura 1Aii) con almeno 1 giorno di anticipo.
- Tieni la testa del topo sveglio con leggerezza e attenzione. Collegare il centro dell'headstage e un palloncino di elio (riempito con circa 0,02 L di elio) con una filettatura per compensare il peso dell'headstage e del sistema di microazionamento (Figura 3A, B).
- Acquisisci i segnali grezzi utilizzando gli elettrodi di registrazione e i sistemi multicanale campionando a 30 kHz nel software di registrazione, quindi digitalizza utilizzando un convertitore digitale-analogico (DA) dai sistemi multicanale.
- Estrarre i segnali LFP dai dati grezzi ricampionando a 10 kHz nel software di registrazione, quindi utilizzare un filtro notch dal software di registrazione per rimuovere il rumore di linea a 50 Hz.
- Registra i dati grezzi in uno stato stabile da un mouse libero per almeno 60 secondi. Dopo aver terminato la registrazione, rimuovere lentamente il collegamento tra l'headstage e il sistema di microazionamento e riportare il mouse nella sua gabbia principale.
- Memorizzare i dati registrati nel computer e analizzarli offline (Figura 4 e Figura 5).
- Dopo aver terminato l'esperimento, eseguire l'eutanasia secondo le linee guida dell'istituto e quindi confermare le posizioni degli elettrodi utilizzando l'alimentatore a 3 V per eseguire una lesione elettrolitica di 1 minuto, seguita dall'esecuzione dell'analisi istologica. Tagliare il cervello del topo in fette da 30 μm utilizzando un microtomo congelante, raccogliere le sezioni MC e quindi acquisire le immagini con un microscopio (Figura 3C, D).
4. Selezione e analisi delle punte
- Fare clic su File > Apri file > Nev nel software di ordinamento dei picchi per aprire i dati dei picchi campionati a 30 kHz (Figura 4Ai).
- Fare clic su Info per selezionare il canale non ordinato, quindi selezionare Ordina > Cambia metodo di ordinamento > Usa K-Means. Premere il pulsante Valley-Seeking Sort > K-Means Sorting per ottenere le unità ordinate (Figura 4Aii, iii).
- Fare clic su File > Salva con nome, salvare i dati dei picchi ordinati con estensione .nev e selezionare File > Esporta dati per forma d'onda per esportare i risultati PCA con un'estensione .txt nome file (Figura 4Aiv).
- Fare clic su File > Importa dati > Blackrock File nel software per l'analisi dei dati neurofisiologici per aprire il file di picco ordinato (Figura 4Bi).
- Fare clic su Analisi > Autocorrelazioni per ottenere l'autocorrelogramma per l'unità selezionata, quindi impostare i parametri come segue: il valore minimo X a −0,05 s, il valore massimo X a 0,05 s e il valore Bin a 0,001 (Figura 4Bii, iii).
- Caricare i dati dei picchi ordinati, fare clic su Analisi > istogrammi dell'intervallo interspike per ottenere l'istogramma dell'intervallo inter-spike , quindi impostare i parametri come segue: il valore dell'intervallo minimo a 0 s, il valore dell'intervallo massimo a 0,1 s e il valore Bin a 0,001 (Figura 4Biv, v).
- Fare clic su Analisi > Correlogrammi incrociati per ottenere il corcorrelogramma incrociato tra due eventi unitari ordinati, quindi impostare gli eventi e i parametri di riferimento come segue: il valore minimo X a −0,1 s, il valore massimo X a 0,1 s e il valore Bin a 0,001 (Figura 4Bvi, vii).
- Fare clic su Risultati > Risultati numerici per salvare i risultati dell'autocorrelogram, dell'istogramma dell'intervallo inter-spike e del corlegologramma incrociato con .xls estensioni di file (Figura 4Bviii, ix). Analizza i dati e disegna il grafico.
