자유롭게 움직이는 마우스의 다채널 세포외 기록
Summary
이 프로토콜은 자유롭게 움직이는 의식이 있는 마우스의 세포외 전기생리학적 특성을 밝히기 위해 운동 피질(MC)에서 세포외 기록 방법론을 설명하고, 관심 행동의 기저에 있는 네트워크 신경 활동을 평가하는 데 유용한 국소전위(LFP) 및 스파이크의 데이터 분석을 설명합니다.
Abstract
이 프로토콜은 전기생리학적 신호를 자발적 및/또는 특정 행동과 연관시킴으로써 특정 작업을 수행하는 마우스에서 신경 세포 발화 및 네트워크 국소장 전위(LFP)의 특성을 밝히는 것을 목표로 합니다. 이 기술은 이러한 행동의 기초가 되는 뉴런 네트워크 활동을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 이 논문은 자유롭게 움직이는 의식이 있는 마우스에서 전극 이식 및 그에 따른 세포외 기록에 대한 상세하고 완전한 절차를 제공합니다. 이 연구에는 미세 전극 어레이를 이식하고, 다중 채널 시스템을 사용하여 운동 피질(MC)에서 LFP 및 신경 세포 스파이크 신호를 캡처하고, 후속 오프라인 데이터 분석을 위한 자세한 방법이 포함됩니다. 의식이 있는 동물에서 다중 채널 기록의 장점은 더 많은 수의 스파이킹 뉴런과 뉴런 아형을 얻고 비교할 수 있어 특정 행동과 관련 전기생리학적 신호 간의 관계를 평가할 수 있다는 것입니다. 특히, 본 연구에서 기술한 다채널 세포외 기록 기법 및 데이터 분석 절차는 행동하는 마우스에서 실험을 수행할 때 다른 뇌 영역에도 적용될 수 있다.
Introduction
세포외 신호의 중요한 구성 요소인 국소전위(LFP)는 여러 행동에 대한 신경 코드를 형성하는 대규모 뉴런 집단의 시냅스 활동을 반영합니다1. 신경 활동에 의해 생성된 스파이크는 LFP에 기여하는 것으로 간주되며 신경 코딩에 중요합니다2. 스파이크와 LFP의 변화는 알츠하이머병과 같은 여러 뇌 질환과 두려움 등의 감정을 매개하는 것으로 입증되었습니다.3,4. 많은 연구에서 동물의 스파이크 활동이 깨어 있는 상태와 마취된 상태 간에 유의한 차이가 있음을 강조했다는 점은 주목할 가치가 있다5. 마취된 동물에서의 기록은 고도로 정의된 피질 동기화 상태에서 최소한의 인공물로 LFP를 평가할 수 있는 기회를 제공하지만, 결과는 깨어 있는 피험자에서 발견될 수 있는 것과는 어느 정도 다르다 6,7,8. 따라서 뇌에 이식된 전극을 이용하여 각성 뇌 상태에서 각종 질환의 장시간 규모와 넓은 공간적 규모에 걸친 신경 활동을 검출하는 것이 더 의미가 있다. 이 원고는 기록 및 분석을 시작하기 위해 빠르고 간단한 방법으로 스파이크 및 LFP 신호를 계산하기 위해 공통 소프트웨어를 사용하여 마이크로 드라이브 시스템을 만들고 매개변수를 설정하는 방법에 대한 초보자를 위한 정보를 제공합니다.
