Summary
Het protocol beschrijft de methodologie van extracellulaire opname in de motorische cortex (MC) om extracellulaire elektrofysiologische eigenschappen te onthullen bij vrij bewegende bewuste muizen, evenals de gegevensanalyse van lokale veldpotentialen (LFP's) en spikes, wat nuttig is voor het evalueren van de neurale activiteit van het netwerk die ten grondslag ligt aan interessant gedrag.
Abstract
Het protocol heeft tot doel de eigenschappen van neuronaal vuren en netwerk lokale veldpotentialen (LFP's) bloot te leggen bij zich gedragende muizen die specifieke taken uitvoeren door de elektrofysiologische signalen te correleren met spontaan en/of specifiek gedrag. Deze techniek is een waardevol hulpmiddel bij het bestuderen van de neuronale netwerkactiviteit die ten grondslag ligt aan dit gedrag. Het artikel biedt een gedetailleerde en volledige procedure voor elektrode-implantatie en de daaruit voortvloeiende extracellulaire opname bij vrij bewegende bewuste muizen. De studie omvat een gedetailleerde methode voor het implanteren van de micro-elektrode-arrays, het vastleggen van de LFP- en neuronale spiking-signalen in de motorische cortex (MC) met behulp van een meerkanaalssysteem, en de daaropvolgende offline gegevensanalyse. Het voordeel van meerkanaalsregistratie bij bewuste dieren is dat een groter aantal spiking neuronen en neuronale subtypes kan worden verkregen en vergeleken, wat de evaluatie van de relatie tussen een specifiek gedrag en de bijbehorende elektrofysiologische signalen mogelijk maakt. Met name de meerkanaals extracellulaire opnametechniek en de data-analyseprocedure die in de huidige studie worden beschreven, kunnen worden toegepast op andere hersengebieden bij het uitvoeren van experimenten bij zich gedragende muizen.
Introduction
Het lokale veldpotentiaal (LFP), een belangrijk onderdeel van extracellulaire signalen, weerspiegelt de synaptische activiteit van grote populaties neuronen, die de neurale code vormen voor meerdere gedragingen. Pieken gegenereerd door neuronale activiteit worden geacht bij te dragen aan de LFP en zijn belangrijk voor neurale codering2. Het is bewezen dat veranderingen in spikes en LFP's verschillende hersenziekten mediëren, zoals de ziekte van Alzheimer, evenals emoties zoals angst, enz.3,4. Het is vermeldenswaard dat veel onderzoeken hebben aangetoond dat de piekactiviteit aanzienlijk verschilt tussen wakkere en verdoofde toestanden bij dieren5. Hoewel opnames bij verdoofde dieren de mogelijkheid bieden om LFP's te beoordelen met minimale artefacten in sterk gedefinieerde corticale synchronisatietoestanden, verschillen de resultaten tot op zekere hoogte van wat kan worden gevonden bij wakkere proefpersonen 6,7,8. Het is dus zinvoller om neurale activiteit over lange tijdschalen en grote ruimtelijke schalen te detecteren bij verschillende ziekten in een wakkere hersentoestand met behulp van elektroden die in de hersenen zijn geïmplanteerd. Dit manuscript biedt informatie voor beginners over het maken van het micro-drive-systeem en het instellen van de parameters met behulp van gemeenschappelijke software voor het berekenen van de spike- en LFP-signalen op een snelle en eenvoudige manier om de opname en analyse te starten.
Hoewel de niet-invasieve registratie van hersenfuncties, zoals door gebruik te maken van elektro-encefalogrammen (EEG's) en gebeurtenisgerelateerde potentialen (ERP's) die van de hoofdhuid zijn geregistreerd, op grote schaal is gebruikt in studies bij mensen en knaagdieren, hebben EEG- en ERP-gegevens lage ruimtelijke en temporele eigenschappen en kunnen ze dus niet de precieze signalen detecteren die worden geproduceerd door nabijgelegen dendritische synaptische activiteit in een specifiekhersengebied1. Momenteel kan, door gebruik te maken van meerkanaalsopname bij bewuste dieren, neurale activiteit in de diepere lagen van de hersenen chronisch en progressief worden geregistreerd door een micro-drive-systeem in de hersenen van primaten of knaagdieren te implanteren tijdens meerdere gedragstests 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Kortom, onderzoekers kunnen een micro-aandrijfsysteem construeren dat kan worden gebruikt voor de onafhankelijke positionering van de elektroden of tetrodes om verschillende delen van de hersenen aan te pakken 10,11. Chang et al. beschreven bijvoorbeeld technieken om pieken en LFP's in muizen vast te leggen door een lichte en compacte micro-drive te assembleren12. Bovendien zijn microbewerkte siliciumsondes met op maat gemaakte accessoirecomponenten in de handel verkrijgbaar voor het opnemen van meerdere afzonderlijke neuronen en LFP's bij knaagdieren tijdens gedragstaken13. Hoewel er verschillende ontwerpen zijn gebruikt voor het assembleren van micro-aandrijfsystemen, hebben deze nog steeds beperkt succes in termen van de complexiteit en het gewicht van het hele micro-aandrijfsysteem. Lansink et al. toonden bijvoorbeeld een meerkanaals micro-aandrijfsysteem met een complexe structuur voor opname uit een enkel hersengebied14. Sato et al. rapporteerden een meerkanaals micro-aandrijfsysteem met een automatische hydraulische positioneringsfunctie15. De belangrijkste nadelen van deze micro-aandrijfsystemen zijn dat ze te zwaar zijn voor muizen om vrij te bewegen en moeilijk te monteren zijn voor beginners. Hoewel is aangetoond dat meerkanaals extracellulaire opname een geschikte en efficiënte technologie is voor het meten van neurale activiteit tijdens gedragstests, is het voor beginners niet eenvoudig om de signalen die door het complexe micro-aandrijfsysteem worden verkregen, vast te leggen en te analyseren. Gezien het feit dat het moeilijk is om het hele werkingsproces van de meerkanaals extracellulaire opname en data-analyse op gang te brengen in vrij bewegende muizen16,17, presenteert dit artikel vereenvoudigde richtlijnen om het gedetailleerde proces van het maken van het micro-aandrijfsysteem te introduceren met behulp van algemeen beschikbare componenten en instellingen; de parameters in de gemeenschappelijke software voor het berekenen van de spike- en LFP-signalen op een snelle en eenvoudige manier worden ook verstrekt. Bovendien kan de muis in dit protocol vrij bewegen door het gebruik van een heliumballon, wat bijdraagt aan het compenseren van het gewicht van de hoofdstage en het micro-aandrijfsysteem. Over het algemeen beschrijven we in de huidige studie hoe we eenvoudig een micro-aandrijfsysteem kunnen bouwen en de processen van registratie en data-analyse kunnen optimaliseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle muizen werden commercieel verkregen en onderhouden in een 12 uur licht/12 uur donkere cyclus (licht aan om 08:00 uur lokale tijd) bij een kamertemperatuur van 22-25 °C en een relatieve vochtigheid van 50%-60%. De muizen hadden toegang tot een continue toevoer van voedsel en water. Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor verzorging en gebruik van proefdieren van de South China Normal University en goedgekeurd door de Institutional Animal Ethics Committee. Mannelijke C57BL/6J-muizen van 3-5 maanden oud werden gebruikt voor de experimenten.
