הקלטה חוץ-תאית רב-ערוצית בעכברים הנעים בחופשיות
Summary
הפרוטוקול מתאר את המתודולוגיה של רישום חוץ-תאי בקליפת המוח המוטורית (MC) כדי לחשוף תכונות אלקטרופיזיולוגיות חוץ-תאיות בעכברים מודעים הנעים בחופשיות, כמו גם ניתוח נתונים של פוטנציאלי שדה מקומיים (LFPs) וקוצים, אשר שימושי להערכת הפעילות העצבית ברשת העומדת בבסיס התנהגויות מעניינות.
Abstract
מטרת הפרוטוקול היא לחשוף את התכונות של ירי עצבי ופוטנציאלי שדה מקומי ברשת (LFPs) בעכברים מתנהגים המבצעים משימות ספציפיות על ידי מתאם האותות האלקטרופיזיולוגיים עם התנהגות ספונטנית ו / או ספציפית. טכניקה זו מייצגת כלי רב ערך בחקר פעילות הרשת העצבית העומדת בבסיס התנהגויות אלה. המאמר מספק הליך מפורט ומלא להשתלת אלקטרודות וכתוצאה מכך להקלטה חוץ-תאית בעכברים מודעים הנעים בחופשיות. המחקר כולל שיטה מפורטת להשתלת מערכי מיקרואלקטרודות, לכידת אותות LFP וקוצים עצביים בקליפת המוח המוטורית (MC) באמצעות מערכת רב-ערוצית, וניתוח נתונים לא מקוונים לאחר מכן. היתרון של הקלטה רב ערוצית בבעלי חיים מודעים הוא כי מספר גדול יותר של נוירונים קוצים ותת-סוגים עצביים ניתן להשיג ולהשוות, אשר מאפשר להעריך את הקשר בין התנהגות מסוימת לבין אותות אלקטרופיזיולוגיים הקשורים. יש לציין כי טכניקת ההקלטה החוץ תאית הרב-ערוצית והליך ניתוח הנתונים המתואר במחקר הנוכחי יכולים להיות מיושמים על אזורי מוח אחרים בעת ביצוע ניסויים בעכברים מתנהגים.
Introduction
פוטנציאל השדה המקומי (LFP), מרכיב חשוב של אותות חוץ-תאיים, משקף את הפעילות הסינפטית של אוכלוסיות גדולות של נוירונים, היוצרים את הקוד העצבי להתנהגויות מרובות1. קוצים הנוצרים על ידי פעילות עצבית נחשבים כתורמים ל- LFP והם חשובים לקידוד עצבי2. שינויים בקוצים וב-LFPs הוכחו כמתווכים מספר מחלות מוח, כגון מחלת אלצהיימר, כמו גם רגשות כגון פחד וכו’.3,4. ראוי לציין כי מחקרים רבים הדגישו כי פעילות ספייק שונה באופן משמעותי בין מצב ער למצב מורדם בבעלי חיים5. למרות שהקלטות בבעלי חיים מורדמים מציעות הזדמנות להעריך LFPs עם ממצאים מינימליים במצבי סנכרון קליפת המוח מוגדרים מאוד, התוצאות שונות במידה מסוימת ממה שניתן למצוא אצל נבדקים ערים 6,7,8. לכן, משמעותי יותר לזהות פעילות עצבית על פני סקאלות זמן ארוכות וקני מידה מרחביים גדולים במחלות שונות במצב מוחי ער באמצעות אלקטרודות המושתלות במוח. כתב יד זה מספק מידע למתחילים כיצד ליצור את מערכת המיקרו-כונן ולהגדיר את הפרמטרים באמצעות תוכנה נפוצה לחישוב אותות הספייק וה- LFP בצורה מהירה ופשוטה על מנת להתחיל את ההקלטה והניתוח.
