Summary
Vi præsenterer en totrinsprotokol til mitokondrieisolering af høj kvalitet, der er kompatibel med proteinopdagelse og kvantificering på proteomskala. Vores protokol kræver ikke genteknologi og er derfor velegnet til at studere mitokondrier fra alle primære celler og væv.
Abstract
De fleste fysiologiske og sygdomsprocesser, fra central metabolisme til immunrespons til neurodegeneration, involverer mitokondrier. Mitokondrieproteomet består af mere end 1.000 proteiner, og overflod af hver kan variere dynamisk som reaktion på eksterne stimuli eller under sygdomsprogression. Her beskriver vi en protokol til isolering af mitokondrier af høj kvalitet fra primære celler og væv. Totrinsproceduren omfatter (1) mekanisk homogenisering og differentiel centrifugering for at isolere rå mitokondrier og (2) tagfri immunindfangning af mitokondrier for at isolere rene organeller og eliminere forurenende stoffer. Mitokondrieproteiner fra hvert oprensningstrin analyseres ved kvantitativ massespektrometri, og berigelsesudbytter beregnes, hvilket muliggør opdagelsen af nye mitokondrieproteiner ved subtraktiv proteomik. Vores protokol giver en følsom og omfattende tilgang til at studere mitokondrieindhold i cellelinjer, primære celler og væv.
Introduction
Mitokondrier er komplekse og dynamiske organeller, der er i stand til at mærke og tilpasse sig cellens metaboliske behov. Mitokondrier er centrale for kompleksiteten af cellulær metabolisme og fungerer som metaboliske knudepunkter, hvor kulhydrat-, protein-, lipid-, nukleinsyre- og co-faktormetabolismereaktioner konvergerer1. De tjener også som signalorganeller for veje for det medfødte immunrespons og som reaktion på ændringer i ioner og reaktive iltarter 2,3. Til dato er omkring 1.100 proteiner blevet kortlagt til mitokondrier 4,5,6, men vi kan antage, at mange flere stadig skal opdages, især dem, der kun udtrykkes i visse celletyper eller forbigående under specifikke miljøforhold. Udvikling af nye tilgange til kvantificering af ændringer i mitokondriesammensætning i metaboliske tilstande af interesse vil øge vores viden om disse organeller og fremhæve nye terapeutiske veje til de lidelser, der er karakteriseret ved mitokondriel dysfunktion7.
I øjeblikket er forskellige mitokondrieisoleringsprotokoller tilgængelige med forskellige udbytter og renhedsniveauer8. Centrifugeringsbaserede tilgange er de mest populære på grund af deres enkelhed og lave omkostninger. Selvom differentiel centrifugering er egnet til de fleste applikationer, har den den ulempe, at den opnår lavere mitokondriel renhed og kræver store mængder udgangsmateriale, når der anvendes mere komplekse densitetsgradientbaserede applikationer. I de senere år er der opstået nye metoder til mitokondrieisolering, såsom tagbaseret immunindfangning ("MITO-IP")9 og fluorescensaktiveret organelsortering10. Selvom begge procedurer kan generere prøver med høj renhed, kræver førstnævnte genteknologi til at mærke mitokondrier til affinitetsrensning, hvilket gør protokollerne uforenelige med primært materiale fra umodificerede organismer eller menneskelige donorer. I mellemtiden er sidstnævnte afhængig af adgang til flowcytometri og sorteringsinstrumenter. Kombination af forskellige isoleringsmetoder giver løftet om at generere mere robuste protokoller og øget renhed.
Her præsenterer vi en ny protokol for mitokondrieisolering baseret på kombinationen af to eksisterende metoder: (1) differentiel centrifugering for at isolere en rå mitokondriefraktion og (2) tagfri immunoptagelse af mitokondrier med superparamagnetiske perler kovalent bundet til antistoffer mod translocase af ydre mitokondriemembran 22 (Tomm22)11, et allestedsnærværende mitokondrielt ydre membranprotein (figur 1). Den procedure, vi beskriver, er kompatibel med kvantitativ proteinmassespektrometri, og fordi den er tagfri og ikke kræver genetisk manipulation, kan den anvendes på en bred vifte af forskningsmodeller, fra cellelinjer til kropsvæsker til hele dyrevæv. Desuden muliggør brugen af to trin i protokollen brugen af subtraktiv proteomics 6,12 til opdagelse af nye mitokondrieproteiner og undersøgelse af deres ekspression.
