自由に動くマウスにおけるマルチチャンネル細胞外記録
Summary
プロトコルは自由に動く意識のマウスの細胞外の電気生理学的な特性を明らかにするための運動皮質(MC)の細胞外記録の方法論を、またローカル視野の潜在性(LFPs)および興味の行動の根底にあるネットワークの神経活動を評価するために有用であるスパイクのデータ分析記述する。
Abstract
プロトコルは自発的および/または特定の行動と電気生理学的な信号を関連付けることによって特定の仕事を遂行するマウスをすることのニューロンの発火およびネットワークローカル電界電位(LFP)の特性を明らかにすることを向ける。この手法は、これらの行動の根底にあるニューロンネットワーク活動を研究する上で貴重なツールとなります。本稿では、自由に動く意識のあるマウスにおける電極の埋め込みとそれに伴う細胞外記録の詳細かつ完全な手順について解説しています。この研究には、微小電極アレイを埋め込むための詳細な方法、マルチチャンネルシステムを使用して運動皮質(MC)内のLFPとニューロンスパイク信号をキャプチャし、その後のオフラインデータ分析が含まれます。意識のある動物におけるマルチチャンネル記録の利点は、より多くのスパイクニューロンおよびニューロンサブタイプを取得して比較できることであり、これにより、特定の行動と関連する電気生理学的信号との関係を評価できる。特に、本研究で説明したマルチチャンネル細胞外記録技術およびデータ解析手順は、行動マウスの実験を行う際に、他の脳領域にも適用できる。
Introduction
細胞外シグナルの重要な構成要素である局所電界電位(LFP)は、複数の行動の神経コードを形成するニューロンの大きな集団のシナプス活動を反映しています1。ニューロンの活動によって生じるスパイクはLFPに寄与すると考えられており、ニューラルコーディング2にとって重要である。スパイクとLFPの変化は、アルツハイマー病などのいくつかの脳疾患や、恐怖などの感情を媒介することが証明されています3,4。多くの研究で、動物の覚醒状態と麻酔状態の間でスパイク活性が大きく異なることが強調されていることは注目に値します5。麻酔をかけた動物での記録は、高度に定義された皮質同期状態で最小限のアーチファクトでLFPを評価する機会を提供しますが、結果は覚醒した被験者に見られるものとはある程度異なります6,7,8。したがって、脳に埋め込まれた電極を用いて、覚醒した脳状態で様々な疾患の神経活動を長い時間スケールと大きな空間スケールで検出することは、より有意義です。この原稿では、記録と分析を開始するために、スパイク信号とLFP信号を迅速かつ簡単に計算するための一般的なソフトウェアを使用して、マイクロドライブシステムを作成し、パラメータを設定する方法に関する初心者向けの情報を提供します。
頭皮から記録された脳波(EEG)やイベント関連電位(ERP)などによる脳機能の非侵襲的記録は、ヒトやげっ歯類の研究で広く使用されてきましたが、EEGおよびERPデータは空間的および時間的特性が低いため、特定の脳領域内の近くの樹状突起シナプス活動によって生成される正確な信号を検出することはできません1.現在、意識のある動物のマルチチャンネル記録を利用することで、霊長類やげっ歯類の脳にマイクロドライブシステムを移植することで、脳の深層部の神経活動を慢性的かつ漸進的に記録することができます1,2,3,4,5,6,7,8,9 .簡単に言うと、研究者は、脳の異なる部分を標的とするために、電極または四極管の独立した位置決めに使用できるマイクロドライブシステムを構築することができる10,11。例えば、Changらは、軽量でコンパクトなマイクロドライブ12を組み立てることによって、マウスのスパイクおよびLFPを記録する技術を記述した。さらに、行動課題中のげっ歯類における複数の単一ニューロンおよびLFPを記録するために、カスタムメイドの付属部品を備えた微細加工されたシリコンプローブが市販されている13。マイクロドライブシステムの組み立てにはさまざまな設計が使用されてきましたが、マイクロドライブシステム全体の複雑さと重量の点で、これらの成功はまだ限られています。例えば、Lansinkらは、単一の脳領域から記録するための複雑な構造を有するマルチチャンネルマイクロドライブシステムを示した14。佐藤らは、自動油圧位置決め機能15を表示するマルチチャンネルマイクロドライブシステムを報告した。これらのマイクロドライブシステムの主な欠点は、マウスが自由に動くには重すぎることと、初心者には組み立てが難しいことです。マルチチャンネルの細胞外記録は、行動テスト中の神経活動を測定するのに適しており効率的な技術であることが示されていますが、複雑なマイクロドライブシステムによって取得された信号を初心者が記録および分析することは容易ではありません。自由に動くマウス16,17では、マルチチャンネルの細胞外記録とデータ解析の全操作プロセスを開始することが困難であることを考慮し、本稿では、簡略化されたガイドラインを提示し、一般的に入手可能なコンポーネントと設定を使用してマイクロドライブシステムを作成する詳細なプロセスを紹介します。また、スパイク信号とLFP信号を高速かつ簡単に計算するための共通ソフトウェアのパラメータも提供されています。さらに、このプロトコルでは、ヘリウムバルーンの使用によりマウスを自由に動かすことができ、ヘッドステージとマイクロドライブシステムの重量を相殺することに貢献します。本研究では、マイクロドライブシステムを簡単に構築し、記録とデータ解析のプロセスを最適化する方法について概説する。
Protocol
Representative Results
Discussion
自由に動くマウスのマルチチャンネル記録は、神経科学研究において有用な技術であると考えられてきましたが、初心者が信号を記録して解析することはまだ非常に困難です。本研究では、マイクロドライブシステムの作成と電極注入の簡易ガイドラインと、スパイクソーティングソフトウェアと神経生理学的データ解析用ソフトウェア を介して 電気信号を捕捉および分析するため?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、中国国家自然科学基金会(31871170、32170950、31970915)、広東省自然科学基金会(2021A1515010804および2023A1515010899)、広東省自然科学基金会大規模栽培プロジェクト(2018B030336001)、広東省助成金:脳疾患治療のための主要技術(2018B030332001)の助成金を受けて行われました。
Materials
| 2.54 mm pin header | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 1 x 5 | Applying for the movable micro-drive which can slide on its stulls. |
| Adobe Illustrator CC 2017 | Adobe | N/A | To optimize images from GraphPad. |
| BlackRock Microsystems | Blackrock Neurotech | Cerebus | This systems includes headsatge, DA convert, amplifier and computer. |
| Brass nut | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 brass nut | The nut fixes the position of screw. |
| Brass screw | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 x 11 mm brass screw | A screw that hold the movable micro-drive. |
| C57BL/6J | Guangdong Zhiyuan Biomedical Technology Co., LTD. | N/A | 12 weeks of age. |
| Centrifuge tube | Biosharp | 15 mL; BS-150-M | To store mice brain with sucrose sulutions. |
| Conducting paint | Structure Probe, Inc. | 7440-22-4 | To improve the lead-connecting quality between connector pins and Ni-wires. |
| Conductive copper foil tape | 3M | 1181 | To reduce interferenc. |
| Connector | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 2 x 10P | To connect the headtage to micro-drive system. |
| DC Power supply | Maisheng | MS-305D | A power device for electrolytic lesion. |
| Dental cement | Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. | N/A | To fix the electrode arrays on mouse's skull after finishing the implantation. |