אף על פי שרישום לא פולשני של תפקודי מוח, כגון באמצעות אלקטרואנצפלוגרמות (EEGs) ופוטנציאלים הקשורים לאירועים (ERPs) שנרשמו מהקרקפת, נמצא בשימוש נרחב במחקרים בבני אדם ובמכרסמים, לנתוני EEG ו-ERP יש תכונות מרחביות וזמניות נמוכות, ולכן אינם יכולים לזהות את האותות המדויקים המיוצרים על-ידי פעילות סינפטית דנדריטית סמוכה באזור מסוים במוח1. כיום, על ידי ניצול הקלטה רב-ערוצית בבעלי חיים מודעים, פעילות עצבית בשכבות העמוקות יותר של המוח יכולה להירשם באופן כרוני והדרגתי על ידי השתלת מערכת מיקרו-דרייב במוחם של פרימטים או מכרסמים במהלך מבחני התנהגות מרובים 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . בקצרה, חוקרים יכולים לבנות מערכת מיקרו-כונן שניתן להשתמש בה למיקום עצמאי של אלקטרודות או טטרודים כדי להתמקד באזורים שונים במוח10,11. לדוגמה, צ’אנג ועמיתיו תיארו טכניקות לרישום קוצים ו-LFPs בעכברים על ידי הרכבת מיקרו-כונן קל וקומפקטי12. בנוסף, גשושיות סיליקון מיקרו-מכונות עם רכיבי אביזרים בהתאמה אישית זמינות באופן מסחרי לרישום נוירונים בודדים מרובים ו-LFPs במכרסמים במהלך משימות התנהגותיות13. למרות שעיצובים שונים שימשו להרכבת מערכות מיקרו-כונן, אלה עדיין זוכים להצלחה מוגבלת מבחינת המורכבות והמשקל של מערכת המיקרו-כונן כולה. לדוגמה, Lansink et al. הראו מערכת מיקרו-כונן רב-ערוצית עם מבנה מורכב להקלטה מאזור מוח יחיד14. Sato et al. דיווחו על מערכת מיקרו-כונן רב-ערוצית המציגה פונקציית מיקום הידראולית אוטומטית15. החסרונות העיקריים של מערכות מיקרו-כונן אלה הם שהם כבדים מדי עבור עכברים לנוע בחופשיות וקשה להרכיב למתחילים. למרות שהקלטה חוץ-תאית רב-ערוצית הוכחה כטכנולוגיה מתאימה ויעילה למדידת פעילות עצבית במהלך מבחנים התנהגותיים, לא קל למתחילים להקליט ולנתח את האותות הנרכשים על ידי מערכת המיקרו-כונן המורכבת. בהתחשב בכך שקשה להתחיל את כל תהליך הפעולה של ההקלטה החוץ-תאית הרב-ערוצית וניתוח הנתונים בעכברים הנעים בחופשיות16,17, מאמר זה מציג הנחיות פשוטות להצגת התהליך המפורט של יצירת מערכת מיקרו-כונן באמצעות רכיבים והגדרות הזמינים בדרך כלל; הפרמטרים בתוכנה הנפוצה לחישוב אותות הספייק וה- LFP בצורה מהירה ופשוטה מסופקים גם כן. בנוסף, בפרוטוקול זה, העכבר יכול לנוע בחופשיות עקב השימוש בבלון הליום, התורם לקיזוז משקל הראש ומערכת המיקרו-הינע. באופן כללי, במחקר הנוכחי, אנו מתארים כיצד לבנות בקלות מערכת micro-drive ולייעל את תהליכי ההקלטה וניתוח הנתונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הקלטה רב-ערוצית בעכברים הנעים בחופשיות נחשבה לטכנולוגיה שימושית במחקרים במדעי המוח, אך עדיין מאתגר למדי למתחילים להקליט ולנתח את האותות. במחקר הנוכחי, אנו מספקים הנחיות פשוטות ליצירת מערכות מיקרו-דרייב וביצוע השתלת אלקטרודות, כמו גם נהלים פשוטים ללכידה וניתוח של אותות חשמליים באמצעות<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31871170, 32170950 ו-31970915), הקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג (2021A1515010804 ו-2023A1515010899), קרן גואנגדונג למדעי הטבע לפרויקט טיפוח מרכזי (2018B030336001) ומענק גואנגדונג: טכנולוגיות מפתח לטיפול בהפרעות מוחיות (2018B030332001).
