Gravação Extracelular Multicanal em Ratos em Movimento Livre
Summary
O protocolo descreve a metodologia de registro extracelular no córtex motor (CM) para revelar propriedades eletrofisiológicas extracelulares em camundongos conscientes em movimento livre, bem como a análise de dados de potenciais de campo local (LFPs) e picos, o que é útil para avaliar a atividade neural da rede subjacente aos comportamentos de interesse.
Abstract
O protocolo visa desvendar as propriedades do disparo neuronal e dos potenciais de campo local (LFPs) em camundongos comportados realizando tarefas específicas, correlacionando os sinais eletrofisiológicos com o comportamento espontâneo e/ou específico. Esta técnica representa uma ferramenta valiosa no estudo da atividade da rede neuronal subjacente a esses comportamentos. O artigo fornece um procedimento detalhado e completo para o implante de eletrodos e consequente registro extracelular em camundongos conscientes em movimento livre. O estudo inclui um método detalhado para implantar os arranjos de microeletrodos, capturar os sinais de LFP e spiking neuronal no córtex motor (CM) usando um sistema multicanal, e a subsequente análise de dados off-line. A vantagem do registro multicanal em animais conscientes é que um maior número de neurônios de spiking e subtipos neuronais pode ser obtido e comparado, o que permite avaliar a relação entre um comportamento específico e os sinais eletrofisiológicos associados. Notavelmente, a técnica de registro extracelular multicanal e o procedimento de análise de dados descrito no presente estudo podem ser aplicados a outras áreas cerebrais ao realizar experimentos em camundongos com comportamento.
Introduction
O potencial de campo local (LFP), um importante componente dos sinais extracelulares, reflete a atividade sináptica de grandes populações de neurônios, que formam o código neural para múltiploscomportamentos1. Considera-se que as espículas geradas pela atividade neuronal contribuem para a LFP e são importantes para a codificação neural2. Alterações em spikes e LFPs comprovadamente mediam diversas doenças cerebrais, como a doença de Alzheimer, bem como emoções como medo, etc.3,4. Vale ressaltar que muitos estudos têm destacado que a atividade da espícula difere significativamente entre os estados acordado e anestesiado em animais5. Embora os registros em animais anestesiados ofereçam uma oportunidade de avaliar PBL com artefatos mínimos em estados de sincronização cortical altamente definidos, os resultados diferem em certa medida do que pode ser encontrado em indivíduos acordados 6,7,8. Assim, é mais significativo detectar atividade neural em longas escalas de tempo e grandes escalas espaciais em várias doenças em estado de vigília usando eletrodos implantados no cérebro. Este manuscrito fornece informações para iniciantes sobre como fazer o sistema de micro-drive e definir os parâmetros usando um software comum para calcular os sinais de pico e LFP de forma rápida e direta, a fim de iniciar a gravação e análise.
