Summary
이 프로토콜은 자유롭게 움직이는 의식이 있는 마우스의 세포외 전기생리학적 특성을 밝히기 위해 운동 피질(MC)에서 세포외 기록 방법론을 설명하고, 관심 행동의 기저에 있는 네트워크 신경 활동을 평가하는 데 유용한 국소전위(LFP) 및 스파이크의 데이터 분석을 설명합니다.
Abstract
이 프로토콜은 전기생리학적 신호를 자발적 및/또는 특정 행동과 연관시킴으로써 특정 작업을 수행하는 마우스에서 신경 세포 발화 및 네트워크 국소장 전위(LFP)의 특성을 밝히는 것을 목표로 합니다. 이 기술은 이러한 행동의 기초가 되는 뉴런 네트워크 활동을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 이 논문은 자유롭게 움직이는 의식이 있는 마우스에서 전극 이식 및 그에 따른 세포외 기록에 대한 상세하고 완전한 절차를 제공합니다. 이 연구에는 미세 전극 어레이를 이식하고, 다중 채널 시스템을 사용하여 운동 피질(MC)에서 LFP 및 신경 세포 스파이크 신호를 캡처하고, 후속 오프라인 데이터 분석을 위한 자세한 방법이 포함됩니다. 의식이 있는 동물에서 다중 채널 기록의 장점은 더 많은 수의 스파이킹 뉴런과 뉴런 아형을 얻고 비교할 수 있어 특정 행동과 관련 전기생리학적 신호 간의 관계를 평가할 수 있다는 것입니다. 특히, 본 연구에서 기술한 다채널 세포외 기록 기법 및 데이터 분석 절차는 행동하는 마우스에서 실험을 수행할 때 다른 뇌 영역에도 적용될 수 있다.
Introduction
세포외 신호의 중요한 구성 요소인 국소전위(LFP)는 여러 행동에 대한 신경 코드를 형성하는 대규모 뉴런 집단의 시냅스 활동을 반영합니다1. 신경 활동에 의해 생성된 스파이크는 LFP에 기여하는 것으로 간주되며 신경 코딩에 중요합니다2. 스파이크와 LFP의 변화는 알츠하이머병과 같은 여러 뇌 질환과 두려움 등의 감정을 매개하는 것으로 입증되었습니다.3,4. 많은 연구에서 동물의 스파이크 활동이 깨어 있는 상태와 마취된 상태 간에 유의한 차이가 있음을 강조했다는 점은 주목할 가치가 있다5. 마취된 동물에서의 기록은 고도로 정의된 피질 동기화 상태에서 최소한의 인공물로 LFP를 평가할 수 있는 기회를 제공하지만, 결과는 깨어 있는 피험자에서 발견될 수 있는 것과는 어느 정도 다르다 6,7,8. 따라서 뇌에 이식된 전극을 이용하여 각성 뇌 상태에서 각종 질환의 장시간 규모와 넓은 공간적 규모에 걸친 신경 활동을 검출하는 것이 더 의미가 있다. 이 원고는 기록 및 분석을 시작하기 위해 빠르고 간단한 방법으로 스파이크 및 LFP 신호를 계산하기 위해 공통 소프트웨어를 사용하여 마이크로 드라이브 시스템을 만들고 매개변수를 설정하는 방법에 대한 초보자를 위한 정보를 제공합니다.
두피에서 기록된 뇌전도(EEG) 및 사건 관련 전위(ERP)를 사용하는 것과 같은 뇌 기능의 비침습적 기록은 인간 및 설치류 연구에서 광범위하게 사용되어 왔지만, EEG 및 ERP 데이터는 공간적, 시간적 특성이 낮기 때문에 특정 뇌 영역 내에서 근처의 수지상 시냅스 활동에 의해 생성된 정확한 신호를 감지할 수 없습니다1. 현재, 의식이 있는 동물에서 다채널 기록을 이용함으로써, 여러 행동 테스트 중에 영장류나 설치류의 뇌에 마이크로 드라이브 시스템을 이식하여 뇌의 더 깊은 층의 신경 활동을 만성적이고 점진적으로 기록할 수 있습니다 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . 간단히 말해서, 연구자들은 뇌의 다른 부분들을 표적으로 삼기 위해 전극 또는 사극의 독립적인 포지셔닝에 사용될 수 있는 마이크로-드라이브 시스템을 구성할 수 있다(10,11). 예를 들어, Chang et al.은 가볍고 컴팩트한 마이크로-드라이브(12)를 조립함으로써 마우스에서 스파이크 및 LFP를 기록하는 기술을 기술하였다. 또한, 맞춤형 액세서리 구성 요소를 갖는 미세 가공된 실리콘 프로브는 행동 작업 동안 설치류에서 다수의 단일 뉴런 및 LFP를 기록하기 위해 상업적으로 이용 가능하다(13). 마이크로 드라이브 시스템을 조립하기 위해 다양한 설계가 사용되었지만 전체 마이크로 드라이브 시스템의 복잡성과 무게 측면에서 여전히 제한적인 성공을 거두었습니다. 예를 들어, Lansink 등은 단일 뇌 영역(14)으로부터 기록하기 위한 복잡한 구조를 갖는 다중채널 마이크로-드라이브 시스템을 보여주었다. Sato et al.은 자동 유압 포지셔닝 기능(15)을 표시하는 다채널 마이크로 드라이브 시스템을 보고하였다. 이러한 마이크로 드라이브 시스템의 주요 단점은 마우스가 자유롭게 움직이기에는 너무 무겁고 초보자가 조립하기 어렵다는 것입니다. 다채널 세포외 기록은 행동 테스트 중 신경 활동을 측정하는 데 적합하고 효율적인 기술임이 밝혀졌지만, 초보자가 복잡한 마이크로 드라이브 시스템에서 획득한 신호를 기록하고 분석하는 것은 쉽지 않습니다. 자유롭게 움직이는 마우스(16, 17)에서 다채널 세포외 기록 및 데이터 분석의 전체 동작 과정을 시작하는 것이 어렵다는 점을 감안할 때, 본 논문은 일반적으로 이용 가능한 구성요소 및 설정을 사용하여 마이크로-드라이브 시스템을 만드는 상세한 과정을 소개하기 위한 단순화된 가이드라인을 제시한다; 빠르고 간단한 방법으로 스파이크 및 LFP 신호를 계산하기 위한 공통 소프트웨어의 매개변수도 제공됩니다. 또한 이 프로토콜에서 마우스는 헬륨 풍선을 사용하여 자유롭게 움직일 수 있으며, 이는 헤드스테이지 및 마이크로 드라이브 시스템의 무게를 상쇄하는 데 기여합니다. 일반적으로 본 연구에서는 마이크로 드라이브 시스템을 쉽게 구축하고 기록 및 데이터 분석 프로세스를 최적화하는 방법을 설명합니다.