Materials
| 2.54 mm pin header | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 1 x 5 | Applying for the movable micro-drive which can slide on its stulls. |
| Adobe Illustrator CC 2017 | Adobe | N/A | To optimize images from GraphPad. |
| BlackRock Microsystems | Blackrock Neurotech | Cerebus | This systems includes headsatge, DA convert, amplifier and computer. |
| Brass nut | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 brass nut | The nut fixes the position of screw. |
| Brass screw | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 x 11 mm brass screw | A screw that hold the movable micro-drive. |
| C57BL/6J | Guangdong Zhiyuan Biomedical Technology Co., LTD. | N/A | 12 weeks of age. |
| Centrifuge tube | Biosharp | 15 mL; BS-150-M | To store mice brain with sucrose sulutions. |
| Conducting paint | Structure Probe, Inc. | 7440-22-4 | To improve the lead-connecting quality between connector pins and Ni-wires. |
| Conductive copper foil tape | 3M | 1181 | To reduce interferenc. |
| Connector | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 2 x 10P | To connect the headtage to micro-drive system. |
| DC Power supply | Maisheng | MS-305D | A power device for electrolytic lesion. |
| Dental cement | Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. | N/A | To fix the electrode arrays on mouse's skull after finishing the implantation. |
| Digital analog converter | Blackrock | 128-Channel | A device that converts digital data into analog signals. |
| Epoxy resin | Alteco | N/A | To cover pins. |
| Excel | Microsoft | N/A | To summarize data after analysis. |
| Eye scissors | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or cutting the Ni-chrome wire. |
| Fine forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery. |
| Forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or assembling the mirco-drive system. |
| Freezing microtome | Leica | CM3050 S | Cut the mouse’s brain into slices |
| Fused silica capillary tubing | Zhengzhou INNOSEP Scientific Co., Ltd. | TSP050125 | To serve as the guide tubes for Ni-chrome wires. |
| Glass microelectrode | Sutter Instrument Company | BF100-50-10 | To mark the desired locations for implantation using the filled ink. |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad Software | N/A | To analyze and visualize the results. |
| Guide-tube | Polymicro technologies | 1068150020 | To load Ni-chrome wires. |
| Headstage | Blackrock | N/A | A tool of transmitting signals. |
| Helium balloon | Yili Festive products Co., Ltd. | 24 inch | To offset the weight of headstage and micro-drive system. |
| Ink | Sailor Pen Co.,LTD. | 13-2001 | To mark the desired locations for implantation. |
| Iodine tincture | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To disinfect mouse's scalp. |
| Lincomycin in Hydrochloride and Lidocaine hydrochloride gel | Hubei kangzheng pharmaceutical co., ltd. | 10g | A drug used to reduce inflammation. |
| Meloxicam | Vicki Biotechnology Co., Ltd. | 71125-38-7 | To reduce postoperative pain in mice. |
| Micromanipulators | Scientifica | Scientifica IVM Triple | For electrode arrays implantation. |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni-E | Capture the images of brain sections |
| nanoZ impedance tester | Plexon | nanoZ | To measure impedance or performing electrode impedance spectroscopy (EIS) for multichannel microelectrode arrays. |
| NeuroExplorer | Plexon | NeuroExplorer | A tool for analyzing the electrophysiological data. |
| NeuroExplorer | Plexon, USA | N/A | A software. |
| Ni-chrome wire | California Fine Wire Co. | M472490 | 35 μm Ni-chrome wire. |
| Offline Sorter | Plexon | Offline Sorter | A tool for sorting the recorded multi-units. |
| PCB board | Hangzhou Jiepei Information Technology Co., Ltd. | N/A | Computer designed board. |
| Pentobarbital | Sigma | P3761 | To anesthetize mice. |
| Pentobarbital sodium | Sigma | 57-33-0 | To anesthetize the mouse. |
| Peristaltic pump | Longer | BT100-1F | A device used for perfusion |
| Polyformaldehyde | Sangon Biotech | A500684-0500 | The main component of fixative solution for fixation of mouse brains |
| PtCl4 | Tianjin Jinbolan Fine Chemical Co., Ltd. | 13454-96-1 | Preparation for gold plating liquid. |
| Saline | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To clean the mouse's skull. |
| Silver wire | Suzhou Xinye Electronics Co., Ltd. | 2 mm diameter | Applying for ground and reference electrodes. |
| Skull drill | RWD Life Science | 78001 | To drill carefully two small holes on mouse's skull. |
| Stainless steel screws | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | M0.8 x 2 | To protect the micro-drive system and link the ground and reference electrodes. |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 68513 | To perform the stereotaxic coordinates of bilateral motor cortex. |
| Sucrose | Damao | 57-50-1 | To dehydrate the mouse brains after perfusion. |
| Super glue | Henkel AG & Co. | PSK5C | To fix the guide tube and Ni-chrome wire. |
| Temperature controller | Harvard Apparatus | TCAT-2 | To maintain mouse's rectal temperature at 37°C |
| Tetracycline eye ointment | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To protect the mouse's eyes during surgery. |
| Thread | Rapala | N/A | To link ballon and headstage. |
| Vaseline | Unilever plc | N/A | To cover the gap between electrode arrays and mouse's skull. |
References
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents–EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).