1. Assemblage van het micro-aandrijfsysteem
- Verbind twee door de computer ontworpen printplaten met behulp van twee stulls en een schroef die de beweegbare microdrive vasthoudt en bevestig de connector aan één printplaat (Figuur 1A, Bi-iii). Drijf de microdrive aan door een schroef (0.5 mm/cirkel) te draaien.
- Zorg ervoor dat de microaandrijving twee sets van acht geleidebuizen (~3 cm lang, ~50 μm binnendiameter, ~125 μm buitendiameter) voor elke kant van het MC-gebied kan dragen en snijd deze vervolgens op dezelfde lengte (minimaal 15 mm; Figuur 1Biv, v).
- Knip 16 Ni-chroomdraden (~5 cm lang) met een diameter van 35 μm af en laad ze achtereenvolgens in de geleidebuizen, gevolgd door het aanbrengen van lijm om ze te bevestigen (Figuur 1Bi, vi, vii).
- Strip de draadisolatie, bind achtereenvolgens elke blootliggende draad aan elke pin van de connector volgens de kanaalkaart, evenals de referentie- en aardelektroden, en breng vervolgens langzaam geleidende verf aan op elke pin (Figuur 1Bviii-x).
- Bedek de pinnen met epoxyhars (Figuur 1Axi, xii) en voer vervolgens vergulding uit via een impedantietester om de impedantie van de elektrodepunten te verlagen tot ~350 kOhm (Figuur 1Bxiii, xiv). Stel de parameters van de impedantietester als volgt in: −10,08 μA gelijkstroom gedurende 1 s met verguldoplossing, inclusief 5 mM PtCl4.
- Verplaats ten slotte de microdrive naar boven door aan een schroef te draaien. Controleer de totale grootte van het micro-aandrijfsysteem dat is aangepast zoals weergegeven in afbeelding 1A (ongeveer 15 mm lang, 10 mm breed, 20 mm hoog, ~1 g gewicht). Controleer de gedetailleerde specificaties van het door de computer ontworpen bord en het beweegbare onderdeel in figuur 1Ai, ii.
2. Implantatie van elektrode-array
- Steriliseer de operatiekits, draag steriele handschoenen en trek de steriele witte jas van een arts aan voordat de operatie begint.
- Om de pijn onder controle te houden, gebruikt u subcutane (s.c.) injectie van meloxicam injecteerbaar (5 mg/kg) voor de muis in een inductiekamer. Verdoof de muis vervolgens door een intraperitoneale (i.p.) injectie van pentobarbital (80 mg/kg) in een inductiekamer18,19. Breng een aanvullende dosis pentobarbital (20 mg/kg/uur) aan als de teenknijpreflex nog steeds aanwezig is.
- Bevestig de muis in een stereotaxisch apparaat en houd de rectale temperatuur op 37 °C met behulp van een temperatuurregelaar.
- Breng tetracycline-oogzalf aan op beide ogen van de muis en vervang de steriele handschoenen opnieuw voor de operatie.
- Scheer de vacht van de muis en desinfecteer de operatieplaats met drie afwisselende rondes betadinescrub en alcohol met behulp van een steriele applicator met wattenstaafje in concentrische cirkels, beginnend in het midden en naar buiten bewegend (Figuur 2i, ii). Maak een kleine incisie in de middellijn (~15 mm) om de schedel bloot te leggen. Breng de 1% lidocaïne onmiddellijk lokaal aan op de nekspieren voor pijnverlichting. Verwijder vervolgens het resterende weefsel met een schaar en reinig de schedel met wattenstaafjes met zoutoplossing (Figuur 2iii).
- Markeer met behulp van een glazen micro-elektrode gevuld met inkt de gewenste locaties van het bilaterale MC voor implantatie (Figuur 2iv, v). Op basis van een eerdere studie 20 zijn de locaties van het bilaterale MC als volgt: 0,74 mm anterieur van het bregma en1,25 mm lateraal van de middellijn.