| Digital analog converter | Blackrock | 128-Channel | A device that converts digital data into analog signals. |
| Epoxy resin | Alteco | N/A | To cover pins. |
| Excel | Microsoft | N/A | To summarize data after analysis. |
| Eye scissors | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or cutting the Ni-chrome wire. |
| Fine forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery. |
| Forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or assembling the mirco-drive system. |
| Freezing microtome | Leica | CM3050 S | Cut the mouse’s brain into slices |
| Fused silica capillary tubing | Zhengzhou INNOSEP Scientific Co., Ltd. | TSP050125 | To serve as the guide tubes for Ni-chrome wires. |
| Glass microelectrode | Sutter Instrument Company | BF100-50-10 | To mark the desired locations for implantation using the filled ink. |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad Software | N/A | To analyze and visualize the results. |
| Guide-tube | Polymicro technologies | 1068150020 | To load Ni-chrome wires. |
| Headstage | Blackrock | N/A | A tool of transmitting signals. |
| Helium balloon | Yili Festive products Co., Ltd. | 24 inch | To offset the weight of headstage and micro-drive system. |
| Ink | Sailor Pen Co.,LTD. | 13-2001 | To mark the desired locations for implantation. |
| Iodine tincture | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To disinfect mouse's scalp. |
| Lincomycin in Hydrochloride and Lidocaine hydrochloride gel | Hubei kangzheng pharmaceutical co., ltd. | 10g | A drug used to reduce inflammation. |
| Meloxicam | Vicki Biotechnology Co., Ltd. | 71125-38-7 | To reduce postoperative pain in mice. |
| Micromanipulators | Scientifica | Scientifica IVM Triple | For electrode arrays implantation. |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni-E | Capture the images of brain sections |
| nanoZ impedance tester | Plexon | nanoZ | To measure impedance or performing electrode impedance spectroscopy (EIS) for multichannel microelectrode arrays. |
| NeuroExplorer | Plexon | NeuroExplorer | A tool for analyzing the electrophysiological data. |
| NeuroExplorer | Plexon, USA | N/A | A software. |
| Ni-chrome wire | California Fine Wire Co. | M472490 | 35 μm Ni-chrome wire. |
| Offline Sorter | Plexon | Offline Sorter | A tool for sorting the recorded multi-units. |
| PCB board | Hangzhou Jiepei Information Technology Co., Ltd. | N/A | Computer designed board. |
| Pentobarbital | Sigma | P3761 | To anesthetize mice. |
| Pentobarbital sodium | Sigma | 57-33-0 | To anesthetize the mouse. |
| Peristaltic pump | Longer | BT100-1F | A device used for perfusion |
| Polyformaldehyde | Sangon Biotech | A500684-0500 | The main component of fixative solution for fixation of mouse brains |
| PtCl4 | Tianjin Jinbolan Fine Chemical Co., Ltd. | 13454-96-1 | Preparation for gold plating liquid. |
| Saline | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To clean the mouse's skull. |
| Silver wire | Suzhou Xinye Electronics Co., Ltd. | 2 mm diameter | Applying for ground and reference electrodes. |
| Skull drill | RWD Life Science | 78001 | To drill carefully two small holes on mouse's skull. |
| Stainless steel screws | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | M0.8 x 2 | To protect the micro-drive system and link the ground and reference electrodes. |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 68513 | To perform the stereotaxic coordinates of bilateral motor cortex. |
| Sucrose | Damao | 57-50-1 | To dehydrate the mouse brains after perfusion. |
| Super glue | Henkel AG & Co. | PSK5C | To fix the guide tube and Ni-chrome wire. |
| Temperature controller | Harvard Apparatus | TCAT-2 | To maintain mouse's rectal temperature at 37°C |
| Tetracycline eye ointment | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To protect the mouse's eyes during surgery. |
| Thread | Rapala | N/A | To link ballon and headstage. |
| Vaseline | Unilever plc | N/A | To cover the gap between electrode arrays and mouse's skull. |
References
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