Protocol
Handsker skal altid bæres, og cellekulturtrin udføres under en laminar strømningshætte. Cellerne vedligeholdes i en 37 °C inkubator med 5% CO2. Den forskning, der præsenteres i denne protokol, blev godkendt og udført i overensstemmelse med universitetet i Lausanne og schweiziske retningslinjer for brug af dyr.
1. Kultur af RAW264.7 makrofagcellelinje
- Dyrk musemakrofagen RAW264.7-cellerne i Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) med høj glukose og glutamin suppleret med 5% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (HI-FBS) og 100 IE / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin (P / S).
BEMÆRK: For at isolere mitokondrier er en enkelt sammenflydende 15 cm plade (ca. 70 x 107 RAW264.7-celler) tilstrækkelig. - Vedligehold RAW264.7-cellerne i vævskulturplader. En indledende såtæthed på 1 x 105 celler / ml fører til en sammenflydende plade på 3 dage. Brug 25 ml cellesuspension i medier til en 15 cm plade. RAW264.7-celler har en høj celledelingshastighed og skal opdeles oftere end de fleste cellelinjer.
- Fjernelse af RAW264.7-celler
- Opsug mediet og vask cellerne en gang med fosfatbufret saltvand (PBS).
- Til en 15 cm plade tilsættes 8 ml varm RAW-dissociationsbuffer (270 mM kaliumchlorid, 30 mM natriumcitratdihydrat i H2O, sterilfiltreret) og inkuberes cellerne ved 37 °C i 5 minutter.
- Der tilsættes et tilsvarende volumen medier til pladerne (1:1 fortynding af dissociationsbufferen), og pipetten afmonteres og homogeniseres cellerne.
- Cellesuspensionen overføres til et konisk rør og centrifugeres glasset ved 300 x g i 3 minutter ved stuetemperatur.
- Supernatanten suges op, og pelletpen opslæmmes igen i en passende mængde medier (beskrevet i trin 1.1) til celletælling.
BEMÆRK: Andre metoder til at løsne RAW264.7-celler kan bruges, såsom trypsin eller en celleskraber. Disse metoder er imidlertid hårdere for cellerne og kan føre til deres polarisering i M1-lignende makrofager i dagene efter løsrivelse.
2. Isolering og dyrkning af knoglemarvsafledte makrofager (BMDM'er)
BEMÆRK: Protokollen beskrevet her er til en enkelt mus og kan skaleres op til flere mus. Detaljerede protokoller for BMDM-isolering og -dyrkning er beskrevet andetsteds13,14.
- Ofre en 8-12 uger gammel C57BL/6-mus med en høj dosis CO2.
BEMÆRK: Enten han- eller hunmus kan bruges. - Sprøjt musen med 75% ethanol for at sterilisere den.
- Disseker og saml hofter, lårben og skinneben fra musen15.
- For at samle knoglemarven fra lårbenene og tibierne skal du fjerne knæleddets ende af begge knogler15. Gendan knoglemarv fra hofterne ved at fjerne acetabulum.
- Overfør knoglerne til et 50 ml konisk rør med 4 ml BMDM-medier, der holdes på is (DMEM med høj glukose og glutamin suppleret med 5% HI-FBS, P / S og 10 mM HEPES).
BEMÆRK: Det er vigtigt at holde knoglerne i medierne for at undgå tørring af knoglemarven under dissektion. - Der tilsættes 4 ml PBS og 4 ml varmt BMDM-medie i to forskellige huller i en plade med 6 huller.
- Overfør knoglerne og mediet fra det 50 ml koniske rør til en tom brønd på 6-brøndpladen.
- Brug et par tang til at overføre knoglerne til PBS-brønden for at vaske dem.
- Overfør knoglerne til brønden, der indeholder varme BMDM-medier.