- Singer, W. Synchronization of cortical activity and its putative role in information processing and learning. Annual Review of Physiology. 55, 349-374 (1993).
- Arroyo-García, L. E., et al. Impaired spike-gamma coupling of area CA3 fast-spiking interneurons as the earliest functional impairment in the App(NL-G-F) mouse model of Alzheimer’s disease. Molecular Psychiatry. 26 (10), 5557-5567 (2021).
- Ozawa, M., et al. Experience-dependent resonance in amygdalo-cortical circuits supports fear memory retrieval following extinction. Nature Communications. 11 (1), 4358 (2020).
- Vinck, M., Batista-Brito, R., Knoblich, U., Cardin, J. A. Arousal and locomotion make distinct contributions to cortical activity patterns and visual encoding. Neuron. 86 (3), 740-754 (2015).
- Beck, M. H., et al. long-term dopamine depletion causes enhanced beta oscillations in the cortico-basal ganglia loop of parkinsonian rats. Experimental Neurology. 286, 124-136 (2016).
- Magill, P. J., Bolam, J. P., Bevan, M. D. Relationship of activity in the subthalamic nucleus-globus pallidus network to cortical electroencephalogram. Journal of Neuroscience. 20 (2), 820-833 (2000).
- Magill, P. J., et al. Changes in functional connectivity within the rat striatopallidal axis during global brain activation in vivo. Journal of Neuroscience. 26 (23), 6318-6329 (2006).
- Rapeaux, A. B., Constandinou, T. G. Implantable brain machine interfaces: First-in-human studies, technology challenges and trends. Current Opinion in Biotechnology. 72, 102-111 (2021).
- Tort, A. B., et al. Dynamic cross-frequency couplings of local field potential oscillations in rat striatum and hippocampus during performance of a T-maze task. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20517-20522 (2008).
- Yamamoto, J., Wilson, M. A. Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals. Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2430-2440 (2008).
- Chang, E. H., Frattini, S. A., Robbiati, S., Huerta, P. T. Construction of microdrive arrays for chronic neural recordings in awake behaving mice. Journal of Visualized Experiments. (77), e50470 (2013).
- Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. Journal of Visualized Experiments. (61), e3568 (2012).
- Lansink, C. S., et al. A split microdrive for simultaneous multi-electrode recordings from two brain areas in awake small animals. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 129-138 (2007).
- Sato, T., Suzuki, T., Mabuchi, K. A new multi-electrode array design for chronic neural recording, with independent and automatic hydraulic positioning. Journal of Neuroscience Methods. 160 (1), 45-51 (2007).
- van Daal, R. J. J., et al. Implantation of Neuropixels probes for chronic recording of neuronal activity in freely behaving mice and rats. Nature Protocols. 16 (7), 3322-3347 (2021).
- Unakafova, V. A., Gail, A. Comparing open-source toolboxes for processing and analysis of spike and local field potentials data. Frontiers in Neuroinformatics. 13, 57 (2019).
- Mao, L., Wang, H., Qiao, L., Wang, X. Disruption of Nrf2 enhances the upregulation of nuclear factor-kappaB activity, tumor necrosis factor-alpha, and matrix metalloproteinase-9 after spinal cord injury in mice. Mediators of Inflammation. 2010, 238321 (2010).
- Jin, Z., Zhang, Z., Ke, J., Wang, Y., Wu, H. Exercise-linked irisin prevents mortality and enhances cognition in a mice model of cerebral ischemia by regulating Klotho expression. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1697070 (2021).
- Ding, X., et al. Spreading of TDP-43 pathology via pyramidal tract induces ALS-like phenotypes in TDP-43 transgenic mice. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 15 (2021).
- Cao, W., et al. Gamma oscillation dysfunction in mPFC leads to social deficits in neuroligin 3 R451C knockin mice. Neuron. 97 (6), 1253-1260 (2018).