5. Analisi LFP
- Fare clic su File Import Data > Blackrock File nel software per l'analisi dei dati neurofisiologici per aprire i dati del segnale continuo campionati a 10 kHz (Figura 5Ai).
- Fare clic su Analisi > spettro per continuo per analizzare lo spettro di potenza per l'LFP dal canale selezionato. Impostare i parametri come segue: il numero di valori di frequenza a 8.192, il valore di conicità multipla a 3-5, la normalizzazione della percentuale della densità spettrale di potenza totale (PSD) e l'intervallo di frequenza da 1 Hz a 100 Hz (Figura 5Aii, iii).
- Fare clic su Analisi > Coerenza per Continuo per analizzare la coerenza di due LFP dai lati sinistro e destro dell'MC. Impostare il canale di riferimento e i parametri come segue: Calcolare a Valori di coerenza, il numero di valori di frequenza a 8.192, il valore di Conicità multipla a 3-5 e l'intervallo di frequenza da 1 Hz a 100 Hz (Figura 5Aiv, v).
- Fare clic su Analisi > Corr. con Variabili continue per analizzare la correlazione tra due LFP dai lati sinistro e destro dell'MC. Impostare il canale di riferimento (dati LFP) e i parametri come segue: il valore minimo X a −0,1 s, il valore massimo X a 0,1 s e il valore Bin a 0,001 (Figura 5Avi, vii).
- Fare clic su Risultati > Risultati numerici per salvare i risultati del PSD, la coerenza e la correlazione con un'estensione .xls del nome file (Figura 5Aviii, ix).
- Selezionare il canale per il quale è necessario estrarre le tracce rappresentative per ciascuna banda di frequenza, fare clic su Modifica > Filtraggio digitale delle variabili continue per ottenere ciascuna banda di frequenza, quindi impostare i parametri come segue: la risposta di frequenza del filtro come passa-banda, l'implementazione del filtro alla risposta all'impulso infinita (IIR) di Butterworth e il valore dell'ordine del filtro a 2. Infine, impostare l'intervallo di frequenza di interesse (Figura 5Bi-iv).
NOTA: Le gamme di frequenza utilizzate qui erano le seguenti: delta (δ, 1-4 Hz), theta (θ, 5-12 Hz), beta (β, 13-30 Hz), gamma bassa (γ bassa, 30-70 Hz) e gamma alta (γ alta, 70-100 Hz). - Analizza i dati e disegna il grafico.
6. Correlazioni tra il picco e LFP
- Fare clic su File > Importa dati > file Blackrock nel software per l'analisi dei dati neurofisiologiciper aprire i dati del segnale continuo e i dati dei picchi.
- Fare clic su Analisi > Analisi di coerenza per analizzare la coerenza tra i picchi e LFP dal canale selezionato. Impostare la variabile di riferimento (temporizzazione del picco) e i parametri come segue: Calcolare i valori di coerenza, il numero di valori di frequenza a 512, il valore di conicità multipla a 3-5 e l'intervallo di frequenza da 1 Hz a 100 Hz (Figura 5Ci, ii).
- Fare clic su Risultati > Risultati numerici per salvare il risultato della coerenza del campo spike con un'estensione .xls del nome file (Figura 5Ciii, iv).
- Analizza i dati e disegna il grafico.
