Flerkanals ekstracellulært opptak i fritt bevegelige mus

Summary

Protokollen beskriver metodikken for ekstracellulær registrering i motorbarken (MC) for å avsløre ekstracellulære elektrofysiologiske egenskaper i fritt bevegelige bevisste mus, samt dataanalysen av lokale feltpotensialer (LFP) og pigger, noe som er nyttig for å evaluere nettverksnevral aktivitet som ligger til grunn for atferd av interesse.

Abstract

Protokollen tar sikte på å avdekke egenskapene til nevronfyring og nettverkslokale feltpotensialer (LFP) i atferdsmus som utfører spesifikke oppgaver ved å korrelere de elektrofysiologiske signalene med spontan og / eller spesifikk oppførsel. Denne teknikken representerer et verdifullt verktøy for å studere den nevrale nettverksaktiviteten som ligger til grunn for disse atferdene. Artikkelen gir en detaljert og komplett prosedyre for elektrodeimplantasjon og påfølgende ekstracellulært opptak i frittbevegelige bevisste mus. Studien inkluderer en detaljert metode for implantering av mikroelektrodearrayene, fangst av LFP og neuronale spikingsignaler i motorbarken (MC) ved hjelp av et flerkanalssystem, og den påfølgende offline dataanalysen. Fordelen med flerkanalsopptak hos bevisste dyr er at et større antall spiking neuroner og neuronale subtyper kan oppnås og sammenlignes, noe som gjør det mulig å evaluere forholdet mellom en bestemt oppførsel og tilhørende elektrofysiologiske signaler. Spesielt kan den flerkanals ekstracellulære opptaksteknikken og dataanalyseprosedyren beskrevet i denne studien brukes på andre hjerneområder når man utfører eksperimenter med å oppføre mus.

Introduction

Det lokale feltpotensialet (LFP), en viktig komponent i ekstracellulære signaler, gjenspeiler den synaptiske aktiviteten til store populasjoner av nevroner, som danner nevralkoden for flere atferd¹. Spikes generert av nevronaktivitet anses å bidra til LFP og er viktige for nevral koding². Endringer i pigger og LFP har vist seg å formidle flere hjernesykdommer, som Alzheimers sykdom, samt følelser som frykt, ^etc.3,4. Det er verdt å merke seg at mange studier har fremhevet at piggaktivitet er betydelig forskjellig mellom våken og bedøvet tilstand hos dyr⁵. Selv om opptak i bedøvede dyr gir en mulighet til å vurdere LFP-er med minimale artefakter i høyt definerte kortikale synkroniseringstilstander, avviker resultatene til en viss grad fra det som finnes hos våkne personer ^6,7,8. Dermed er det mer meningsfylt å oppdage nevral aktivitet over lange tidsskalaer og store romlige skalaer i ulike sykdommer i en våken hjernetilstand ved hjelp av elektroder implantert i hjernen. Dette manuskriptet gir informasjon til nybegynnere om hvordan man lager mikrostasjonssystemet og stiller inn parametrene ved hjelp av vanlig programvare for å beregne pigg- og LFP-signalene på en rask og grei måte for å få opptaket og analysen i gang.