- Lav et hul på 1-2 mm i diameter i bunden af to 0,5 ml rør med tangen og læg dem i et 1,5 ml rør.
BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt at tilføje medier til røret til dette hurtige trin. - I hvert 0,5 ml rør skal du placere en lårben, skinneben og hofte på en sådan måde, at knoglemarven i de udsatte knogler vender mod bunden af rørene.
- Centrifuger glassene ved 13.000 x g i 1 min ved stuetemperatur for at opsamle knoglemarv og resterende medier gennem hullet i 0,5 ml røret og ind i 1,5 ml røret. Kassér 0,5 ml rørene med knoglerne.
- Resuspender knoglemarvpellets i BMDM-medier og overfør til et 15 ml konisk rør.
- Tilføj BMDM-medier op til 10 ml.
- Anbring en 40 μm cellesil på et 50 ml konisk rør og filtrer knoglemarvssuspensionen gennem det.
- Den filtrerede suspension centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur for at genvinde de intakte celler og fjerne små snavs fra cellesuspensionen.
- Forbered 70 ml BMDM-medier suppleret med 50 ng/ml makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF).
- Resuspender pellet i 10 ml M-CSF-suppleret BMDM-medie.
- Tilsæt 9 ml M-CSF-suppleret BMDM-medie til hver af de syv 10 cm petriskåle.
- Plade 1 ml celler (ca. 1 x 107 celler) i hver af de syv 10 cm petriskåle.
- Homogeniser cellesuspensionen i hver plade ved forsigtigt at pipettere op og ned på pladen og overfør pladerne til inkubatoren.
- Efter 3 dage tilsættes 5 ml varmt BMDM-medie suppleret med 50 ng/mL M-CSF til hver plade.
- Efter 3 dage (dag 6 efter knoglemarvsisolering) kontrolleres vedhæftning og differentiering af BMDM ved mikroskopi.
BEMÆRK: På dette tidspunkt er det muligt at gå direkte til mitokondrieisolering (trin 3). Alternativt kan man omlægge BMDM, hvilket gør det muligt at behandle dem med cytokiner og små molekyler. - Afmontering af BMDM'erne
- Mediet suges ud af hver plade, og der tilsættes 7 ml kold PBS suppleret med 5 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA).
- Inkuber cellerne ved 4 °C i 7-8 min.
- Afmonter BMDM'erne ved forsigtigt at pipettere op og ned med en 10 ml pipette.
- De resuspenderede BMDM'er fra alle syv plader samles i et enkelt 50 ml konisk rør og centrifugeres ved 300 x g i 3 minutter ved stuetemperatur.
- Supernatanten suges til syn, og cellerne resuspenderes i 40 ml varme BMDM-medier til celletælling.
BEMÆRK: Der opnås mellem 7-9 x 107 BMDM'er pr. Mus. Mindst 6 x 107 BMDM'er til mitokondrieisolering anbefales til proteomics. - Hvis det ønskes, plade og behandle BMDM'erne i henhold til det eksperimentelle mål. Hvis ikke, fortsæt direkte til trin 3.3.
3. Fremstilling af en rå mitokondriefraktion ved differentiel centrifugering
BEMÆRK: Udfør alle centrifugeringstrin ved 4 °C. Der kræves to centrifuger, den ene med en udsvingsrotor og adaptere til koniske rør med en relativ centrifugalkraft på mindst 300 x g, den anden med en relativ centrifugalkraft på mindst 21.000 x g, der er egnet til 1,5 ml rør. Når du bruger klæbende celler, skal du bruge en celleskraber.
- For klæbende celler aspireres mediet og tilsættes 10 ml PBS pr. 15 cm plade.
BEMÆRK: Skrabning af celler i PBS gør det muligt at vaske dem på samme tid. Hvis cellerne allerede er i suspensionen, fortsættes direkte til trin 3.3. - Fjern cellerne ved hjælp af en celleskraber og saml dem i et enkelt 50 ml konisk rør. Homogeniser cellesuspensionen ved pipettering op og ned.