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Protocol
모든 마우스는 상업적으로 수득하였고, 22-25°C의 실온 및 50%-60%의 상대 습도에서 12시간 빛/12시간 어두운 주기(현지 시간 08:00에 점등)로 유지하였다. 생쥐들은 먹이와 물을 지속적으로 공급받을 수 있었다. 모든 실험은 화남사범대학의 실험동물 관리 및 사용 지침에 따라 수행되었으며 기관 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 생후 3-5개월 된 수컷 C57BL/6J 마우스를 실험에 사용하였다.
1. 마이크로 드라이브 시스템 조립
- 이동식 마이크로 드라이브를 고정하는 나사와 두 개의 스툴을 사용하여 두 개의 컴퓨터 설계 기판을 연결하고 커넥터를 하나의 기판에 연결합니다(그림 1A, Bi-iii). 나사(0.5mm/원)를 비틀어 마이크로 드라이브를 구동합니다.
- 마이크로 드라이브가 MC 영역의 각 측면에 대해 8개의 가이드 튜브(길이 ~3cm, 내경 ~50μm, 외경 ~125μm)로 구성된 두 세트를 운반할 수 있는지 확인한 다음 동일한 길이(최소 15mm; 그림 1Biv, v).
- 직경 35μm의 니켈 크롬 와이어 16개(~5cm 길이)를 절단한 다음 가이드 튜브에 연속적으로 로드한 다음 접착제를 도포하여 고정합니다(그림 1Bi, vi, vii).
- 전선 절연체를 벗겨내고 노출된 각 전선을 채널 맵을 따라 커넥터에서 각 핀에 연속적으로 꼬은 다음 기준 전극 및 접지 전극을 연달아 꼬은 다음 각 핀에 전도성 페인트를 천천히 코팅합니다(그림 1Bviii-x).
- 에폭시 수지(그림 1Axi, xii)를 사용하여 핀을 덮은 다음 임피던스 테스터를 통해 금 도금을 수행하여 전극 팁의 임피던스를 ~350kOhm으로 줄입니다(그림 1Bxiii, xiv). 임피던스 테스터의 매개 변수를 다음과 같이 설정합니다 : 10.08mM PtCl4를 포함한 금 도금 용액으로 1 초 동안 −4μA 직류.
- 마지막으로 나사를 돌려 마이크로 드라이브를 상단으로 이동합니다. 그림 1A 와 같이 수정된 마이크로 드라이브 시스템의 전체 크기(길이 약 15mm, 너비 10mm, 높이 20mm, 무게 ~1g)를 확인합니다. 컴퓨터로 설계된 기판 및 가동 부품의 자세한 사양은 그림 1Ai, ii에서 확인하십시오.
2. 전극 어레이 이식
- 수술 키트를 소독하고, 멸균 장갑을 착용하고, 수술이 시작되기 전에 의사의 멸균 흰색 가운을 입습니다.
- 통증을 관리하기 위해 유도 챔버에서 마우스에 멜록시캄 주사제(5mg/kg)를 피하(s.c.) 주사합니다. 그런 다음 유도 챔버18,19에서 펜토바르비탈(80mg/kg)의 복강내(ip) 주사에 의해 마우스를 마취시킨다. 발가락 꼬집 반사가 여전히 존재하는 경우 펜토바르비탈(20mg/kg/h)을 보충 투여하십시오.
- 마우스를 입체 장치에 고정하고 온도 조절기를 사용하여 직장 온도를 37°C로 유지합니다.
- 생쥐의 양쪽 눈에 테트라사이클린 눈 연고를 바르고 수술 전에 멸균 장갑을 다시 교체합니다.
- 쥐의 털을 면도하고 멸균 면 팁 어플리케이터를 사용하여 중앙에서 시작하여 바깥쪽으로 동심원으로 베타딘 스크럽과 알코올을 번갈아 3회 번갈아 가며 수술 부위를 소독합니다(그림 2i, ii). 두개골을 노출시키기 위해 정중선을 작게 절개(~15mm)합니다. 즉시 통증 완화를 위해 1% 리도카인을 목 근육에 국소적으로 바르십시오. 그런 다음 가위를 사용하여 잔여 조직을 제거하고 식염수 코팅된 면봉을 사용하여 두개골을 청소합니다(그림 2iii).