Embora o registro não invasivo de funções cerebrais, como o uso de eletroencefalogramas (EEGs) e potenciais relacionados a eventos (ERPs) registrados a partir do couro cabeludo, tenha sido amplamente utilizado em estudos com humanos e roedores, os dados de EEG e ERP têm baixas propriedades espaciais e temporais e, portanto, não conseguem detectar os sinais precisos produzidos pela atividade sináptica dendrítica próxima dentro deuma área específica do cérebro1. Atualmente, aproveitando o registro multicanal em animais conscientes, a atividade neural nas camadas mais profundas do cérebro pode ser registrada crônica e progressivamente pela implantação de um sistema de micro-drive no cérebro de primatas ou roedores durante múltiplos testes comportamentais 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Resumidamente, os pesquisadores podem construir um sistema de micro-drive que pode ser usado para o posicionamento independente dos eletrodos ou tetrodos para atingir diferentes partes do cérebro10,11. Por exemplo, Chang e col. descreveram técnicas para registrar spikes e LFPs em camundongos montando um micro-drive leve e compacto12. Além disso, sondas de silício microusinadas com componentes acessórios feitos sob medida estão comercialmente disponíveis para o registro de múltiplos neurônios individuais e LFPs em roedores durante tarefas comportamentais13. Embora vários projetos tenham sido usados para montar sistemas de micro-acionamento, estes ainda têm sucesso limitado em termos de complexidade e peso de todo o sistema de micro-acionamento. Por exemplo, Lansink e col. mostraram um sistema de micro-drive multicanal com uma estrutura complexa para gravação a partir de uma única região cerebral14. relataram um sistema de microacionamento multicanal exibindo uma função de posicionamento hidráulico automático15. As principais desvantagens desses sistemas de micro-acionamento são que eles são muito pesados para os ratos se moverem livremente e são difíceis de montar para iniciantes. Embora a gravação extracelular multicanal tenha se mostrado uma tecnologia adequada e eficiente para medir a atividade neural durante testes comportamentais, não é fácil para iniciantes registrar e analisar os sinais adquiridos pelo complexo sistema de micro-drive. Dado que é difícil iniciar todo o processo de operação da gravação extracelular multicanal e análise de dados em camundongos que se movem livremente16,17, este artigo apresenta diretrizes simplificadas para introduzir o processo detalhado de fabricação do sistema de micro-drive usando componentes e configurações comumente disponíveis; os parâmetros no software comum para calcular os sinais spike e LFP de forma rápida e direta também são fornecidos. Além disso, neste protocolo, o mouse pode se mover livremente devido ao uso de um balão de hélio, o que contribui para compensar o peso do headstage e do sistema de micro-acionamento. De modo geral, no presente estudo, descrevemos como construir facilmente um sistema de micro-drive e otimizar os processos de registro e análise de dados.
Protocol
Representative Results
Discussion
A gravação multicanal em camundongos em movimento livre tem sido considerada uma tecnologia útil em estudos de neurociência, mas ainda é bastante desafiadora para iniciantes gravar e analisar os sinais. No presente estudo, fornecemos diretrizes simplificadas para a confecção de sistemas de microacionamento e implantação de eletrodos, bem como procedimentos simplificados para captura e análise de sinais elétricos via software de classificação spike e software para análise de dados neurofisiológicos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (31871170, 32170950 e 31970915), da Fundação de Ciências Naturais da Província de Guangdong (2021A1515010804 e 2023A1515010899), da Fundação de Ciências Naturais de Guangdong para o Projeto de Cultivo Principal (2018B030336001) e da Concessão Guangdong: Tecnologias-Chave para o Tratamento de Distúrbios Cerebrais (2018B030332001).
Materials
| 2.54 mm pin header | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 1 x 5 | Applying for the movable micro-drive which can slide on its stulls. |
| Adobe Illustrator CC 2017 | Adobe | N/A | To optimize images from GraphPad. |
| BlackRock Microsystems | Blackrock Neurotech | Cerebus | This systems includes headsatge, DA convert, amplifier and computer. |
| Brass nut | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 brass nut | The nut fixes the position of screw. |
| Brass screw | Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd. | M0.8 x 11 mm brass screw | A screw that hold the movable micro-drive. |
| C57BL/6J | Guangdong Zhiyuan Biomedical Technology Co., LTD. | N/A | 12 weeks of age. |