BEMÆRK: Celler kan løsnes ved hjælp af en celleskraber, da dette er hurtigere, og de vil blive lyseret kort tid efter. - For hver eksperimentel tilstand overføres 5% af cellesuspensionsvolumenet til et 1,5 ml rør og centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Når du bruger suspensionsceller, skal du sørge for at vaske cellerne en gang med PBS før for at fjerne mulige forurenende stoffer fra mediet, såsom FBS. - Supernatanten kasseres, og pelletten opbevares på is.
BEMÆRK: Dette repræsenterer den "samlede celle" fraktion for proteomics. - Centrifuger resten af prøverne fra trin 3.1 eller 3.2 ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Udfør alle følgende trin på is og ved hjælp af iskolde buffere.
- Supernatanten suges op, og cellepelletsen opslæmmes igen i 5 ml iskold mitokondriebuffer (MB) (210 mM mannitol, 70 mM saccharose, 10 mM HEPES/NaOH [pH 7,4] og 1 mM EDTA).
- Cellerne genvindes ved centrifugering ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Resuspender cellepillen i 0,5 ml kold MB og overfør den til et 1,5 ml rør.
BEMÆRK: Denne procedure giver en omtrentlig cellekoncentration på 1,5 x 10 8 BMDM-celler/ml eller 3 x 108 RAW264,7-celler/ml. - Brug en 1 ml sprøjte forsynet med en 25 G kanyle homogeniseres cellesuspensionen med 30 gange gennem kanylen (figur 1A).
- Tilsæt 1 ml kold MB til røret og bland ved invertering. Den homogeniserede cellesuspension centrifugeres ved 2.000 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- 1 ml supernatant overføres til et frisk 1,5 ml rør på is uden at forstyrre cellepellet. Resuspender cellepelleten og homogeniser den igen, som i trin 3.7.
- Den homogeniserede cellepellet og supernatanten fra de to foregående trin samles i et enkelt 1,5 ml rør, og det centrifugeres ved 2 000 x g i 5 minutter ved 4 °C.
BEMÆRK: På dette tidspunkt indeholder pelleten for det meste kerner og ubrudte celler og kasseres. Supernatanten indeholder celleaffald, cytosol og organeller, herunder mitokondrier (figur 1B). - Supernatanten deles mellem fire 1,5 ml reagensglas.
BEMÆRK: Opdeling af supernatanten mellem flere reagensglas på dette trin forbedrer fjernelsen af forurenende stoffer i de følgende trin. - Tilføj MB for at lave et endeligt volumen på 1 ml i hvert af de fire rør. Glassene blandes på skift og centrifugeres ved 13.000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
BEMÆRK: Efter dette trin er en pellet med to lag synlig. Den bunde, faste, brune pellet indeholder mitokondrier og opbevares til yderligere rensning (figur 1C). Den øverste, løse, hvide pellet indeholder andre cellulære strukturer og kan kasseres. - Udfør dette trin omhyggeligt. Supernatanten fjernes med så meget af den hvide øvre pellet som muligt. Ved forsigtigt pipettering på den er det muligt at resuspendere den hvide pellet og derefter kassere den, hvilket efterlader den brune mitokondriepille intakt.
- Hold et af de fire rør med mitokondriepellet på is. Dette repræsenterer fraktionen "rå mitokondrier" for proteomics.
- Saml de tre andre pellets i et 1,5 ml rør i et endeligt volumen på 1 ml MB.
4. Superparamagnetisk antistofbaseret oprensning af mitokondrier
BEMÆRK: Udfør alle følgende trin i et kølerum ved 4 °C.
- Overfør 1 ml af det rå mitokondriepræparat fra trin 3.18 til et 15 ml konisk rør og tilsæt 7 ml MB suppleret med 150 mM NaCl (MB + NaCl).
BEMÆRK: Tilsætningen af NaCl forbedrer antistofbindingen og reducerer ikke-specifik binding af forurenende stoffer til perlerne og til mitokondrier. - Der tilsættes 50 μL Tomm22-perler til 8 ml rå mitokondrieopslæmning (figur 1D), og røret inkuberes i 15 minutter ved 4 °C på et roterende hjul ved lav hastighed.