- 잉크로 채워진 유리 미세 전극을 사용하여 이식을 위해 양측 MC의 원하는 위치를 표시합니다(그림 2iv, v). 선행 연구(20)에 기초하여, 양측 MC의 위치는 다음과 같다: 브레그마에서 0.74mm, 정중선에서 1.25mm.
- 마이크로 드라이브 시스템을 보호하기 위해 4개의 스테인리스 스틸 나사(직경 0.8mm)를 이식한 다음 모든 나사를 기준 전극 및 접지 전극과 함께 연결한 다음 혼합 치과용 시멘트로 덮어 벽을 형성합니다(그림 2vi-xi).
- MC 영역에서 조정된 두개골의 왼쪽과 오른쪽 모두에 두개골 드릴로 두 개의 작은 구멍(~1.5mm2)을 조심스럽게 뚫습니다(그림 2xii). 양측 MC의 입체 좌표를 사용합니다 : 브레그마에서 전방 0.74mm, 정중선에서 측면 1.25mm, 경막에서 복부 0.5mm.
- 미세한 집게로 구멍에서 경막을 조심스럽게 제거합니다(그림 2xiii).
- 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 10μm/s의 속도로 마이크로 드라이브 시스템을 구멍 중앙에 삽입합니다(그림 2xiv-xvii).
- 마이크로 드라이브 시스템 삽입을 마친 후 치과용 시멘트 벽에 바셀린을 채웁니다(그림 2xviii).
- 마이크로 드라이브 시스템의 바닥판과 치과용 시멘트 벽을 혼합된 치과용 시멘트로 결합합니다(그림 2xix).
- 절개 부위를 식염수로 씻은 후 린코마이신 염산염과 리도카인 염산염이 함유된 겔로 국소 치료를 하여 수술 후 통증을 완화합니다.
- 이식된 마이크로 드라이브 시스템에 전도성 동박 테이프를 감습니다(그림 2xx).
- 마우스를 31-33°C로 유지되는 케이지로 옮기고 마우스가 마취에서 회복되는지 모니터링합니다.
- 생쥐가 별도의 먹이로 1주일 동안 회복되도록 합니다. 린코마이신 염산염과 리도카인 염산염이 함유된 겔을 3일 동안 지속적으로 도포하여 절개 부위를 확인하고 치료합니다.
3. 자유롭게 움직이는 마우스의 양측 MC에서 다중 채널 기록
- 깨어 있는 쥐의 머리를 가볍고 조심스럽게 잡습니다. 최소 0.1일 전에 마이크로 드라이브 시스템의 가동 가능한 부분(그림 1Aii)에 있는 나사를 비틀어 전극 어레이(~1mm 깊이)를 아래로 이동합니다.
- 깨어 있는 마우스의 머리를 가볍고 조심스럽게 잡습니다. 헤드스테이지의 중앙과 헬륨 풍선(약 0.02L의 헬륨으로 채워짐)을 나사산으로 연결하여 헤드스테이지와 마이크로 드라이브 시스템의 무게를 상쇄합니다(그림 3A, B).
- 레코딩 소프트웨어에서 30kHz로 샘플링하여 레코딩 전극 및 멀티채널 시스템을 사용하여 원시 신호를 캡처한 다음 멀티채널 시스템의 디지털-아날로그(DA) 컨버터를 사용하여 디지타이징할 수 있습니다.
- 녹음 소프트웨어에서 10kHz로 리샘플링하여 원시 데이터에서 LFP 신호를 추출한 다음 녹음 소프트웨어의 노치 필터를 사용하여 50Hz 라인 노이즈를 제거합니다.
- 자유롭게 움직이는 마우스에서 최소 60초 동안 안정적인 상태로 원시 데이터를 기록합니다. 녹화가 끝나면 헤드스테이지와 마이크로 드라이브 시스템 사이의 연결을 천천히 제거하고 마우스를 홈 케이지로 되돌립니다.
- 기록된 데이터를 컴퓨터에 저장하고 오프라인으로 분석합니다(그림 4 및 그림 5).
- 실험 종료 후 연구소의 지침에 따라 안락사를 시행한 후 3V 출력의 전원을 이용하여 전극의 위치를 확인하여 1분 동안 전해 병변을 시행한 후 조직학적 분석을 실시합니다. 냉동 마이크로톰을 사용하여 쥐의 뇌를 30μm 조각으로 자르고 MC 섹션을 수집한 다음 현미경으로 이미지를 캡처합니다(그림 3C, D).
4. 스파이크 분류 및 분석
- 스파이크 정렬 소프트웨어에서 파일 > 열기 > Nev 파일을 클릭하여 30kHz로 샘플링된 스파이크 데이터를 엽니다(그림 4Ai).
- 정보를 클릭하여 정렬되지 않은 채널을 선택한 다음 정렬 > 정렬 방법 변경 > K-평균 사용을 선택합니다. Valley-Seeking Sort > K-Means Sorting 버튼을 눌러 정렬된 단위를 구합니다(그림 4Aii, iii).