두피에서 기록된 뇌전도(EEG) 및 사건 관련 전위(ERP)를 사용하는 것과 같은 뇌 기능의 비침습적 기록은 인간 및 설치류 연구에서 광범위하게 사용되어 왔지만, EEG 및 ERP 데이터는 공간적, 시간적 특성이 낮기 때문에 특정 뇌 영역 내에서 근처의 수지상 시냅스 활동에 의해 생성된 정확한 신호를 감지할 수 없습니다1. 현재, 의식이 있는 동물에서 다채널 기록을 이용함으로써, 여러 행동 테스트 중에 영장류나 설치류의 뇌에 마이크로 드라이브 시스템을 이식하여 뇌의 더 깊은 층의 신경 활동을 만성적이고 점진적으로 기록할 수 있습니다 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . 간단히 말해서, 연구자들은 뇌의 다른 부분들을 표적으로 삼기 위해 전극 또는 사극의 독립적인 포지셔닝에 사용될 수 있는 마이크로-드라이브 시스템을 구성할 수 있다(10,11). 예를 들어, Chang et al.은 가볍고 컴팩트한 마이크로-드라이브(12)를 조립함으로써 마우스에서 스파이크 및 LFP를 기록하는 기술을 기술하였다. 또한, 맞춤형 액세서리 구성 요소를 갖는 미세 가공된 실리콘 프로브는 행동 작업 동안 설치류에서 다수의 단일 뉴런 및 LFP를 기록하기 위해 상업적으로 이용 가능하다(13). 마이크로 드라이브 시스템을 조립하기 위해 다양한 설계가 사용되었지만 전체 마이크로 드라이브 시스템의 복잡성과 무게 측면에서 여전히 제한적인 성공을 거두었습니다. 예를 들어, Lansink 등은 단일 뇌 영역(14)으로부터 기록하기 위한 복잡한 구조를 갖는 다중채널 마이크로-드라이브 시스템을 보여주었다. Sato et al.은 자동 유압 포지셔닝 기능(15)을 표시하는 다채널 마이크로 드라이브 시스템을 보고하였다. 이러한 마이크로 드라이브 시스템의 주요 단점은 마우스가 자유롭게 움직이기에는 너무 무겁고 초보자가 조립하기 어렵다는 것입니다. 다채널 세포외 기록은 행동 테스트 중 신경 활동을 측정하는 데 적합하고 효율적인 기술임이 밝혀졌지만, 초보자가 복잡한 마이크로 드라이브 시스템에서 획득한 신호를 기록하고 분석하는 것은 쉽지 않습니다. 자유롭게 움직이는 마우스(16, 17)에서 다채널 세포외 기록 및 데이터 분석의 전체 동작 과정을 시작하는 것이 어렵다는 점을 감안할 때, 본 논문은 일반적으로 이용 가능한 구성요소 및 설정을 사용하여 마이크로-드라이브 시스템을 만드는 상세한 과정을 소개하기 위한 단순화된 가이드라인을 제시한다; 빠르고 간단한 방법으로 스파이크 및 LFP 신호를 계산하기 위한 공통 소프트웨어의 매개변수도 제공됩니다. 또한 이 프로토콜에서 마우스는 헬륨 풍선을 사용하여 자유롭게 움직일 수 있으며, 이는 헤드스테이지 및 마이크로 드라이브 시스템의 무게를 상쇄하는 데 기여합니다. 일반적으로 본 연구에서는 마이크로 드라이브 시스템을 쉽게 구축하고 기록 및 데이터 분석 프로세스를 최적화하는 방법을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
자유롭게 움직이는 마우스의 다중 채널 기록은 신경 과학 연구에서 유용한 기술로 간주되어 왔지만 초보자가 신호를 기록하고 분석하는 것은 여전히 매우 어렵습니다. 본 연구에서는 마이크로 드라이브 시스템을 만들고 전극 이식을 수행하기 위한 간단한 지침과 스파이크 분류 소프트웨어 및 신경 생리학적 데이터 분석을 위한 소프트웨어를 통해 전기 신호를 캡처하고 분석하는 간단한 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립자연과학재단(31871170, 32170950, 31970915), 광둥성 자연과학재단(2021A1515010804 및 2023A1515010899), 광둥성 자연과학재단 주요 재배 프로젝트(2018B030336001), 광둥성 보조금: 뇌질환 치료를 위한 핵심 기술(2018B030332001)의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| 2.54 mm pin header | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 1 x 5 | Applying for the movable micro-drive which can slide on its stulls. |
| Adobe Illustrator CC 2017 | Adobe | N/A | To optimize images from GraphPad. |
| BlackRock Microsystems | Blackrock Neurotech | Cerebus | This systems includes headsatge, DA convert, amplifier and computer. |
| Brass nut | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 brass nut | The nut fixes the position of screw. |
| Brass screw | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 x 11 mm brass screw | A screw that hold the movable micro-drive. |
| C57BL/6J | Guangdong Zhiyuan Biomedical Technology Co., LTD. | N/A | 12 weeks of age. |
| Centrifuge tube | Biosharp | 15 mL; BS-150-M | To store mice brain with sucrose sulutions. |
| Conducting paint | Structure Probe, Inc. | 7440-22-4 | To improve the lead-connecting quality between connector pins and Ni-wires. |
| Conductive copper foil tape | 3M | 1181 | To reduce interferenc. |
| Connector | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 2 x 10P | To connect the headtage to micro-drive system. |
| DC Power supply | Maisheng | MS-305D | A power device for electrolytic lesion. |
| Dental cement | Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. | N/A | To fix the electrode arrays on mouse's skull after finishing the implantation. |
| Digital analog converter | Blackrock | 128-Channel | A device that converts digital data into analog signals. |
| Epoxy resin | Alteco | N/A | To cover pins. |
| Excel | Microsoft | N/A | To summarize data after analysis. |
| Eye scissors | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or cutting the Ni-chrome wire. |
| Fine forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery. |
| Forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or assembling the mirco-drive system. |
| Freezing microtome | Leica | CM3050 S | Cut the mouse’s brain into slices |
| Fused silica capillary tubing | Zhengzhou INNOSEP Scientific Co., Ltd. | TSP050125 | To serve as the guide tubes for Ni-chrome wires. |
| Glass microelectrode | Sutter Instrument Company | BF100-50-10 | To mark the desired locations for implantation using the filled ink. |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad Software | N/A | To analyze and visualize the results. |
| Guide-tube | Polymicro technologies | 1068150020 | To load Ni-chrome wires. |
| Headstage | Blackrock | N/A | A tool of transmitting signals. |
| Helium balloon | Yili Festive products Co., Ltd. | 24 inch | To offset the weight of headstage and micro-drive system. |
| Ink | Sailor Pen Co.,LTD. | 13-2001 | To mark the desired locations for implantation. |
| Iodine tincture | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To disinfect mouse's scalp. |
| Lincomycin in Hydrochloride and Lidocaine hydrochloride gel | Hubei kangzheng pharmaceutical co., ltd. | 10g | A drug used to reduce inflammation. |
| Meloxicam | Vicki Biotechnology Co., Ltd. | 71125-38-7 | To reduce postoperative pain in mice. |
| Micromanipulators | Scientifica | Scientifica IVM Triple | For electrode arrays implantation. |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni-E | Capture the images of brain sections |
| nanoZ impedance tester | Plexon | nanoZ | To measure impedance or performing electrode impedance spectroscopy (EIS) for multichannel microelectrode arrays. |
| NeuroExplorer | Plexon | NeuroExplorer | A tool for analyzing the electrophysiological data. |
| NeuroExplorer | Plexon, USA | N/A | A software. |
| Ni-chrome wire | California Fine Wire Co. | M472490 | 35 μm Ni-chrome wire. |
| Offline Sorter | Plexon | Offline Sorter | A tool for sorting the recorded multi-units. |
| PCB board | Hangzhou Jiepei Information Technology Co., Ltd. | N/A | Computer designed board. |
| Pentobarbital | Sigma | P3761 | To anesthetize mice. |
| Pentobarbital sodium | Sigma | 57-33-0 | To anesthetize the mouse. |
| Peristaltic pump | Longer | BT100-1F | A device used for perfusion |
| Polyformaldehyde | Sangon Biotech | A500684-0500 | The main component of fixative solution for fixation of mouse brains |
| PtCl4 | Tianjin Jinbolan Fine Chemical Co., Ltd. | 13454-96-1 | Preparation for gold plating liquid. |
| Saline | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To clean the mouse's skull. |
| Silver wire | Suzhou Xinye Electronics Co., Ltd. | 2 mm diameter | Applying for ground and reference electrodes. |
| Skull drill | RWD Life Science | 78001 | To drill carefully two small holes on mouse's skull. |
| Stainless steel screws | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | M0.8 x 2 | To protect the micro-drive system and link the ground and reference electrodes. |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 68513 | To perform the stereotaxic coordinates of bilateral motor cortex. |
| Sucrose | Damao | 57-50-1 | To dehydrate the mouse brains after perfusion. |
| Super glue | Henkel AG & Co. | PSK5C | To fix the guide tube and Ni-chrome wire. |
| Temperature controller | Harvard Apparatus | TCAT-2 | To maintain mouse's rectal temperature at 37°C |
| Tetracycline eye ointment | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To protect the mouse's eyes during surgery. |
| Thread | Rapala | N/A | To link ballon and headstage. |
| Vaseline | Unilever plc | N/A | To cover the gap between electrode arrays and mouse's skull. |
References
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