- Implanteer vier roestvrijstalen schroeven (0.8 mm diameter) om het micro-aandrijfsysteem te beschermen en verbind vervolgens alle schroeven met de referentie- en aardelektroden, gevolgd door afdekking met gemengd tandheelkundig cement om muren te vormen (Figuur 2vi-xi).
- Boor voorzichtig twee kleine gaatjes (~1,5mm2) met een schedelboor aan zowel de linker- als de rechterkant van de gecoördineerde schedel in de MC-gebieden (Figuur 2xii). Gebruik de stereotaxische coördinaten van het bilaterale MC: 0,74 mm anterieur van het bregma, 1,25 mm lateraal van de middellijn en 0,5 mm ventrale ten opzichte van de dura.
- Verwijder de dura mater voorzichtig uit de gaten met een fijne pincet (Figuur 2xiii).
- Steek het micro-aandrijfsysteem in het midden van de gaten met behulp van een micromanipulator met een snelheid van 10 μm/s (Figuur 2xiv-xvii).
- Vul de vaseline in de wanden van tandcement nadat u klaar bent met het inbrengen van het micro-aandrijfsysteem (Figuur 2xviii).
- Verbind de bodemplaat van het micro-aandrijfsysteem en de tandheelkundig cementwanden met het gemengde tandheelkundig cement (Figuur 2xix)
- Was de incisie met zoutoplossing, gevolgd door een lokale behandeling met een gel die lincomycinehydrochloride en lidocaïnehydrochloride bevat om postoperatieve pijn te verlichten.
- Wikkel de geleidende koperfolietape om het geïmplanteerde micro-aandrijfsysteem (Figuur 2xx).
- Verplaats de muis naar een kooi die op 31-33 °C wordt gehouden en controleer de muis op herstel van de anesthesie.
- Laat de muizen 1 week herstellen met aparte voeding. Controleer en behandel de incisie met 3 dagen continu aanbrengen van een gel die lincomycinehydrochloride en lidocaïnehydrochloride bevat.
3. Meerkanaals opname in de bilaterale MC in vrij bewegende muizen
- Houd de kop van een wakkere muis lichtjes en voorzichtig vast. Beweeg de elektrode-arrays (~0.1 mm diepte) naar beneden door de schroef op het beweegbare deel van het micro-aandrijfsysteem (Figuur 1Aii) ten minste 1 dag van tevoren te draaien.
- Houd de kop van de wakkere muis lichtjes en voorzichtig vast. Verbind het midden van de headstage en een heliumballon (gevuld met ongeveer 0,02 L helium) met een schroefdraad om het gewicht van de headstage en het micro-aandrijfsysteem te compenseren (Figuur 3A, B).
- Vang ruwe signalen op met behulp van de opname-elektroden en meerkanaalssystemen door bemonstering bij 30 kHz in de opnamesoftware en digitaliseer vervolgens met behulp van een digitaal-analoog (DA) converter van de meerkanaalssystemen.
- Extraheer de LFP-signalen uit de onbewerkte gegevens door opnieuw te samplen bij 10 kHz in de opnamesoftware en gebruik vervolgens een notchfilter van de opnamesoftware om de 50 Hz-lijnruis te verwijderen.
- Neem onbewerkte gegevens op in een stabiele toestand van een vrij bewegende muis gedurende ten minste 60 s. Nadat u klaar bent met opnemen, verwijdert u langzaam de verbinding tussen de headstage en het microdrive-systeem en plaatst u de muis terug in zijn thuiskooi.
- Sla de opgenomen gegevens op in de computer en analyseer deze offline (Afbeelding 4 en Afbeelding 5).
- Voer na het beëindigen van het experiment euthanasie uit volgens de richtlijnen van het instituut en bevestig vervolgens de locaties van de elektroden door de voeding te gebruiken bij een uitgang van 3 V om een elektrolytische laesie van 1 minuut uit te voeren, gevolgd door het uitvoeren van histologische analyse. Snijd de hersenen van de muis in plakjes van 30 μm met behulp van een bevriezingsmicrotoom, verzamel de MC-secties en leg de beelden vervolgens vast met een microscoop (Figuur 3C, D).
4. Spike sorteren en analyseren
- Klik op Bestand > Open > Nev-bestanden in de spike-sorteersoftware om de spike-gegevens te openen die zijn bemonsterd bij 30 kHz (Figuur 4Ai).
- Klik op Info om het ongesorteerde kanaal te selecteren en selecteer vervolgens Sorteren > Sorteermethode wijzigen > K-Means gebruiken. Druk op de knop Valley-Seeking Sort > K-Means Sorting om de gesorteerde eenheden te verkrijgen (Figuur 4Aii, iii).
- Klik op Bestand > Opslaan als, sla de gesorteerde spikegegevens op met de extensie .nev en selecteer Bestand > Exporteer Per-golfvormgegevens om de PCA-resultaten te exporteren met een .txt bestandsnaamextensie (Figuur 4Aiv).
- Klik op Bestand > Gegevens importeren > Blackrock-bestand in de software voor de neurofysiologische gegevensanalyse om het gesorteerde spikebestand te openen (Figuur 4Bi).
- Klik op Analyse > autocorrelogrammen om het autocorrelogram voor de geselecteerde eenheid te verkrijgen en stel vervolgens de parameters als volgt in: de X Minimumwaarde op −0,05 s, de X Maximumwaarde op 0,05 s en de Bin-waarde op 0,001 (Figuur 4Bii, iii).
- Laad de gesorteerde piekgegevens, klik op Analyse > Interspike-intervalhistogrammen om het inter-spike-intervalhistogram te verkrijgen en stel vervolgens de parameters als volgt in: de Min. intervalwaarde op 0 s, de Max. intervalwaarde op 0.1 s en de Bin-waarde op 0.001 (Figuur 4Biv, v).