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Representative Results
È stato applicato un filtro passa-alto (250 Hz) per estrarre i picchi multi-unità dai segnali grezzi (Figura 6A). Inoltre, sono state verificate le unità registrate dal MC di un topo normale ordinate per PCA (Figura 7A-D) e sono state registrate la larghezza della valle e la durata della forma d'onda delle unità nel MC del topo. I risultati hanno mostrato che sia l'ampiezza della valle che la durata della forma d'onda dei neuroni piramidali putativi MC (Pyn) nei topi sono superiori a quelle degli interneuroni putativi (IN) (Figura 7E,F; test di Mann-Whitney a due campioni; per la larghezza della valle, Pyn putativo: 0,636 ms ± 0,004 ms, IN putativo: 0,614 ms ± 0,001 ms, p = 0,002; per la durata della forma d'onda, Pyn putativo: 0,095 ms ± 0,004 ms, IN putativo: 0,054 ms ± 0,002 ms, p = 1,402 x 10−16), corrispondente alle caratteristiche di Pyn e IN in studi precedenti21. Abbiamo anche calcolato il cross-correlogramma tra Pyn putativo e IN impostando i picchi putativi di Pyn come riferimento e abbiamo trovato un picco positivo a ~18 ms (Figura 7G), indicando che lo spiking putativo di Pyn si verifica prima del presunto picco IN con una finestra di ~18 ms.
Le tracce rappresentative di ciascuna banda di frequenza sono state filtrate dall'LFP dal filtro IIR nel software per l'analisi dei dati neurofisiologici (Figura 6A). Nell'analisi LFP, le LFP del MC sinistro e destro nei topi normali erano simili nello spettro di potenza, suggerendo attività sincronizzate tra il MC sinistro e destro (Figura 8A,B; test di Mann-Whitney a due campioni; per δ, MC sinistro: 50,71 ± 1,136, MC destro: 50,47 ± 1,213, p = 0,70; per θ, MC sinistro: 2,197 ± 0,187, MC destro: 2,068 ± 0,193, p = 0,40; per β, MC sinistro: 0,222 ± 0,058, MC destro: 0,206 ± 0,055, p = 0,70; per γ basso, MC sinistro: 0,114 ± 0,034, MC destro: 0,093 ± 0,018, p = 0,70; per γ alti, MC sinistro: 0,054 ± 0,027, MC destro: 0,04 ± 0,015, p = 0,40). Abbiamo quindi calcolato la coerenza e la correlazione tra il MC sinistro e destro (Figura 8C,D; il LFP MC sinistro segue entro una finestra di ~1,2 ms dopo il LFP MC destro, −1,167 ms ± 0,667 ms) e abbiamo calcolato l'entità del presunto picco Pyn o IN sincronizzato con l'LFP (1-100 Hz) nel MC sinistro di un topo normale (Figura 8E). Ciò ha mostrato una maggiore coerenza a basso γ per il presunto IN rispetto al Pyn.
Figura 1: Schema degli elettrodi e del sistema di registrazione multicanale. (A) Illustrazione del sistema di microazionamento. io. Disegno e specifiche della scheda progettata al computer. ii. Schema schematico del microazionamento mobile. (B) Sistema di microazionamento e gradini mobili multicanale a elettrodo singolo. io. I fili Ni-cromo; ii. Le parti costitutive dell'elettrodo; iii. Assemblaggio delle schede progettate al computer; iv. Assemblaggio preliminare degli elettrodi, compresi i connettori e gli otto tubi guida; v. L'altro lato del micro-drive; VI,VII. I fili di Ni-cromo vengono successivamente caricati nei tubi guida; VIII-X. Ogni filo esposto viene successivamente attorcigliato a ciascun perno, seguito da un rivestimento di vernice conduttrice su ciascun perno; XI,XII. I perni sono rivestiti con resina epossidica; XIII,XIV. Placcatura in oro. (C) Disegno sperimentale della registrazione extracellulare nel MC di un topo in movimento libero. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Procedura chirurgica passo dopo passo. i,ii. Radere il pelo del topo e disinfettare il sito chirurgico con tre cicli alternati di scrub betadine e alcol. iii. Pulisci il cranio del topo. iv. Livellamento. v. Segna la posizione del cervello. vi. Contrassegnare le posizioni delle viti in acciaio inossidabile. vii. Inserire viti in acciaio inossidabile. viii. Collegare le viti con gli elettrodi di riferimento e di terra. IX,X. Miscelare il cemento dentale. xi. Costruisci un muro con cemento dentale. XII,XIII. Praticare due piccoli fori sopra il MC bilaterale, quindi rimuovere la dura madre. xiv. Preparare il sistema di microazionamento. XV-XIX. Impiantare il sistema micro-drive seguito da un trattamento locale con un gel contenente lincomicina cloridrato e lidocaina cloridrato per alleviare il dolore post-chirurgico. xx. Proteggere il sistema di microazionamento con nastro di lamina di rame conduttivo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Illustrazione di una registrazione fissata sulla testa in un topo cosciente. (A) Diagramma schematico per la registrazione in movimento libero. (B) Dettagli delle immagini della registrazione in movimento libero. io. Planform del sistema di micro-azionamento impiantato; ii. Headstage; III,IV. Il sistema di microazionamento e l'headstage sono collegati; v. Il palloncino ad elio viene applicato per compensare il peso del palco di testa e del sistema di micro-azionamento. (C) Illustrazione della verifica dell'ubicazione del sito di registrazione utilizzando una lesione elettrolitica. (D) I siti di registrazione marcati dalle lesioni elettrolitiche nel MC di un topo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Illustrazione dell'ordinamento e dell'analisi dei picchi. (A) I parametri per il clustering dei dati dei picchi e l'esportazione dei risultati. io. Importare i dati dei picchi; ii. Scegli il metodo di ordinamento; iii. Ordinare i dati dei picchi utilizzando l'algoritmo κ-means; iv. Esportare i risultati dall'unità ordinata. (B) Il processo per l'analisi dell'istogramma dell'intervallo inter-spike, dell'autocorrelogramma e del cross-correlogramma dell'unità ordinata. io. Importare i dati dei picchi ordinati; ii. Condurre l'analisi di autocorrelazione; iii. Impostare i parametri per l'autocorrelogram; iv. Ottenere l'istogramma dell'intervallo inter-spike; v. Impostare i parametri per l'istogramma dell'intervallo tra picchi; vi. Calcolare la correlazione incrociata tra i picchi delle unità ordinate; vii. Impostare i parametri per il cross-correlogram; VIII,IX. Esporta i risultati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Illustrazione dell'analisi continua dei dati. (A) Il processo e i parametri per l'analisi dei segnali LFP che sono stati calcolati utilizzando lo spettro di potenza degli LFP, la coerenza e la correlazione tra due LFP. i. Importare i dati LFP; ii. Calcolare la densità spettrale di potenza per gli LFP dal MC bilaterale; Aiii. Calcolare la densità spettrale di potenza per l'LFP; iv,v. Calcolare la coerenza tra LFP; VI,VII. Calcolare la correlazione tra due LFP. viii,ix. Esporta i risultati. (B) Il processo per filtrare ogni gamma di frequenza dal segnale LFP. i. Estrarre le diverse bande di frequenza dai dati LFP; II,III. Visualizzare gli LFP filtrati; iv. Salvare gli LFP filtrati come metafile avanzato. (C) Il processo per l'analisi della coerenza tra i picchi neuronali e LFP. i,ii. Calcolare la coerenza tra l'LFP e i picchi ordinati; III,IV. Esporta i risultati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Tracce rappresentative dei segnali registrati. Il picco è stato filtrato passa-alto a 250 Hz dai dati grezzi campionati a 30 kHz. L'LFP era il dato grezzo campionato a 10 kHz. δ era la banda di frequenza delta filtrata passa-banda a 1-4 Hz dall'LFP. θ era la banda di frequenza theta filtrata a 5-12 Hz dall'LFP. β era la banda di frequenza beta filtrata a 13-30 Hz dall'LFP. La bassa γ era la banda di bassa frequenza gamma filtrata a 30-70 Hz dall'LFP. L'alta γ era la banda di alta frequenza gamma filtrata a 70-100 Hz dall'LFP. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Caratteristiche delle unità ordinate e loro schema di cottura. (A,B) Le unità ordinate sono state raggruppate utilizzando l'analisi delle componenti principali (PCA) dallo stesso elettrodo. (C,D) Istogrammi di autocorrelazioni (in alto) e di intervallo inter-spike (in basso) per un neurone eccitatorio putativo (Pyn) e un neurone inibitorio putativo (IN). (E) L'ampiezza della valle del presunto Pyn era significativamente superiore a quella del putativo IN (putativo Pyn: n = 1.055 picchi, putativo IN: n = 1.985 picchi). (F) La durata della forma d'onda del Pyn putativo era più forte di quella dell'IN putativo (Pyn putativo: n = 1.005 picchi, IN: n = 1.059 picchi). (G) La correlazione incrociata tra il presunto Pyn e IN. Analisi statistica con test di Mann-Whitney. Tutti i dati sono presentati come media ± errore standard della media, **p < 0,01, ***p < 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Analisi di due LFP dal MC bilaterale e la coerenza tra gli eventi spike e l'LFP nei topi. (A,B) Spettri di potenza normalizzati del MC bilaterale in ciascuna banda di frequenza nei topi (n = 3). (C) La curva della coerenza di due LFP tra il MC sinistro e destro (n = 3). (D) La curva di correlazione incrociata di due LFP che mostra una correlazione tra il MC sinistro e destro a ±100 ms di ritardo (n = 3). (E) La curva di coerenza del campo spike nel MC di un topo. Analisi statistica con test di Mann-Whitney. Tutti i dati sono presentati come media ± errore standard della media. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La registrazione multicanale nei topi che si muovono liberamente è stata considerata una tecnologia utile negli studi di neuroscienze, ma è ancora piuttosto difficile per i principianti registrare e analizzare i segnali. Nel presente studio, forniamo linee guida semplificate per la realizzazione di sistemi di micro-azionamento e l'esecuzione dell'impianto di elettrodi, nonché procedure semplificate per l'acquisizione e l'analisi dei segnali elettrici tramite software di smistamento dei picchi e software per l'analisi dei dati neurofisiologici.
Dato che la qualità di un sistema di micro-drive su misura contribuisce notevolmente all'acquisizione di segnali stabili e qualitativi nei mouse14,15,16,17 che si muovono liberamente, in questo studio abbiamo progettato e utilizzato una struttura più robusta e leggera per il sistema di micro-drive e i principianti possono seguire facilmente e chiaramente le fasi di produzione per la costruzione del sistema di micro-drive. Inoltre, la struttura del sistema di micro-azionamento progettato prevede l'utilizzo di materiali poco costosi che sono facilmente reperibili nei negozi di ferramenta, a differenza dei sistemi di micro-azionamento più grandi e pesanti utilizzati in studi precedenti14,15. Questo sistema di microazionamento è in grado di ridurre il disagio e resistere all'impatto dei mouse che si muovono liberamente durante le registrazioni. Nel frattempo, abbiamo ulteriormente migliorato le dimensioni e la forma del sistema di micro-drive, che potrebbe essere utile per i principianti consentendo loro di osservare, inserire e quindi spostare le punte degli elettrodi nel cervello durante l'intervento chirurgico. Inoltre, la semplice struttura a scorrimento applicata nel sistema di microazionamento viene accuratamente fatta progredire nel cervello utilizzando una vite ad alta precisione, il che significa che questo sistema fornisce un controllo preciso nella misurazione di più strati dell'area cerebrale mirata; In effetti, questo è estremamente importante per catturare i segnali extracellulari in un animale che si muove liberamente per un periodo sperimentale a lungo termine. Soprattutto, i vantaggi di questo sistema di microazionamento sono la sua semplicità e flessibilità; Tuttavia, il minor numero di canali e l'uso di una serie di elettrodi singoli dovrebbero essere ulteriormente migliorati in una nuova versione.