BEMÆRK: Tomm22-perler er kovalent bundet til Tomm22 monoklonale antistoffer hævet i mus, koblet til superparamagnetiske perler. - I mellemtiden skal du placere en søjle på magneten.
- Afbalancer kolonnen med 8 ml MB + NaCl, og kassér gennemstrømningen.
- Efter 15 minutters inkubation ved 4 °C af prøven med Tomm22-perlerne overføres prøven til kolonnen. Kassér gennemstrømningen.
BEMÆRK: Mitokondrier forbliver fastgjort til de magnetiske perler i kolonnen (figur 1E). - Vask kolonnen tre gange med 8 ml MB + NaCl.
- Fjern søjlen fra magneten og læg den i et 15 ml konisk rør.
- Eluer mitokondrierne ved at tilføje 1,5 ml MB + NaCl til søjlen og påfør straks et stempel for at eluere de rensede mitokondrier i røret.
- De eluerede mitokondrier overføres til et 1,5 ml rør og centrifugeres ved 21.000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
BEMÆRK: Der dannes en brun pellet. Dette indeholder de isolerede mitokondrier og nogle af de antistofkoblede perler (figur 1F). - Supernatanten fjernes forsigtigt fra pelleten. Pelleten repræsenterer fraktionen "rene mitokondrier" for proteomics. Denne pellet sammen med pellets fra trin 3.4 og 3.17 kan opbevares ved -20 °C og er klar til downstream-applikationer.
Representative Results
Tre prøver med stigende grader af mitokondriel renhed genereres i denne protokol: samlede celler, rå mitokondrier ("mito-rå") og rene mitokondrier ("mito-ren") (figur 1). Vi validerede oprensningen af mitokondrier fra RAW264.7 makrofagcellelinjen ved at indlæse lige store proteinmængder af hver fraktion på en gel og immunoblotting og fandt ud af, at mitokondriecitratsyntase (Cs) blev beriget ved hvert oprensningstrin; i mellemtiden forsvandt proteiner fra cytosolen (GAPDH), plasmamembranen (Na / K ATPase), kernen (Lamin B), lysosomerne (Lamp1) og det endoplasmatiske retikulum (ER) (Pdi) gradvist (figur 2A). Lignende resultater blev opnået ved anvendelse af BMDM'er. For yderligere validering af renheden og integriteten af de isolerede mitokondrier blev elektronmikroskopi på den rene mitokondriefraktion udført. Vi observerede mitokondrier med en klassisk oval form og intakt cristae omgivet af elektrontætte partikler svarende til de antistofbelagte perler (figur 2B). Derfor kan det konkluderes, at vores protokol beriger mitokondrier, udtømmer andre cellulære komponenter og opretholder mitokondriel strukturel integritet.
Dernæst blev der udført en proteomanalyse af hver fraktion ved hjælp af væskekromatografi koblet til massespektrometri (LC / MS). I alt 6.248 proteiner i ekstraktet fra samlede celler, hvoraf 907 tidligere var annoteret som mitokondrie i MitoCarta3.0-opgørelsen5, blev identificeret. Efter filtrering for proteiner med en tærskel på mindst to unikke peptider beregnede vi en berigelsesscore for hvert protein i hver prøve baseret på deres intensitet sammenlignet med samlede celler. Vi tildelte derefter proteinerne til syv store subcellulære rum: mitokondrier, ER, lysosomer, Golgi-apparater, cytoskelet, kerne og cytosol ved hjælp af genontologi (GO) 16,17 og MitoCarta3.05 som referencer. Det er vigtigt, at der blev observeret en gennemsnitlig berigelse for mitokondrieproteiner på mere end 10 gange og mere end 20 gange i henholdsvis rå og rene mitokondriefraktioner (figur 2C). I modsætning hertil blev komponenter i de andre seks cellulære rum, der blev analyseret, udtømt under rensningsproceduren. Af særlig opmærksomhed observerede vi i den rå mitokondriefraktion en forbigående berigelse for ER- og lysosomale proteiner, to klasser af forurenende proteiner, der ofte er til stede efter differentielle centrifugeringsprotokoller18. Dette skyldtes muligvis organel-organelinteraktioner og lignende sedimenteringskoefficienter, især for lysosomer, som er meget rigelige i makrofager19. Mens begge for det meste var udtømt efter immunoptagelse, detekterede vi et lille signal for proteiner fra ER-mitokondriekontaktstederne i mito-ren fraktionen.