- Klik op Analyse > Crosscorrelogrammen om het kruiscorrelogram tussen twee gesorteerde eenheidsgebeurtenissen te verkrijgen en stel vervolgens de referentiegebeurtenissen en parameters als volgt in: de X Minimumwaarde op −0,1 s, de X Maximumwaarde op 0,1 s en de Bin-waarde op 0,001 (Figuur 4Bvi, vii).
- Klik op Resultaten > Numerieke resultaten om de resultaten van het autocorrelogram, het inter-spike-intervalhistogram en het kruiscorrelogram met .xls bestandsnaamextensies op te slaan (Figuur 4Bviii, ix). Analyseer de gegevens en teken de grafiek.
5. LFP-analyse
- Klik op File Import Data > Blackrock File in de software voor de neurofysiologische data-analyse om de continue signaalgegevens te openen die zijn bemonsterd bij 10 kHz (Figuur 5Ai).
- Klik op Analyse > Spectrum voor continu om het vermogensspectrum voor de LFP van het geselecteerde kanaal te analyseren. Stel de parameters als volgt in: het aantal frequentiewaarden op 8,192, de waarde van de meervoudige conus op 3-5, de normalisatie van het percentage van de totale spectrale vermogensdichtheid (PSD) en het frequentiebereik van 1 Hz tot 100 Hz (Figuur 5Aii, iii).
- Klik op Analyse > Coherentie voor Continu om de coherentie voor twee LFP's van de linker- en rechterkant van het MC te analyseren. Stel het referentiekanaal en de parameters als volgt in: Bereken bij coherentiewaarden het aantal frequentiewaarden op 8,192, de waarde van de meervoudige conussen op 3-5 en het frequentiebereik van 1 Hz tot 100 Hz (Figuur 5Aiv, v).
- Klik op Analyse > Corr. met vervolgvariabelen om de correlatie tussen twee LFP's aan de linker- en rechterkant van het MC te analyseren. Stel het referentiekanaal (LFP-gegevens) en de parameters als volgt in: de X Minimumwaarde op −0,1 s, de X Maximumwaarde op 0,1 s en de Bin-waarde op 0,001 (Figuur 5Avi, vii).
- Klik op Resultaten > Numerieke resultaten om de resultaten van de PSD, samenhang en correlatie met een .xls bestandsnaamextensie op te slaan (Figuur 5Aviii, ix).
- Selecteer het kanaal waarvoor de representatieve sporen voor elke frequentieband moeten worden geëxtraheerd, klik op Edit > Digital Filtering of Continuous Variables om elke frequentieband te verkrijgen en stel vervolgens de parameters als volgt in: de Filter Freq. Response als Bandpass, de Filter Implementation at infinite impulse response (IIR) Butterworth, en de Filter Order value op 2. Stel ten slotte het frequentiebereik in dat van belang is (Figuur 5Bi-iv).
OPMERKING: De frequentiebereiken die hier werden gebruikt, waren als volgt: delta (δ, 1-4 Hz), theta (θ, 5-12 Hz), bèta (β, 13-30 Hz), laag gamma (laag γ, 30-70 Hz) en hoog gamma (hoog γ, 70-100 Hz) oscillaties. - Analyseer de gegevens en teken de grafiek.
6. Correlaties tussen de piek en LFP
- Klik op Bestand > Gegevens importeren > Blackrock-bestand in de software voor de neurofysiologische gegevensanalyseom de continue signaalgegevens en piekgegevens te openen.
- Klik op Analyse > Coherentieanalyse om de samenhang tussen de pieken en LFP van het geselecteerde kanaal te analyseren. Stel de referentievariabele (spike timing) en parameters als volgt in: Bereken bij coherentiewaarden het aantal frequentiewaarden op 512, de waarde van de meervoudige conussen op 3-5 en het frequentiebereik van 1 Hz tot 100 Hz (Figuur 5Ci, ii).
- Klik op Resultaten > Numerieke resultaten om het resultaat van de piekveldcoherentie op te slaan met een .xls bestandsnaamextensie (Figuur 5Ciii, iv).
- Analyseer de gegevens en teken de grafiek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een hoogdoorlaatfilter (250 Hz) werd toegepast om de pieken met meerdere eenheden uit de ruwe signalen te extraheren (Figuur 6A). Verder werden de geregistreerde eenheden van het MC van een normale muis gesorteerd op PCA geverifieerd (Figuur 7A-D), en werden de valleibreedte en golfvormduur van de eenheden in het MC van de muis geregistreerd. De resultaten toonden aan dat zowel de valleibreedte als de golfvormduur van de MC vermeende piramidale neuronen (Pyn) bij muizen hoger zijn dan die van de vermeende interneuronen (IN) (Figuur 7E,F; twee steekproeven van Mann-Whitney-test; voor valleibreedte, verondersteld Pyn: 0,636 ms ± 0,004 ms, verondersteld IN: 0,614 ms ± 0,001 ms, p = 0,002; voor golfvormduur, verondersteld Pyn: 0,095 ms ± 0,004 ms, veronderstelde IN: 0,054 ms ± 0,002 ms, p = 1,402 x 10−16), overeenkomend met de kenmerken van Pyn en IN in eerdere studies21. We berekenden ook het kruiscorrelogram tussen vermeende Pyn en IN door de vermeende Pyn-pieken als referentie in te stellen en vonden een positieve piek op ~18 ms (Figuur 7G), wat aangeeft dat de vermeende Pyn-piek plaatsvindt voorafgaand aan de vermeende IN-piek met een venster van ~18 ms.