Ci sono anche diversi miglioramenti nel presente studio degni di nota. A causa delle dimensioni ridotte e della forma modificata del sistema di microazionamento rispetto ai sistemi precedenti, sono stati forniti una visione più ampia e uno spazio di lavoro più ampio per l'operazione. Inoltre, le pareti del cranio del topo erano realizzate con cemento dentale e viti in acciaio inossidabile, che consentivano al sistema di microazionamento di essere saldamente fissato alla testa del topo. Inoltre, le pareti di cemento dentale hanno permesso al carico di vaselina di coprire i fori nel cranio del topo prima di versare il cemento dentale, che ha avuto effetti protettivi sulla superficie cerebrale senza la dura e la parte mobile del sistema di microazionamento. Insieme, questi miglioramenti sono utili, in quanto consentono ai principianti di impiantare il sistema di micro-drive in modo semplice e sicuro nel cervello del topo.
Nelle registrazioni extracellulari multicanale, è opinione diffusa che un'altra difficoltà risieda nell'analizzare i segnali registrati utilizzando un linguaggio di programmazione matematicamente complesso17. Pertanto, forniamo linee guida chiare per i principianti, in particolare in termini di smistamento dei picchi, analisi dei dati LFP e calcolo della relazione tra di loro utilizzando un software comunemente usato in elettrofisiologia. Inoltre, suggeriamo vivamente che l'unità registrata da un saggio a singolo elettrodo raggruppato con metodi PCA dovrebbe avere un numero elevato di caratteristiche per l'analisi, come gli intervalli inter-spike neuronali ordinati e l'ampiezza tra la sua valle e il picco, poiché questi valori sono utili per i principianti per ridurre la distorsione quando le unità vengono raggruppate automaticamente con il software di selezione offline. È importante sottolineare che la relazione tra i segnali che includono i picchi e l'LFP è fondamentale per mediare più comportamenti. Forniamo anche una serie di semplici illustrazioni per misurare le correlazioni spike-spike, LFP-LFP e spike-LFP utilizzando script credibili nel software per l'analisi dei dati neurofisiologici; Queste illustrazioni consentiranno ai principianti di iniziare rapidamente a elaborare e analizzare i segnali registrati nei mouse che si muovono liberamente. Inoltre, i risultati e i dati trattati con questo software proprietario possono essere utilizzati in combinazione con un toolbox open source come Fieldtrip per ulteriori analisi in anticipo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (31871170, 32170950 e 31970915), della Natural Science Foundation della provincia del Guangdong (2021A1515010804 e 2023A1515010899), della Guangdong Natural Science Foundation for Major Cultivation Project (2018B030336001) e della Guangdong Grant: Key Technologies for Treatment of Brain Disorders(2018B030332001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.54 mm pin header | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 1 x 5 | Applying for the movable micro-drive which can slide on its stulls. |
| Adobe Illustrator CC 2017 | Adobe | N/A | To optimize images from GraphPad. |
| BlackRock Microsystems | Blackrock Neurotech | Cerebus | This systems includes headsatge, DA convert, amplifier and computer. |
| Brass nut | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 brass nut | The nut fixes the position of screw. |
| Brass screw | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 x 11 mm brass screw | A screw that hold the movable micro-drive. |
| C57BL/6J | Guangdong Zhiyuan Biomedical Technology Co., LTD. | N/A | 12 weeks of age. |
| Centrifuge tube | Biosharp | 15 mL; BS-150-M | To store mice brain with sucrose sulutions. |
| Conducting paint | Structure Probe, Inc. | 7440-22-4 | To improve the lead-connecting quality between connector pins and Ni-wires. |
| Conductive copper foil tape | 3M | 1181 | To reduce interferenc. |
| Connector | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 2 x 10P | To connect the headtage to micro-drive system. |
| DC Power supply | Maisheng | MS-305D | A power device for electrolytic lesion. |