- File(파일) > Save as(다른 이름으로 저장)를 클릭하고, 정렬된 스파이크 데이터를 .nev 파일 이름 확장자로 저장하고, File(파일 ) > Export Per-Waveform Data(파형별 데이터 내보내기 )를 선택하여 .txt 파일 이름 확장자를 가진 PCA 결과를 내보냅니다(그림 4Aiv).
- 신경 생리학적 데이터 분석을 위한 소프트웨어에서 File(파일) > Import Data(데이터 가져오기) > Blackrock File(블랙록 파일 )을 클릭하여 정렬된 스파이크 파일을 엽니다(그림 4Bi).
- Analysis( 분석) > Autocorrelograms(자동 코렐로그램) 를 클릭하여 선택한 단위에 대한 autocorrelogram을 구한 다음 -0.05초에서 X 최소값, 0.05초에서 X 최대값, 0.001에서 Bin 값으로 매개변수를 설정합니다(그림 4Bii, iii).
- 정렬된 스파이크 데이터를 로드하고 분석 > 인터스파이 크 간격 히스토그램을 클릭하여 스파이크 간 간격 히스토그램을 구한 다음 0초의 최소 간격 값, 0.1초의 최대 간격 값, 0.001의 Bin 값으로 매개변수를 설정합니다(그림 4Biv, v).
- 분석 > Crosscorrelograms를 클릭하여 정렬된 두 단위 이벤트 간의 교차 상관을 구한 다음 참조 이벤트 및 매개변수를 -0.1초에서 X 최소값, 0.1초에서 X 최대값, 0.001에서 Bin 값으로 설정합니다(그림 4Bvi, vii).
- Results > Numerical Results를 클릭하여 autocorrelogram, inter-spike interval histogram 및 cross-correlogram의 결과를 .xls 파일 이름 확장자로 저장합니다(그림 4Bviii, ix). 데이터를 분석하고 그래프를 그립니다.
5. LFP 분석
- 신경 생리학적 데이터 분석을 위한 소프트웨어에서 File Import Data(파일 가져오기 데이터) > Blackrock File(Blackrock 파일 )을 클릭하여 10kHz로 샘플링된 연속 신호 데이터를 엽니다(그림 5Ai).
- 연속에 대한 분석 > 스펙트럼을 클릭하여 선택한 채널에서 LFP에 대한 파워 스펙트럼을 분석합니다. 파라미터를 8,192에서의 주파수 값 수, 3-5에서의 다중 테이퍼 값, 총 전력 스펙트럼 밀도(PSD)의 백분율 정규화, 1Hz에서 100Hz까지의 주파수 범위로 설정합니다(그림 5Aii, iii).
- Analysis(분석) > Coherence for Continuous(연속 )를 클릭하여 MC의 왼쪽과 오른쪽에서 두 LFP의 일관성을 분석합니다. 참조 채널과 매개변수를 다음과 같이 설정합니다. 일관성 값, 8,192에서의 주파수 값 수, 3-5에서의 다중 테이퍼 값, 1Hz에서 100Hz까지의 주파수 범위(그림 5Aiv, v)입니다.
- 클릭 분석 > Corr. with Cont. 변수를 사용하여 MC의 왼쪽과 오른쪽에서 두 LFP 간의 상관 관계를 분석합니다. 참조 채널(LFP 데이터) 및 매개변수를 다음과 같이 설정합니다. -0.1초에서 X 최소값, 0.1초에서 X 최대값, 0.001에서 Bin 값(그림 5Avi, vii)를 참조하십시오.
- Results > Numerical Results를 클릭하여 PSD의 결과, 일관성 및 상관 관계를 .xls 파일 이름 확장자와 함께 저장합니다(그림 5Aviii, ix).
- 각 주파수 대역에 대해 대표 트레이스를 추출해야 하는 채널을 선택하고 Edit > Digital Filtering of Continuous Variables(연속 변수의 디지털 필터링)를 클릭하여 각 주파수 대역을 구한 다음 Filter Freq. 응답을 Bandpass로, IIR(Infinite Impulse Response) Butterworth에서 Filter Implementation, 2에서 Filter Order 값으로 파라미터를 설정합니다. 마지막으로 관심 주파수 범위를 설정합니다(그림 5Bi-iv).
참고: 여기에 사용된 주파수 범위는 델타(δ, 1-4Hz), 세타(θ, 5-12Hz), 베타(β, 13-30Hz), 낮은 감마(낮은 γ, 30-70Hz) 및 높은 감마(높은 γ, 70-100Hz) 진동입니다. - 데이터를 분석하고 그래프를 그립니다.
6. 스파이크와 LFP의 상관관계
- 클릭 파일 > 데이터 가져 오기 데이터 > Blackrock 파일 신경 생리학 데이터 분석을 위해 소프트웨어에서 연속 신호 데이터 및 스파이크 데이터를 엽니 다.
- Analysis(분석) > Coherence Analysis(일관성 분석)를 클릭하여 선택한 채널의 스파이크와 LFP 간의 일관성을 분석합니다. 참조 변수(스파이크 타이밍) 및 매개변수를 다음과 같이 설정합니다. 일관성 값, 512에서 주파수 값의 수, 3-5에서 다중 테이퍼 값, 1Hz에서 100Hz까지의 주파수 범위에서 계산합니다(그림 5Ci, ii).
- Results > Numerical Results를 클릭하여 .xls 파일 이름 확장자를 사용하여 스파이크 필드 일관성의 결과를 저장합니다(그림 5Ciii, iv).
- 데이터를 분석하고 그래프를 그립니다.