Representatieve sporen van elke frequentieband werden uit de LFP gefilterd door het IIR-filter in de software voor de neurofysiologische gegevensanalyse (Figuur 6A). In de LFP-analyse waren de LFP's van de linker en rechter MC in normale muizen vergelijkbaar in het vermogensspectrum, wat wijst op gesynchroniseerde activiteiten tussen de linker en rechter MC (Figuur 8A,B; twee voorbeelden van Mann-Whitney-test; voor δ, linker MC: 50,71 ± 1,136, rechter MC: 50,47 ± 1,213, p = 0,70; voor θ, linker MC: 2,197 ± 0,187, rechter MC: 2,068 ± 0,193, p = 0,40; voor β, links MC: 0,222 ± 0,058, rechts MC: 0,206 ± 0,055, p = 0,70; voor lage γ, links MC: 0,114 ± 0,034, rechts MC: 0,093 ± 0,018, p = 0,70; voor hoge γ, links MC: 0,054 ± 0,027, rechts MC: 0,04 ± 0,015, p = 0,40). Vervolgens berekenden we de coherentie en correlatie tussen de linker en rechter MC (Figuur 8C,D; de linker MC LFP volgt binnen een venster van ~1,2 ms na de rechter MC LFP, -1,167 ms ± 0,667 ms) en berekenden de grootte van de vermeende Pyn of IN spiking gesynchroniseerd met de LFP (1-100 Hz) in de linker MC van een normale muis (Figuur 8E). Dit toonde een sterkere lage γ coherentie voor de vermeende IN in vergelijking met de Pyn.
Figuur 1: Schema van de elektroden en het meerkanaals opnamesysteem. (A) Illustratie van het micro-aandrijfsysteem. Ik. Tekening en specificatie van het door de computer ontworpen bord. ii. Schematisch diagram van de beweegbare microaandrijving. (B) Micro-aandrijfsysteem en meerkanaals beweegbare stappen met één elektrode. Ik. De Ni-chroom draden; ii. de samenstellende delen van de elektrode; iii. Assemblage van de door de computer ontworpen borden; iv. Voorlopige montage van de elektroden, inclusief de connectoren en acht geleidebuizen; v. De andere kant van de micro-drive; vi,vii. De Ni-chroomdraden worden achtereenvolgens in de geleidebuizen geladen; VIII-X. Elke blootliggende draad wordt achtereenvolgens aan elke pin gevlochten, gevolgd door een coating die verf op elke pin geleidt; xi,xii. De pinnen zijn bedekt met epoxyhars; XIII,XIV. Vergulden. (C) Experimenteel ontwerp van de extracellulaire opname in het MC van een vrij bewegende muis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Stap-voor-stap chirurgische ingreep. i,ii. Scheer de vacht van de muis en desinfecteer de operatieplaats met drie afwisselende rondes betadinescrub en alcohol. iii. Maak de schedel van de muis schoon. iv. Nivellering. v. Markeer de locatie van de hersenen. vi. Markeer de posities van roestvrijstalen schroeven. vii. Plaats roestvrijstalen schroeven. viii. Verbind de schroeven met de referentie- en aardelektroden. ix,x. Meng het tandheelkundig cement. xi. Bouw een muur met tandheelkundig cement. xii,xiii. Boor twee kleine gaatjes boven het bilaterale MC, gevolgd door het verwijderen van de dura mater. xiv. Bereid het micro-aandrijfsysteem voor. XV-XIX. Implanteer het micro-aandrijfsysteem, gevolgd door een lokale behandeling met een gel die lincomycinehydrochloride en lidocaïnehydrochloride bevat om postoperatieve pijn te verlichten. xx. Bescherm het micro-aandrijfsysteem met geleidende koperfolietape. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Illustratie van een opname met het hoofd vast in een bewuste muis. (A) Schematisch diagram voor vrij bewegende opnamen. (B) Details van de beelden van de vrij bewegende opname. Ik. Planvorm van het geïmplanteerde micro-aandrijfsysteem; ii. Hoofdstage; III,IV. Het micro-aandrijfsysteem en de hoofdtrap zijn met elkaar verbonden; v. De heliumballon wordt aangebracht om het gewicht van de headstage en het micro-aandrijfsysteem te compenseren. (C) Illustratie van het verifiëren van de locatie van de registratieplaats met behulp van een elektrolytische laesie. (D) De registratieplaatsen die zijn gelabeld door elektrolytische laesies in het MC van een muis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Illustratie van het sorteren en analyseren van pieken. (A) De parameters voor het clusteren van de piekgegevens en het exporteren van de resultaten. Ik. Importeer de spike-gegevens; ii. Kies de sorteermethode; iii. Sorteer de piekgegevens met behulp van het κ-gemiddelde-algoritme; iv. Exporteer de resultaten van de gesorteerde eenheid. (B) Het proces voor het analyseren van het histogram tussen het piekinterval, het autocorrelogram en het kruiscorrelogram van de gesorteerde eenheid. Ik. Importeer de gesorteerde piekgegevens; ii. Voer de autocorrelatieanalyse uit; iii. Stel de parameters voor het autocorrelogram in; iv. Verkrijg het histogram tussen het piekinterval; v. Stel de parameters in voor het histogram tussen het piekinterval; vi. Bereken de kruiscorrelatie tussen de pieken van de gesorteerde eenheden; vii. Stel de parameters voor het cross-correlogram in; VIII,IX. Exporteer de resultaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Illustratie van continue data-analyse. (A) Het proces en de parameters voor het analyseren van de LFP-signalen die zijn berekend met behulp van het vermogensspectrum van de LFP's, coherentie en correlatie tussen twee LFP's. i. Importeer