| Centrifuge tube | Biosharp | 15 mL; BS-150-M | To store mice brain with sucrose sulutions. |
| Conducting paint | Structure Probe, Inc. | 7440-22-4 | To improve the lead-connecting quality between connector pins and Ni-wires. |
| Conductive copper foil tape | 3M | 1181 | To reduce interferenc. |
| Connector | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 2 x 10P | To connect the headtage to micro-drive system. |
| DC Power supply | Maisheng | MS-305D | A power device for electrolytic lesion. |
| Dental cement | Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. | N/A | To fix the electrode arrays on mouse's skull after finishing the implantation. |
| Digital analog converter | Blackrock | 128-Channel | A device that converts digital data into analog signals. |
| Epoxy resin | Alteco | N/A | To cover pins. |
| Excel | Microsoft | N/A | To summarize data after analysis. |
| Eye scissors | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or cutting the Ni-chrome wire. |
| Fine forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery. |
| Forceps | JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd. | N/A | For surgery or assembling the mirco-drive system. |
| Freezing microtome | Leica | CM3050 S | Cut the mouse’s brain into slices |
| Fused silica capillary tubing | Zhengzhou INNOSEP Scientific Co., Ltd. | TSP050125 | To serve as the guide tubes for Ni-chrome wires. |
| Glass microelectrode | Sutter Instrument Company | BF100-50-10 | To mark the desired locations for implantation using the filled ink. |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad Software | N/A | To analyze and visualize the results. |
| Guide-tube | Polymicro technologies | 1068150020 | To load Ni-chrome wires. |
| Headstage | Blackrock | N/A | A tool of transmitting signals. |
| Helium balloon | Yili Festive products Co., Ltd. | 24 inch | To offset the weight of headstage and micro-drive system. |
| Ink | Sailor Pen Co.,LTD. | 13-2001 | To mark the desired locations for implantation. |
| Iodine tincture | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To disinfect mouse's scalp. |
| Lincomycin in Hydrochloride and Lidocaine hydrochloride gel | Hubei kangzheng pharmaceutical co., ltd. | 10g | A drug used to reduce inflammation. |
| Meloxicam | Vicki Biotechnology Co., Ltd. | 71125-38-7 | To reduce postoperative pain in mice. |
| Micromanipulators | Scientifica | Scientifica IVM Triple | For electrode arrays implantation. |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni-E | Capture the images of brain sections |
| nanoZ impedance tester | Plexon | nanoZ | To measure impedance or performing electrode impedance spectroscopy (EIS) for multichannel microelectrode arrays. |
| NeuroExplorer | Plexon | NeuroExplorer | A tool for analyzing the electrophysiological data. |
| NeuroExplorer | Plexon, USA | N/A | A software. |
| Ni-chrome wire | California Fine Wire Co. | M472490 | 35 μm Ni-chrome wire. |
| Offline Sorter | Plexon | Offline Sorter | A tool for sorting the recorded multi-units. |
| PCB board | Hangzhou Jiepei Information Technology Co., Ltd. | N/A | Computer designed board. |
| Pentobarbital | Sigma | P3761 | To anesthetize mice. |
| Pentobarbital sodium | Sigma | 57-33-0 | To anesthetize the mouse. |
| Peristaltic pump | Longer | BT100-1F | A device used for perfusion |
| Polyformaldehyde | Sangon Biotech | A500684-0500 | The main component of fixative solution for fixation of mouse brains |
| PtCl4 | Tianjin Jinbolan Fine Chemical Co., Ltd. | 13454-96-1 | Preparation for gold plating liquid. |
| Saline | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To clean the mouse's skull. |
| Silver wire | Suzhou Xinye Electronics Co., Ltd. | 2 mm diameter | Applying for ground and reference electrodes. |
| Skull drill | RWD Life Science | 78001 | To drill carefully two small holes on mouse's skull. |
| Stainless steel screws | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | M0.8 x 2 | To protect the micro-drive system and link the ground and reference electrodes. |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 68513 | To perform the stereotaxic coordinates of bilateral motor cortex. |
| Sucrose | Damao | 57-50-1 | To dehydrate the mouse brains after perfusion. |
| Super glue | Henkel AG & Co. | PSK5C | To fix the guide tube and Ni-chrome wire. |
| Temperature controller | Harvard Apparatus | TCAT-2 | To maintain mouse's rectal temperature at 37°C |
| Tetracycline eye ointment | Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | To protect the mouse's eyes during surgery. |
| Thread | Rapala | N/A | To link ballon and headstage. |
| Vaseline | Unilever plc | N/A | To cover the gap between electrode arrays and mouse's skull. |
References
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