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Representative Results
고역 통과(250Hz) 필터를 적용하여 원시 신호에서 다중 단위 스파이크를 추출했습니다(그림 6A). 또한, PCA에 의해 정렬된 일반 마우스의 MC에서 기록된 단위를 검증하고(그림 7A-D), 마우스의 MC에 있는 단위의 밸리 폭과 파형 지속 시간을 기록했습니다. 그 결과, 생쥐에서 MC 추정 피라미드 뉴런(Pyn)의 밸리 폭과 파형 지속 시간이 추정 인터뉴런(IN)보다 높다는 것을 보여주었습니다(그림 7E,F; 두 개의 샘플 Mann-Whitney 테스트; 밸리 폭의 경우, 추정 Pyn: 0.636ms ± 0.004ms, 추정 IN: 0.614ms ± 0.001ms, p = 0.002; 파형 지속 시간, 추정 Pyn: 0.095 ms ± 0.004 ms, 추정 IN: 0.054 ms ± 0.002 ms, p = 1.402 x 10−16), 이전 연구21에서 Pyn 및 IN의 특성에 해당. 또한 추정 Pyn 스파이크를 기준으로 설정하여 추정 Pyn과 IN 사이의 교차 상관을 계산하고 ~18ms에서 양의 피크를 발견했으며(그림 7G), 이는 추정 Pyn 스파이킹이 ~18ms의 창에서 추정 IN 스파이킹 이전에 발생함을 나타냅니다.
각 주파수 대역의 대표 미량은 신경 생리학적 데이터 분석을 위한 소프트웨어의 IIR 필터에 의해 LFP에서 필터링되었습니다(그림 6A). LFP 분석에서 정상 마우스에서 왼쪽 및 오른쪽 MC의 LFP는 파워 스펙트럼에서 유사했으며, 이는 왼쪽 MC와 오른쪽 MC 간의 동기화된 활동을 시사합니다(그림 8A,B; 두 개의 샘플 Mann-Whitney 테스트; δ의 경우 왼쪽 MC: 50.71 ± 1.136, 오른쪽 MC: 50.47 ± 1.213, p = 0.70; θ의 경우, 왼쪽 MC: 2.197 ± 0.187, 오른쪽 MC: 2.068 ± 0.193, p = 0.40; β의 경우 왼쪽 MC: 0.222 ± 0.058, 오른쪽 MC: 0.206 ± 0.055, p = 0.70; 저γ의 경우 왼쪽 MC: 0.114 ± 0.034, 오른쪽 MC: 0.093 ± 0.018, p = 0.70; 고γ의 경우 왼쪽 MC: 0.054 ± 0.027, 오른쪽 MC: 0.04 ± 0.015, p = 0.40). 그런 다음 왼쪽과 오른쪽 MC 간의 일관성과 상관 관계를 계산하고(그림 8C,D, 왼쪽 MC LFP는 오른쪽 MC LFP 이후 ~1.2ms, -1.167ms ± 0.667ms) 정상 마우스의 왼쪽 MC에서 LFP(1-100Hz)와 동기화된 추정 Pyn 또는 IN 스파이킹의 크기를 계산했습니다(그림 8E). 이것은 Pyn에 비해 추정 IN에 대해 더 강한 낮은 γ 일관성을 보여주었습니다.
그림 1: 전극 및 다중 채널 기록 시스템의 다이어그램. (A) 마이크로 드라이브 시스템의 그림. 나는. 컴퓨터 설계 보드의 도면 및 사양. ii. 이동식 마이크로 드라이브의 개략도. (B) 마이크로 드라이브 시스템 및 다중 채널 이동식 단일 전극 단계. 나는. 니켈 크롬 와이어; ii. 전극의 구성 부분; iii. 컴퓨터로 설계된 보드의 조립; iv. 커넥터와 8개의 가이드 튜브를 포함한 전극의 예비 조립; v입니다. 마이크로 드라이브의 다른 쪽; vi,vii입니다. 니켈 크롬 와이어는 가이드 튜브에 연속적으로 로드됩니다. VIII-X입니다. 노출된 각 와이어는 각 핀에 연속적으로 꼬인 다음 각 핀에 전도성 페인트를 코팅합니다. xi,xii입니다. 핀은 에폭시 수지로 덮여 있습니다. XIII,XIV. 금도금. (C) 자유롭게 움직이는 마우스의 MC에서 세포 외 기록의 실험 설계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 단계별 수술 절차. 나,II. 쥐의 털을 면도하고 베타딘 스크럽과 알코올을 번갈아 가며 3회 번갈아 가며 수술 부위를 소독합니다. iii. 쥐의 두개골을 청소하십시오. iv. 평준화. v입니다. 뇌의 위치를 표시하십시오. vi. 스테인리스 스틸 나사의 위치를 표시하십시오. vii. 스테인리스 스틸 나사를 삽입합니다. viii. 나사를 기준 전극 및 접지 전극과 함께 연결합니다. ix,x입니다. 치과용 시멘트를 혼합합니다. xi. 치과용 시멘트로 벽을 만듭니다. xii,xiii입니다. 양측 MC 위에 두 개의 작은 구멍을 뚫은 다음 경막을 제거합니다. xiv. 마이크로 드라이브 시스템을 준비합니다. XV-XIX입니다. 마이크로 드라이브 시스템을 이식한 후 린코마이신 염산염과 리도카인 염산염이 함유된 겔로 국소 치료를 하여 수술 후 통증을 완화합니다. xx. 마이크로 드라이브 시스템을 전도성 동박 테이프로 보호하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 의식이 있는 마우스에서 머리를 고정한 기록의 그림. (A) 자유롭게 움직이는 녹음을 위한 개략도. (B) 자유롭게 움직이는 녹화의 이미지 세부 정보. 나는. 이식된 마이크로 드라이브 시스템의 평면 형태; ii. 헤드스테이지; III,IV.입니다. 마이크로 드라이브 시스템과 헤드스테이지가 연결되어 있습니다. v입니다. 