de LFP-gegevens; ii. Bereken de spectrale vermogensdichtheid voor de LFP's op basis van de bilaterale MC; Aiii. Bereken de spectrale vermogensdichtheid voor de LFP; iv,v. Bereken de samenhang tussen LFP's; vi,vii. Bereken de correlatie tussen twee LFP's. viii,ix. Exporteer de resultaten. (B) Het proces voor het filteren van elk frequentiebereik van het LFP-signaal. i. de verschillende frequentiebanden uit de LFP-gegevens te extraheren; II,III. Bekijk de gefilterde LFP's; iv. Sla de gefilterde LFP's op als een verbeterd metabestand. (C) Het proces voor het analyseren van de samenhang tussen de neuronale spikes en LFP. i,ii. Bereken de samenhang tussen de LFP en gesorteerde spikes; III,IV. Exporteer de resultaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Representatieve sporen van opgenomen signalen. De piek werd hoogdoorlaatgefilterd bij 250 Hz van de ruwe gegevens die bij 30 kHz werden bemonsterd. De LFP waren de ruwe gegevens die bij 10 kHz werden bemonsterd. δ was de delta-frequentieband bandpass-gefilterd op 1-4 Hz van de LFP. θ was de theta-frequentieband gefilterd op 5-12 Hz van de LFP. β was de bèta-frequentieband gefilterd op 13-30 Hz van de LFP. Lage γ was de lage gammafrequentieband gefilterd op 30-70 Hz van de LFP. High γ was de hoge gammafrequentieband gefilterd op 70-100 Hz van de LFP. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Kenmerken van de gesorteerde eenheden en hun ontstekingspatroon. (A,B) De gesorteerde eenheden werden geclusterd met behulp van hoofdcomponentenanalyse (PCA) van dezelfde elektrode. (C,D) Autocorrelaties (boven) en inter-spike interval histogrammen (onder) voor een vermeend excitatoir neuron (Pyn) en een vermeend remmend neuron (IN). (E) De valleibreedte van de vermeende Pyn was significant hoger dan die van de vermeende IN (putatief Pyn: n = 1.055 spikes, putatief IN: n = 1.985 spikes). (F) De golfvormduur van de vermeende Pyn was sterker dan die van de vermeende IN (vermeende Pyn: n = 1.005 pieken, vermeende IN: n = 1.059 pieken). (G) De kruiscorrelatie tussen de vermeende Pyn en IN. Statistische analyse met een Mann-Whitney-test. Alle gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Analyse van twee LFP's van het bilaterale MC en de samenhang tussen spike events en het LFP bij muizen. (A,B) Genormaliseerde vermogensspectrums van het bilaterale MC op elke frequentieband bij muizen (n = 3). (C) De curve van de coherentie van twee LFP's tussen het linker en rechter MC (n = 3). (D) De kruiscorrelatiecurve van twee LFP's die een correlatie laat zien tussen het linker en rechter MC bij een vertraging van ±100 ms (n = 3). (E) De curve van de coherentie van het spike-veld in het MC van een muis. Statistische analyse met een Mann-Whitney-test. Alle gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Meerkanaals opname bij vrij bewegende muizen wordt beschouwd als een nuttige technologie in neurowetenschappelijke studies, maar het is nog steeds een hele uitdaging voor beginners om de signalen op te nemen en te analyseren. In de huidige studie bieden we vereenvoudigde richtlijnen voor het maken van micro-aandrijfsystemen en het uitvoeren van elektrode-implantatie, evenals vereenvoudigde procedures voor het vastleggen en analyseren van de elektrische signalen via spike-sorteersoftware en software voor neurofysiologische gegevensanalyse.
Aangezien de kwaliteit van een op maat gemaakt micro-aandrijfsysteem in hoge mate bijdraagt aan het verkrijgen van stabiele en kwalitatieve signalen in vrij bewegende muizen14,15,16,17, hebben we in deze studie een stevigere en lichtere structuur voor het micro-aandrijfsysteem ontworpen en gebruikt, en beginners kunnen gemakkelijk en duidelijk de productiestappen voor het bouwen van het micro-aandrijfsysteem volgen. Bovendien omvat de structuur van het ontworpen micro-aandrijfsysteem goedkope materialen die gemakkelijk verkrijgbaar zijn in bouwmarkten, in tegenstelling tot de grotere, zwaardere micro-aandrijfsystemen die in eerdere studies werden gebruikt14,15. Dit micro-aandrijfsysteem kan ongemak verminderen en bestand zijn tegen de impact van vrij bewegende muizen tijdens opnames. Ondertussen hebben we de grootte en vorm van het micro-aandrijfsysteem verder verbeterd, wat nuttig kan zijn voor beginners door hen in staat te stellen de uiteinden van elektroden tijdens de operatie te observeren, in te brengen en zo in de hersenen te verplaatsen. Verder wordt de eenvoudige schuifstructuur die in het micro-aandrijfsysteem wordt toegepast, nauwkeurig in de hersenen gevorderd met behulp van een zeer nauwkeurige schroef, wat betekent dat dit systeem nauwkeurige controle biedt bij het meten van meerdere lagen van het beoogde hersengebied; Dit is inderdaad uiterst belangrijk voor het opvangen van extracellulaire signalen in een vrij bewegend dier gedurende een langdurige experimentele periode. Bovenal zijn de voordelen van dit micro-aandrijfsysteem de eenvoud en flexibiliteit; Het kleinere aantal kanalen en het gebruik van een reeks afzonderlijke elektroden moet echter verder worden verbeterd in een nieuwe versie.