Selv om ikke-invasiv registrering av hjernefunksjoner, for eksempel ved bruk av elektroencefalogrammer (EEG) og hendelsesrelaterte potensialer (ERP) registrert fra hodebunnen, har blitt brukt mye i humane og gnagerstudier, har EEG- og ERP-data lave romlige og tidsmessige egenskaper og kan derfor ikke oppdage de nøyaktige signalene som produseres av nærliggende dendritisk synaptisk aktivitet innenfor et bestemt hjerneområde¹. For tiden, ved å dra nytte av flerkanalsopptak hos bevisste dyr, kan nevral aktivitet i de dypere lagene i hjernen registreres kronisk og gradvis ved å implantere et mikrodrivsystem i hjernen til primater eller gnagere under flere atferdstester 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Kort fortalt kan forskere konstruere et mikrodrivsystem som kan brukes til uavhengig posisjonering av elektrodene eller tetrodene for å målrette mot forskjellige deler av hjernen^10,11. For eksempel beskrev Chang et al. teknikker for å registrere pigger og LFP-er i mus ved å montere en lett og kompakt mikrostasjon¹². I tillegg er mikromaskinerte silisiumprober med skreddersydde tilbehørskomponenter kommersielt tilgjengelige for registrering av flere enkeltnevroner og LFP-er hos gnagere under atferdsoppgaver¹³. Selv om ulike design har blitt brukt til å sette sammen mikrodrivsystemer, har disse fortsatt begrenset suksess når det gjelder kompleksiteten og vekten til hele mikrodrivsystemet. For eksempel viste Lansink et al. et flerkanals mikrodrivsystem med en kompleks struktur for opptak fra en enkelt hjernegruppe¹⁴. Sato et al. rapporterte et flerkanals mikrodrivsystem som viser en automatisk hydraulisk posisjoneringsfunksjon¹⁵. De viktigste ulempene med disse mikrodrivsystemene er at de er for tunge til at mus kan bevege seg fritt og er vanskelige å montere for nybegynnere. Selv om flerkanals ekstracellulært opptak har vist seg å være en egnet og effektiv teknologi for måling av nevral aktivitet under atferdstester, er det ikke lett for nybegynnere å registrere og analysere signalene som er oppnådd av det komplekse mikrodrivsystemet. Gitt at det er vanskelig å få hele operasjonsprosessen til flerkanals ekstracellulær registrering og dataanalyse startet i fritt bevegelige mus^16,17, presenterer denne denne artikkelen forenklede retningslinjer for å introdusere den detaljerte prosessen med å lage mikrodrivsystemet ved hjelp av allment tilgjengelige komponenter og innstillinger; Parametrene i den vanlige programvaren for å beregne pigg- og LFP-signalene på en rask og grei måte er også gitt. I tillegg, i denne protokollen, kan musen bevege seg fritt på grunn av bruk av en heliumballong, noe som bidrar til å utligne vekten av headstage og mikrodrivsystem. Generelt, i denne studien, beskriver vi hvordan du enkelt kan bygge et mikrodrivsystem og optimalisere prosessene for registrering og dataanalyse.

Protocol

Alle musene ble oppnådd kommersielt og vedlikeholdt i en 12 timers lys / 12 timer mørk syklus (lys på kl. 08:00 lokal tid) ved en romtemperatur på 22-25 ° C og en relativ fuktighet på 50% -60%. Musene hadde tilgang til kontinuerlig tilførsel av mat og vann. Alle forsøkene ble utført i samsvar med retningslinjene for omsorg og bruk av forsøksdyr ved South China Normal University og godkjent av Institutional Animal Ethics Committee. Hannmus C57BL/6J i alderen 3-5 måneder ble brukt til forsøkene. <p class="j…

Representative Results

Et høypassfilter (250 Hz) ble brukt for å trekke ut multienhetspiggene fra råsignalene (figur 6A). Videre ble de registrerte enhetene fra MC til en normal mus sortert etter PCA verifisert (figur 7A-D), og dalbredden og bølgeformvarigheten til enhetene i musens MC ble registrert. Resultatene viste at både dalbredden og bølgeformvarigheten til MC-antatte pyramidale nevroner (Pyn) hos mus er høyere enn de antatte internevron…

Discussion

Flerkanalsopptak i frittgående mus har blitt ansett for å være en nyttig teknologi i nevrovitenskapsstudier, men det er fortsatt ganske utfordrende for nybegynnere å registrere og analysere signalene. I denne studien gir vi forenklede retningslinjer for å lage mikrodrivsystemer og utføre elektrodeimplantasjon, samt forenklede prosedyrer for å fange og analysere de elektriske signalene via piggsorteringsprogramvare og programvare for nevrofysiologisk dataanalyse.