헬륨 풍선은 헤드스테이지와 마이크로 드라이브 시스템의 무게를 상쇄하기 위해 적용됩니다. (C) 전해 병변을 이용하여 기록 부위의 위치를 확인하는 그림. (D) 마우스의 MC에서 전해 병변으로 표지된 기록 부위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 스파이크 정렬 및 분석 그림. (A) 스파이크 데이터를 클러스터링하고 결과를 내보내기 위한 매개 변수입니다. 나는. 스파이크 데이터를 가져옵니다. ii. 정렬 방법을 선택하십시오. iii. κ-평균 알고리즘을 사용하여 스파이크 데이터를 정렬합니다. iv. 정렬된 단위에서 결과를 내보냅니다. (B) 정렬된 단위의 스파이크 간 간격 히스토그램, 자기 코렐로그램 및 교차 상관을 분석하는 프로세스. 나는. 정렬된 스파이크 데이터를 가져옵니다. ii. 자기상관 분석을 수행합니다. iii. autocorrelogram에 대한 매개 변수를 설정합니다. iv. 스파이크 간 간격 히스토그램을 얻습니다. v. 스파이크 간 간격 히스토그램에 대한 매개변수를 설정합니다. vi. 정렬된 단위에서 스파이크 간의 상호 상관을 계산합니다. vii. 교차 상관도에 대한 매개변수를 설정합니다. VIII,IX. 결과를 내보냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 연속 데이터 분석의 그림. (A) LFP의 파워 스펙트럼, 일관성 및 두 LFP 간의 상관 관계를 사용하여 계산된 LFP 신호를 분석하기 위한 프로세스 및 매개변수. i. LFP 데이터를 가져옵니다. ii. 양측 MC에서 LFP에 대한 전력 스펙트럼 밀도를 계산합니다. 아이. LFP에 대한 전력 스펙트럼 밀도를 계산합니다. iv,v. LFP 간의 일관성을 계산합니다. vi,vii입니다. 두 LFP 간의 상관 관계를 계산합니다. viii,ix. 결과를 내보냅니다. (B) LFP 신호에서 각 주파수 범위를 필터링하는 프로세스. i. LFP 데이터에서 다른 주파수 대역을 추출합니다. II,III.입니다. 필터링된 LFP를 봅니다. iv. 필터링된 LFP를 향상된 메타파일로 저장합니다. (C) 신경 세포 스파이크와 LFP 사이의 일관성을 분석하는 과정. 나, II. LFP와 정렬된 스파이크 간의 일관성을 계산합니다. III,IV.입니다. 결과를 내보냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 기록된 신호의 대표적인 트레이스. 스파이크는 30kHz로 샘플링된 원시 데이터에서 250Hz로 고역 통과 필터링되었습니다. LFP는 10kHz로 샘플링된 원시 데이터입니다. δ LFP에서 1-4Hz로 필터링된 델타 주파수 대역 대역이었습니다. θ는 LFP에서 5-12Hz로 필터링된 세타 주파수 대역이었습니다. β LFP에서 13-30Hz로 필터링된 베타 주파수 대역이었습니다. 낮은 γ는 LFP에서 30-70Hz로 필터링된 낮은 감마 주파수 대역이었습니다. 높은 γ은 LFP에서 70-100Hz로 필터링된 높은 감마 주파수 대역이었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 정렬된 장치의 특성과 발사 패턴. (A,B) 정렬된 단위는 동일한 전극의 주성분 분석(PCA)을 사용하여 클러스터링되었습니다. (씨,디) 추정 흥분성 뉴런(Pyn) 및 추정 억제성 뉴런(IN)에 대한 자기상관(위) 및 스파이크 간 간격 히스토그램(아래). (E) 추정 Pyn의 골짜기 폭은 추정 IN의 골짜기 폭보다 현저히 높았다(추정 Pyn: n = 1,055 스파이크, 추정 IN: n = 1,985 스파이크). (F) 추정 Pyn의 파형 지속 시간은 추정 IN의 파형 지속 시간보다 강했습니다(추정 Pyn: n = 1,005 스파이크, 추정 IN: n = 1,059 스파이크). (G) 추정 Pyn과 IN 사이의 상호 상관. Mann-Whitney 검정을 사용한 통계 분석. 모든 데이터는 평균의 평균 ± 표준 오차, **p < 0.01, ***p < 0.001로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 양측 MC의 LFP 2개 분석 및 마우스의 스파이크 이벤트와 LFP 간의 일관성. (A,B) 마우스의 각 주파수 대역에서 양측 MC의 정규화된 전력 스펙트럼(n = 3). (C) 왼쪽과 오른쪽 MC 사이의 두 LFP의 일관성 곡선(n=3). (D) ±100ms 시간 지연(n=3)에서 좌우 MC 간의 상관관계를 나타내는 두 LFP의 교차 상관 곡선. (E) 마우스의 MC에서 스파이크 필드 일관성 곡선. Mann-Whitney 검정을 사용한 통계 분석. 모든 데이터는 평균± 평균의 표준 오차로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
자유롭게 움직이는 마우스의 다중 채널 기록은 신경 과학 연구에서 유용한 기술로 간주되어 왔지만 초보자가 신호를 기록하고 분석하는 것은 여전히 매우 어렵습니다. 본 연구에서는 마이크로 드라이브 시스템을 만들고 전극 이식을 수행하기 위한 간단한 지침과 스파이크 분류 소프트웨어 및 신경 생리학적 데이터 분석을 위한 소프트웨어를 통해 전기 신호를 캡처하고 분석하는 간단한 절차를 제공합니다.