| Dental cement | Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. | N/A | To fix the electrode arrays on mouse's skull after finishing the implantation. |
| Digital analog converter | Blackrock | 128-Channel | A device that converts digital data into analog signals. |
| Epoxy resin | Alteco | N/A | To cover pins. |
| Excel | Microsoft | N/A | To summarize data after analysis. |
| Eye scissors | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or cutting the Ni-chrome wire. |
| Fine forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery. |
| Forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or assembling the mirco-drive system. |
| Freezing microtome | Leica | CM3050 S | Cut the mouse’s brain into slices |
| Fused silica capillary tubing | Zhengzhou INNOSEP Scientific Co., Ltd. | TSP050125 | To serve as the guide tubes for Ni-chrome wires. |
| Glass microelectrode | Sutter Instrument Company | BF100-50-10 | To mark the desired locations for implantation using the filled ink. |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad Software | N/A | To analyze and visualize the results. |
| Guide-tube | Polymicro technologies | 1068150020 | To load Ni-chrome wires. |
| Headstage | Blackrock | N/A | A tool of transmitting signals. |
| Helium balloon | Yili Festive products Co., Ltd. | 24 inch | To offset the weight of headstage and micro-drive system. |
| Ink | Sailor Pen Co.,LTD. | 13-2001 | To mark the desired locations for implantation. |
| Iodine tincture | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To disinfect mouse's scalp. |
| Lincomycin in Hydrochloride and Lidocaine hydrochloride gel | Hubei kangzheng pharmaceutical co., ltd. | 10g | A drug used to reduce inflammation. |
| Meloxicam | Vicki Biotechnology Co., Ltd. | 71125-38-7 | To reduce postoperative pain in mice. |
| Micromanipulators | Scientifica | Scientifica IVM Triple | For electrode arrays implantation. |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni-E | Capture the images of brain sections |
| nanoZ impedance tester | Plexon | nanoZ | To measure impedance or performing electrode impedance spectroscopy (EIS) for multichannel microelectrode arrays. |
| NeuroExplorer | Plexon | NeuroExplorer | A tool for analyzing the electrophysiological data. |
| NeuroExplorer | Plexon, USA | N/A | A software. |
| Ni-chrome wire | California Fine Wire Co. | M472490 | 35 μm Ni-chrome wire. |
| Offline Sorter | Plexon | Offline Sorter | A tool for sorting the recorded multi-units. |
| PCB board | Hangzhou Jiepei Information Technology Co., Ltd. | N/A | Computer designed board. |
| Pentobarbital | Sigma | P3761 | To anesthetize mice. |
| Pentobarbital sodium | Sigma | 57-33-0 | To anesthetize the mouse. |
| Peristaltic pump | Longer | BT100-1F | A device used for perfusion |
| Polyformaldehyde | Sangon Biotech | A500684-0500 | The main component of fixative solution for fixation of mouse brains |
| PtCl4 | Tianjin Jinbolan Fine Chemical Co., Ltd. | 13454-96-1 | Preparation for gold plating liquid. |
| Saline | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To clean the mouse's skull. |
| Silver wire | Suzhou Xinye Electronics Co., Ltd. | 2 mm diameter | Applying for ground and reference electrodes. |
| Skull drill | RWD Life Science | 78001 | To drill carefully two small holes on mouse's skull. |
| Stainless steel screws | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | M0.8 x 2 | To protect the micro-drive system and link the ground and reference electrodes. |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 68513 | To perform the stereotaxic coordinates of bilateral motor cortex. |
| Sucrose | Damao | 57-50-1 | To dehydrate the mouse brains after perfusion. |
| Super glue | Henkel AG & Co. | PSK5C | To fix the guide tube and Ni-chrome wire. |
| Temperature controller | Harvard Apparatus | TCAT-2 | To maintain mouse's rectal temperature at 37°C |
| Tetracycline eye ointment | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To protect the mouse's eyes during surgery. |
| Thread | Rapala | N/A | To link ballon and headstage. |
| Vaseline | Unilever plc | N/A | To cover the gap between electrode arrays and mouse's skull. |
References
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).