Gitt at kvalite…

Materials

2.54 mm pin header	YOUXIN Electronic Co., Ltd.	1 x 5	Applying for the movable micro-drive which can slide on its stulls.
Adobe Illustrator CC 2017	Adobe	N/A	To optimize images from GraphPad.
BlackRock Microsystems	Blackrock Neurotech	Cerebus	This systems includes headsatge, DA convert, amplifier and computer.
Brass nut	Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd.	M0.8 brass nut	The nut fixes the position of screw.
Brass screw	Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd.	M0.8 x 11 mm brass screw	A screw that hold the movable micro-drive.
C57BL/6J	Guangdong Zhiyuan Biomedical Technology Co., LTD.	N/A	12 weeks of age.
Centrifuge tube	Biosharp	15 mL; BS-150-M	To store mice brain with sucrose sulutions.
Conducting paint	Structure Probe, Inc.	7440-22-4	To improve the lead-connecting quality between connector pins and Ni-wires.
Conductive copper foil tape	3M	1181	To reduce interferenc.
Connector	YOUXIN Electronic Co., Ltd.	2 x 10P	To connect the headtage to micro-drive system.
DC Power supply	Maisheng	MS-305D	A power device for  electrolytic lesion.
Dental cement	Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd.	N/A	To fix the electrode arrays on mouse's skull after finishing the implantation.
Digital analog converter	Blackrock	128-Channel	A device that converts digital data into analog signals.
Epoxy resin	Alteco	N/A	To cover pins.
Excel	Microsoft	N/A	To summarize data after analysis.
Eye scissors	JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd.	N/A	For surgery or cutting the Ni-chrome wire.
Fine forceps	JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd.	N/A	For surgery.
Forceps	JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd.	N/A	For surgery or assembling the mirco-drive system.
Freezing microtome	Leica	CM3050 S	Cut the mouse’s brain into slices
Fused silica capillary tubing	Zhengzhou INNOSEP Scientific Co., Ltd.	TSP050125	To  serve as the guide tubes for Ni-chrome wires.
Glass microelectrode	Sutter Instrument Company	BF100-50-10	To mark the desired locations for implantation using the filled ink.
GraphPad Prism 7	GraphPad Software	N/A	To analyze and visualize the results.
Guide-tube	Polymicro technologies	1068150020	To load Ni-chrome wires.
Headstage	Blackrock	N/A	A tool of transmitting signals.
Helium balloon	Yili Festive products Co., Ltd.	24 inch	To offset the weight of headstage and micro-drive system.
Ink	Sailor Pen Co.,LTD.	13-2001	To mark the desired locations for implantation.
Iodine tincture	Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd.	N/A	To disinfect mouse's scalp.
Lincomycin in Hydrochloride and Lidocaine  hydrochloride gel	Hubei kangzheng pharmaceutical co., ltd.	10g	A drug used to reduce inflammation.
Meloxicam	Vicki Biotechnology Co., Ltd.	71125-38-7	To reduce postoperative pain in mice.
Micromanipulators	Scientifica	Scientifica IVM Triple	For electrode arrays implantation.
Microscope	Nikon	ECLIPSE Ni-E	Capture the images of brain sections
nanoZ impedance tester	Plexon	nanoZ	To measure impedance or performing electrode impedance spectroscopy (EIS) for multichannel microelectrode arrays.
NeuroExplorer	Plexon	NeuroExplorer	A tool for analyzing the electrophysiological data.
NeuroExplorer	Plexon, USA	N/A	A software.
Ni-chrome wire	California Fine Wire Co.	M472490	35 μm Ni-chrome wire.
Offline Sorter	Plexon	Offline Sorter	A tool for sorting the recorded multi-units.
PCB board	Hangzhou Jiepei Information Technology Co., Ltd.	N/A	Computer designed board.
Pentobarbital	Sigma	P3761	To anesthetize mice.
Pentobarbital sodium	Sigma	57-33-0	To anesthetize the mouse.
Peristaltic pump	Longer	BT100-1F	A device used for perfusion
Polyformaldehyde	Sangon Biotech	A500684-0500	The main component of fixative solution for fixation of mouse brains
PtCl4	Tianjin Jinbolan Fine Chemical Co., Ltd.	13454-96-1	Preparation for gold plating liquid.
Saline	Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd.	N/A	To clean the mouse's skull.
Silver wire	Suzhou Xinye Electronics Co., Ltd.	2 mm diameter	Applying for ground and reference electrodes.
Skull drill	RWD Life Science	78001	To drill carefully two small holes on mouse's skull.
Stainless steel screws	YOUXIN Electronic Co., Ltd.	M0.8 x 2	To protect the micro-drive system and link the ground and reference electrodes.
Stereotaxic apparatus	RWD Life Science	68513	To perform the stereotaxic coordinates of bilateral motor cortex.
Sucrose	Damao	57-50-1	To dehydrate the mouse brains  after perfusion.
Super glue	Henkel AG & Co.	PSK5C	To fix the guide tube and Ni-chrome wire.
Temperature controller	Harvard Apparatus	TCAT-2	To maintain mouse's rectal temperature at 37°C
Tetracycline eye ointment	Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd.	N/A	To protect the mouse's eyes during surgery.
Thread	Rapala	N/A	To link ballon and headstage.
Vaseline	Unilever plc	N/A	To cover the gap between electrode arrays and mouse's skull.