Er zijn ook verschillende verbeteringen in de huidige studie die het vermelden waard zijn. Door het kleinere formaat en de gewijzigde vorm van het micro-aandrijfsysteem in vergelijking met eerdere systemen, werd een bredere visie en een grotere werkruimte voor de operatie geleverd. Bovendien waren de wanden op de schedel van de muis gemaakt van tandheelkundig cement en roestvrijstalen schroeven, waardoor het micro-aandrijfsysteem stevig aan de kop van de muis kon worden bevestigd. Bovendien zorgden de tandcementwanden ervoor dat vaseline kon worden geladen om de gaten in de schedel van de muis te bedekken voordat het tandcement werd gegoten, wat beschermende effecten had op het hersenoppervlak zonder de dura en het beweegbare deel van het micro-aandrijfsysteem. Samen zijn deze verbeteringen nuttig, omdat ze beginners in staat stellen het micro-drive-systeem gemakkelijk en zelfverzekerd in de muizenhersenen te implanteren.
Bij meerkanaals extracellulaire opnames wordt algemeen aangenomen dat een andere moeilijkheid ligt in het analyseren van de opgenomen signalen met behulp van een wiskundig complexe programmeertaal17. Daarom bieden we duidelijke richtlijnen voor beginners, met name op het gebied van spike-sortering, LFP-gegevensanalyse en het berekenen van de relatie daartussen met behulp van veelgebruikte software in de elektrofysiologie. Bovendien raden we sterk aan dat de geregistreerde eenheid van een enkelvoudige elektrodetest geclusterd door PCA-methoden een groot aantal kenmerken voor analyse moet hebben, zoals de gesorteerde neuronale intervallen tussen pieken en de breedte tussen de vallei en de piek, aangezien deze waarden nuttig zijn voor beginners om vertekening te verminderen wanneer de eenheden automatisch worden geclusterd met offline sorteersoftware. Belangrijk is dat de relatie tussen signalen met pieken en de LFP van cruciaal belang is voor het bemiddelen van meerdere gedragingen. We bieden ook een reeks eenvoudige illustraties voor het meten van spike-spike-, LFP-LFP- en spike-LFP-correlaties met behulp van geloofwaardige scripts in de software voor neurofysiologische gegevensanalyse; Met deze illustraties kunnen beginners snel beginnen met het verwerken en analyseren van de opgenomen signalen in vrij bewegende muizen. Verder kunnen de resultaten en gegevens die met deze eigen software worden verwerkt, worden gebruikt in combinatie met een open-source toolbox zoals Fieldtrip voor aanvullende analyse vooraf.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (31871170, 32170950 en 31970915), de Natural Science Foundation van de provincie Guangdong (2021A1515010804 en 2023A1515010899), de Guangdong Natural Science Foundation for Major Cultivation Project (2018B030336001) en de Guangdong Grant: Key Technologies for Treatment of Brain Disorders (2018B030332001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.54 mm pin header | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 1 x 5 | Applying for the movable micro-drive which can slide on its stulls. |
| Adobe Illustrator CC 2017 | Adobe | N/A | To optimize images from GraphPad. |
| BlackRock Microsystems | Blackrock Neurotech | Cerebus | This systems includes headsatge, DA convert, amplifier and computer. |
| Brass nut | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 brass nut | The nut fixes the position of screw. |
| Brass screw | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 x 11 mm brass screw | A screw that hold the movable micro-drive. |
| C57BL/6J | Guangdong Zhiyuan Biomedical Technology Co., LTD. | N/A | 12 weeks of age. |
| Centrifuge tube | Biosharp | 15 mL; BS-150-M | To store mice brain with sucrose sulutions. |
| Conducting paint | Structure Probe, Inc. | 7440-22-4 | To improve the lead-connecting quality between connector pins and Ni-wires. |
| Conductive copper foil tape | 3M | 1181 | To reduce interferenc. |
| Connector | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 2 x 10P | To connect the headtage to micro-drive system. |
| DC Power supply | Maisheng | MS-305D | A power device for electrolytic lesion. |
| Dental cement | Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. | N/A | To fix the electrode arrays on mouse's skull after finishing the implantation. |
| Digital analog converter | Blackrock | 128-Channel | A device that converts digital data into analog signals. |
| Epoxy resin | Alteco | N/A | To cover pins. |
| Excel | Microsoft | N/A | To summarize data after analysis. |
| Eye scissors | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or cutting the Ni-chrome wire. |
| Fine forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery. |
| Forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or assembling the mirco-drive system. |
| Freezing microtome | Leica | CM3050 S | Cut the mouse’s brain into slices |
| Fused silica capillary tubing | Zhengzhou INNOSEP Scientific Co., Ltd. | TSP050125 | To serve as the guide tubes for Ni-chrome wires. |
| Glass microelectrode | Sutter Instrument Company | BF100-50-10 | To mark the desired locations for implantation using the filled ink. |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad Software | N/A | To analyze and visualize the results. |
| Guide-tube | Polymicro technologies | 1068150020 | To load Ni-chrome wires. |
| Headstage | Blackrock | N/A | A tool of transmitting signals. |
| Helium balloon | Yili Festive products Co., Ltd. | 24 inch | To offset the weight of headstage and micro-drive system. |
| Ink | Sailor Pen Co.,LTD. | 13-2001 | To mark the desired locations for implantation. |
| Iodine tincture | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To disinfect mouse's scalp. |
| Lincomycin in Hydrochloride and Lidocaine hydrochloride gel | Hubei kangzheng pharmaceutical co., ltd. | 10g | A drug used to reduce inflammation. |
| Meloxicam | Vicki Biotechnology Co., Ltd. | 71125-38-7 | To reduce postoperative pain in mice. |
| Micromanipulators | Scientifica | Scientifica IVM Triple | For electrode arrays implantation. |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni-E | Capture the images of brain sections |