- Singer, W. Synchronization of cortical activity and its putative role in information processing and learning. Annual Review of Physiology. 55, 349-374 (1993).
- Arroyo-García, L. E., et al. Impaired spike-gamma coupling of area CA3 fast-spiking interneurons as the earliest functional impairment in the App(NL-G-F) mouse model of Alzheimer's disease. Molecular Psychiatry. 26 (10), 5557-5567 (2021).
- Ozawa, M., et al. Experience-dependent resonance in amygdalo-cortical circuits supports fear memory retrieval following extinction. Nature Communications. 11 (1), 4358 (2020).
- Vinck, M., Batista-Brito, R., Knoblich, U., Cardin, J. A. Arousal and locomotion make distinct contributions to cortical activity patterns and visual encoding. Neuron. 86 (3), 740-754 (2015).
- Beck, M. H., et al. long-term dopamine depletion causes enhanced beta oscillations in the cortico-basal ganglia loop of parkinsonian rats. Experimental Neurology. 286, 124-136 (2016).
- Magill, P. J., Bolam, J. P., Bevan, M. D. Relationship of activity in the subthalamic nucleus-globus pallidus network to cortical electroencephalogram. Journal of Neuroscience. 20 (2), 820-833 (2000).
- Magill, P. J., et al. Changes in functional connectivity within the rat striatopallidal axis during global brain activation in vivo. Journal of Neuroscience. 26 (23), 6318-6329 (2006).
- Rapeaux, A. B., Constandinou, T. G. Implantable brain machine interfaces: First-in-human studies, technology challenges and trends. Current Opinion in Biotechnology. 72, 102-111 (2021).
- Tort, A. B., et al. Dynamic cross-frequency couplings of local field potential oscillations in rat striatum and hippocampus during performance of a T-maze task. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20517-20522 (2008).
- Yamamoto, J., Wilson, M. A. Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals. Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2430-2440 (2008).
- Chang, E. H., Frattini, S. A., Robbiati, S., Huerta, P. T. Construction of microdrive arrays for chronic neural recordings in awake behaving mice. Journal of Visualized Experiments. (77), e50470 (2013).
- Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. Journal of Visualized Experiments. (61), e3568 (2012).
- Lansink, C. S., et al. A split microdrive for simultaneous multi-electrode recordings from two brain areas in awake small animals. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 129-138 (2007).
- Sato, T., Suzuki, T., Mabuchi, K. A new multi-electrode array design for chronic neural recording, with independent and automatic hydraulic positioning. Journal of Neuroscience Methods. 160 (1), 45-51 (2007).
- van Daal, R. J. J., et al. Implantation of Neuropixels probes for chronic recording of neuronal activity in freely behaving mice and rats. Nature Protocols. 16 (7), 3322-3347 (2021).
- Unakafova, V. A., Gail, A. Comparing open-source toolboxes for processing and analysis of spike and local field potentials data. Frontiers in Neuroinformatics. 13, 57 (2019).
- Mao, L., Wang, H., Qiao, L., Wang, X. Disruption of Nrf2 enhances the upregulation of nuclear factor-kappaB activity, tumor necrosis factor-alpha, and matrix metalloproteinase-9 after spinal cord injury in mice. Mediators of Inflammation. 2010, 238321 (2010).
- Jin, Z., Zhang, Z., Ke, J., Wang, Y., Wu, H. Exercise-linked irisin prevents mortality and enhances cognition in a mice model of cerebral ischemia by regulating Klotho expression. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1697070 (2021).
- Ding, X., et al. Spreading of TDP-43 pathology via pyramidal tract induces ALS-like phenotypes in TDP-43 transgenic mice. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 15 (2021).
- Cao, W., et al. Gamma oscillation dysfunction in mPFC leads to social deficits in neuroligin 3 R451C knockin mice. Neuron. 97 (6), 1253-1260 (2018).