맞춤형 마이크로 드라이브 시스템의 품질이 자유롭게 움직이는 마우스(14,15,16,17)에서 안정적이고 정성적인 신호의 획득에 크게 기여한다는 점을 감안할 때, 본 연구에서는 마이크로 드라이브 시스템을 위해 보다 견고하고 가벼운 구조를 설계하고 사용했으며, 초보자는 마이크로 드라이브 시스템을 구성하기 위한 제조 단계를 쉽고 명확하게 따를 수 있습니다. 또한, 설계된 마이크로-드라이브 시스템의 구조는 이전 연구들에서 사용된 더 크고 무거운 마이크로-드라이브 시스템과는 달리, 철물점에서 쉽게 구할 수 있는 값싼 재료들을 포함한다14,15. 이 마이크로 드라이브 시스템은 레코딩 중 불편함을 줄이고 자유롭게 움직이는 마우스의 충격을 견딜 수 있습니다. 한편, 마이크로 드라이브 시스템의 크기와 모양을 더욱 개선하여 수술 중에 전극 끝을 관찰하고 삽입하여 뇌로 이동할 수 있도록 하여 초보자에게 도움이 될 수 있습니다. 또한, 마이크로 드라이브 시스템에 적용된 간단한 슬라이드 구조는 고정밀 나사를 사용하여 뇌에서 정확하게 진행되며, 이는 이 시스템이 표적 뇌 영역의 여러 층을 측정하는 데 정밀한 제어를 제공한다는 것을 의미합니다. 실제로, 이것은 장기간 실험 기간 동안 자유롭게 움직이는 동물의 세포 외 신호를 포착하는 데 매우 중요합니다. 무엇보다도 이 마이크로 드라이브 시스템의 장점은 단순성과 유연성입니다. 그러나 더 적은 수의 채널과 단일 전극 어레이의 사용은 새 버전에서 더욱 개선되어야 합니다.
본 연구에는 주목할 만한 몇 가지 개선 사항도 있습니다. 이전 시스템에 비해 마이크로 드라이브 시스템의 크기가 작고 모양이 변경되었기 때문에 작업을 위해 더 넓은 시야와 더 넓은 작업 공간이 제공되었습니다. 또한 쥐의 두개골 벽은 치과용 시멘트와 스테인리스 스틸 나사로 만들어져 마이크로 드라이브 시스템을 쥐의 머리에 강하게 부착할 수 있었습니다. 또한 치과용 시멘트 벽은 치과용 시멘트를 붓기 전에 쥐의 두개골에 있는 구멍을 덮기 위해 바셀린을 적재할 수 있도록 하여 경막과 마이크로 드라이브 시스템의 가동 부분 없이 뇌 표면을 보호하는 효과가 있었습니다. 이러한 개선 사항은 초보자가 마이크로 드라이브 시스템을 마우스 뇌에 쉽고 자신 있게 이식할 수 있도록 하기 때문에 유용합니다.
다채널 세포외 기록에 있어서, 수학적으로 복잡한 프로그래밍 언어(17)를 사용하여 기록된 신호를 분석하는 데 또 다른 어려움이 있다고 널리 알려져 있다. 따라서 특히 전기 생리학에서 일반적으로 사용되는 소프트웨어를 사용하여 스파이크 정렬, LFP 데이터 분석 및 이들 간의 관계 계산 측면에서 초보자를 위한 명확한 지침을 제공합니다. 또한 PCA 방법으로 클러스터링된 단일 전극 분석에서 기록된 단위는 정렬된 뉴런 간 스파이크 간격 및 밸리와 피크 사이의 너비와 같은 분석을 위한 많은 기능을 가져야 하며, 이러한 값은 오프라인 분류기 소프트웨어를 사용하여 단위가 자동으로 클러스터링될 때 초보자가 편향을 줄이는 데 유용하기 때문입니다. 중요한 것은 스파이크를 포함하는 신호와 LFP 간의 관계가 여러 행동을 중재하는 데 중요하다는 것입니다. 또한 신경 생리학적 데이터 분석을 위한 소프트웨어에서 신뢰할 수 있는 스크립트를 사용하여 스파이크-스파이크, LFP-LFP 및 스파이크-LFP 상관 관계를 측정하기 위한 일련의 간단한 그림을 제공합니다. 이 그림을 통해 초보자는 자유롭게 움직이는 마우스에서 기록된 신호를 빠르게 처리하고 분석할 수 있습니다. 또한 이 독점 소프트웨어로 처리된 결과 및 데이터는 사전에 추가 분석을 위해 Fieldtrip과 같은 오픈 소스 도구 상자와 함께 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립자연과학재단(31871170, 32170950, 31970915), 광둥성 자연과학재단(2021A1515010804 및 2023A1515010899), 광둥성 자연과학재단 주요 재배 프로젝트(2018B030336001), 광둥성 보조금: 뇌질환 치료를 위한 핵심 기술(2018B030332001)의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.54 mm pin header | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 1 x 5 | Applying for the movable micro-drive which can slide on its stulls. |
| Adobe Illustrator CC 2017 | Adobe | N/A | To optimize images from GraphPad. |
| BlackRock Microsystems | Blackrock Neurotech | Cerebus | This systems includes headsatge, DA convert, amplifier and computer. |
| Brass nut | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 brass nut | The nut fixes the position of screw. |
| Brass screw | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 x 11 mm brass screw | A screw that hold the movable micro-drive. |
| C57BL/6J | Guangdong Zhiyuan Biomedical Technology Co., LTD. | N/A | 12 weeks of age. |
| Centrifuge tube | Biosharp | 15 mL; BS-150-M | To store mice brain with sucrose sulutions. |
| Conducting paint | Structure Probe, Inc. | 7440-22-4 | To improve the lead-connecting quality between connector pins and Ni-wires. |
| Conductive copper foil tape | 3M | 1181 | To reduce interferenc. |
| Connector | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 2 x 10P | To connect the headtage to micro-drive system. |
| DC Power supply | Maisheng | MS-305D | A power device for electrolytic lesion. |
| Dental cement | Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. | N/A | To fix the electrode arrays on mouse's skull after finishing the implantation. |
| Digital analog converter | Blackrock | 128-Channel | A device that converts digital data into analog signals. |
| Epoxy resin | Alteco | N/A | To cover pins. |
| Excel | Microsoft | N/A | To summarize data after analysis. |
| Eye scissors | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or cutting the Ni-chrome wire. |