| nanoZ impedance tester | Plexon | nanoZ | To measure impedance or performing electrode impedance spectroscopy (EIS) for multichannel microelectrode arrays. |
| NeuroExplorer | Plexon | NeuroExplorer | A tool for analyzing the electrophysiological data. |
| NeuroExplorer | Plexon, USA | N/A | A software. |
| Ni-chrome wire | California Fine Wire Co. | M472490 | 35 μm Ni-chrome wire. |
| Offline Sorter | Plexon | Offline Sorter | A tool for sorting the recorded multi-units. |
| PCB board | Hangzhou Jiepei Information Technology Co., Ltd. | N/A | Computer designed board. |
| Pentobarbital | Sigma | P3761 | To anesthetize mice. |
| Pentobarbital sodium | Sigma | 57-33-0 | To anesthetize the mouse. |
| Peristaltic pump | Longer | BT100-1F | A device used for perfusion |
| Polyformaldehyde | Sangon Biotech | A500684-0500 | The main component of fixative solution for fixation of mouse brains |
| PtCl4 | Tianjin Jinbolan Fine Chemical Co., Ltd. | 13454-96-1 | Preparation for gold plating liquid. |
| Saline | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To clean the mouse's skull. |
| Silver wire | Suzhou Xinye Electronics Co., Ltd. | 2 mm diameter | Applying for ground and reference electrodes. |
| Skull drill | RWD Life Science | 78001 | To drill carefully two small holes on mouse's skull. |
| Stainless steel screws | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | M0.8 x 2 | To protect the micro-drive system and link the ground and reference electrodes. |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 68513 | To perform the stereotaxic coordinates of bilateral motor cortex. |
| Sucrose | Damao | 57-50-1 | To dehydrate the mouse brains after perfusion. |
| Super glue | Henkel AG & Co. | PSK5C | To fix the guide tube and Ni-chrome wire. |
| Temperature controller | Harvard Apparatus | TCAT-2 | To maintain mouse's rectal temperature at 37°C |
| Tetracycline eye ointment | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To protect the mouse's eyes during surgery. |
| Thread | Rapala | N/A | To link ballon and headstage. |
| Vaseline | Unilever plc | N/A | To cover the gap between electrode arrays and mouse's skull. |
References
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).
- Singer, W. Synchronization of cortical activity and its putative role in information processing and learning. Annual Review of Physiology. 55, 349-374 (1993).
- Arroyo-García, L. E., et al. Impaired spike-gamma coupling of area CA3 fast-spiking interneurons as the earliest functional impairment in the App(NL-G-F) mouse model of Alzheimer's disease. Molecular Psychiatry. 26 (10), 5557-5567 (2021).
- Ozawa, M., et al. Experience-dependent resonance in amygdalo-cortical circuits supports fear memory retrieval following extinction. Nature Communications. 11 (1), 4358 (2020).
- Vinck, M., Batista-Brito, R., Knoblich, U., Cardin, J. A. Arousal and locomotion make distinct contributions to cortical activity patterns and visual encoding. Neuron. 86 (3), 740-754 (2015).
- Beck, M. H., et al. long-term dopamine depletion causes enhanced beta oscillations in the cortico-basal ganglia loop of parkinsonian rats. Experimental Neurology. 286, 124-136 (2016).
- Magill, P. J., Bolam, J. P., Bevan, M. D. Relationship of activity in the subthalamic nucleus-globus pallidus network to cortical electroencephalogram. Journal of Neuroscience. 20 (2), 820-833 (2000).
- Magill, P. J., et al. Changes in functional connectivity within the rat striatopallidal axis during global brain activation in vivo. Journal of Neuroscience. 26 (23), 6318-6329 (2006).
- Rapeaux, A. B., Constandinou, T. G. Implantable brain machine interfaces: First-in-human studies, technology challenges and trends. Current Opinion in Biotechnology. 72, 102-111 (2021).
- Tort, A. B., et al. Dynamic cross-frequency couplings of local field potential oscillations in rat striatum and hippocampus during performance of a T-maze task. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20517-20522 (2008).
- Yamamoto, J., Wilson, M. A. Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals. Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2430-2440 (2008).
- Chang, E. H., Frattini, S. A., Robbiati, S., Huerta, P. T. Construction of microdrive arrays for chronic neural recordings in awake behaving mice. Journal of Visualized Experiments. (77), e50470 (2013).
- Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. Journal of Visualized Experiments. (61), e3568 (2012).
- Lansink, C. S., et al. A split microdrive for simultaneous multi-electrode recordings from two brain areas in awake small animals. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 129-138 (2007).
- Sato, T., Suzuki, T., Mabuchi, K. A new multi-electrode array design for chronic neural recording, with independent and automatic hydraulic positioning. Journal of Neuroscience Methods. 160 (1), 45-51 (2007).
- van Daal, R. J. J., et al. Implantation of Neuropixels probes for chronic recording of neuronal activity in freely behaving mice and rats. Nature Protocols. 16 (7), 3322-3347 (2021).
- Unakafova, V. A., Gail, A. Comparing open-source toolboxes for processing and analysis of spike and local field potentials data. Frontiers in Neuroinformatics. 13, 57 (2019).
- Mao, L., Wang, H., Qiao, L., Wang, X. Disruption of Nrf2 enhances the upregulation of nuclear factor-kappaB activity, tumor necrosis factor-alpha, and matrix metalloproteinase-9 after spinal cord injury in mice. Mediators of Inflammation. 2010, 238321 (2010).
- Jin, Z., Zhang, Z., Ke, J., Wang, Y., Wu, H. Exercise-linked irisin prevents mortality and enhances cognition in a mice model of cerebral ischemia by regulating Klotho expression. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1697070 (2021).
- Ding, X., et al. Spreading of TDP-43 pathology via pyramidal tract induces ALS-like phenotypes in TDP-43 transgenic mice. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 15 (2021).
- Cao, W., et al. Gamma oscillation dysfunction in mPFC leads to social deficits in neuroligin 3 R451C knockin mice. Neuron. 97 (6), 1253-1260 (2018).