| Fine forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery. |
| Forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or assembling the mirco-drive system. |
| Freezing microtome | Leica | CM3050 S | Cut the mouse’s brain into slices |
| Fused silica capillary tubing | Zhengzhou INNOSEP Scientific Co., Ltd. | TSP050125 | To serve as the guide tubes for Ni-chrome wires. |
| Glass microelectrode | Sutter Instrument Company | BF100-50-10 | To mark the desired locations for implantation using the filled ink. |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad Software | N/A | To analyze and visualize the results. |
| Guide-tube | Polymicro technologies | 1068150020 | To load Ni-chrome wires. |
| Headstage | Blackrock | N/A | A tool of transmitting signals. |
| Helium balloon | Yili Festive products Co., Ltd. | 24 inch | To offset the weight of headstage and micro-drive system. |
| Ink | Sailor Pen Co.,LTD. | 13-2001 | To mark the desired locations for implantation. |
| Iodine tincture | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To disinfect mouse's scalp. |
| Lincomycin in Hydrochloride and Lidocaine hydrochloride gel | Hubei kangzheng pharmaceutical co., ltd. | 10g | A drug used to reduce inflammation. |
| Meloxicam | Vicki Biotechnology Co., Ltd. | 71125-38-7 | To reduce postoperative pain in mice. |
| Micromanipulators | Scientifica | Scientifica IVM Triple | For electrode arrays implantation. |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni-E | Capture the images of brain sections |
| nanoZ impedance tester | Plexon | nanoZ | To measure impedance or performing electrode impedance spectroscopy (EIS) for multichannel microelectrode arrays. |
| NeuroExplorer | Plexon | NeuroExplorer | A tool for analyzing the electrophysiological data. |
| NeuroExplorer | Plexon, USA | N/A | A software. |
| Ni-chrome wire | California Fine Wire Co. | M472490 | 35 μm Ni-chrome wire. |
| Offline Sorter | Plexon | Offline Sorter | A tool for sorting the recorded multi-units. |
| PCB board | Hangzhou Jiepei Information Technology Co., Ltd. | N/A | Computer designed board. |
| Pentobarbital | Sigma | P3761 | To anesthetize mice. |
| Pentobarbital sodium | Sigma | 57-33-0 | To anesthetize the mouse. |
| Peristaltic pump | Longer | BT100-1F | A device used for perfusion |
| Polyformaldehyde | Sangon Biotech | A500684-0500 | The main component of fixative solution for fixation of mouse brains |
| PtCl4 | Tianjin Jinbolan Fine Chemical Co., Ltd. | 13454-96-1 | Preparation for gold plating liquid. |
| Saline | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To clean the mouse's skull. |
| Silver wire | Suzhou Xinye Electronics Co., Ltd. | 2 mm diameter | Applying for ground and reference electrodes. |
| Skull drill | RWD Life Science | 78001 | To drill carefully two small holes on mouse's skull. |
| Stainless steel screws | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | M0.8 x 2 | To protect the micro-drive system and link the ground and reference electrodes. |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 68513 | To perform the stereotaxic coordinates of bilateral motor cortex. |
| Sucrose | Damao | 57-50-1 | To dehydrate the mouse brains after perfusion. |
| Super glue | Henkel AG & Co. | PSK5C | To fix the guide tube and Ni-chrome wire. |
| Temperature controller | Harvard Apparatus | TCAT-2 | To maintain mouse's rectal temperature at 37°C |
| Tetracycline eye ointment | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To protect the mouse's eyes during surgery. |
| Thread | Rapala | N/A | To link ballon and headstage. |
| Vaseline | Unilever plc | N/A | To cover the gap between electrode arrays and mouse's skull. |
References
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