Derefter sammenlignede vi direkte proteinmængden fra de samlede celler og fra mito-rene prøver og observerede to forskellige populationer, svarende til mitokondrie og ikke-mitokondrieproteiner (figur 2D). Mens langt størstedelen af MitoCarta-proteiner klyngede sig sammen, fandt vi nogle få (<5%), der klyngede sig med ikke-MitoCarta-proteiner. Disse proteiner kan repræsentere (1) cytosoliske mitokondrie-interagerende proteiner (en ny kategori kommenteret i version 3.0 af MitoCarta), (2) dobbeltlokaliserede proteiner eller (3) forkert annoterede proteiner. Omvendt fandt vi et par tilfælde af ikke-MitoCarta-proteiner, der klynger sig sammen med mitokondrieproteiner. Mens sådanne proteiner kan repræsentere forurenende stoffer i isolationsproceduren, kan de også repræsentere proteiner, der ikke tidligere er klassificeret som værende til stede i mitokondrier.
For at undersøge denne nye klasse af potentielle mitokondrieproteiner, subtraktiv proteomics, blev en tilgang, der har vist sig nyttig til opdagelsen af organellære proteomer, herunder mitokondrier 6,12, brugt. Subtraktiv proteomics antager, at mitokondrier skal blive beriget under rensningstrinnene, og forurenende stoffer skal blive udtømt6. For eksempel, mens forurenende stoffer kan akkumulere under differentiel centrifugering (f.eks. På grund af lignende sedimenteringsegenskaber) eller under immunindfangning (f.eks. På grund af ikke-specifik antistofbinding), bør kun bona fide mitokondrieproteiner akkumuleres signifikant i begge. Det er således muligt at filtrere proteiner, der blev fundet i den rene mitokondriefraktion, men viste inkonsekvente mønstre af berigelse. I det nuværende eksempel med RAW264.7-celler var vi ved at sætte en tærskel for unikke peptider på ≥1 for mito-rå og mito-rene prøver og ved hjælp af strenge tærskler for berigelse i stand til at forfine listen over genvundne mitokondrieproteomer fra 1.127 proteiner, der oprindeligt blev fundet i den rå mitokondriefraktion efter differentiel centrifugering, ned til 481 proteiner efter den anden oprensningsrunde ved hjælp af Tomm22-immunoselektion. Det reducerede antal MitoCarta-annoterede proteiner i mito-ren fraktion afspejler den høje stringens, der anvendes til udvælgelse. Interessant nok var 70 af proteinerne til stede i mito-ren fraktionen ikke til stede i MitoCarta3.0-opgørelsen (figur 3A, B). Disse sidstnævnte proteiner kan repræsentere potentielle nye mitokondriekandidatproteiner, som kun kan udtrykkes i RAW264.7-makrofagcellelinjen og i beslægtede celler, og som fortjener yderligere undersøgelse.
Figur 1: Illustration af totrins-, tag-fri mitokondrieisolationsprotokol . (A) En cellesuspension forstyrres gennem en 25 G kanyle. B) Kerner og hele celler separeres ved centrifugering ved 2 000 x g , og supernatanten gemmes. C) Rå mitokondrier isoleres ved differentiel centrifugering af supernatanten ved 13 000 x g (mito-rå). (D) Rå mitokondrier inkuberes derefter med Tomm22-antistoffer (Ab), der er kovalent forbundet med superparamagnetiske perler. (E) Mitokondrier-Tomm22-antistof-perlekomplekserne adskilles fra forurenende stoffer ved hjælp af magnetiske søjler og elueres. (F) Rene mitokondrier opsamles og koncentreres ved centrifugering (mito-ren). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2. Repræsentative resultater af mitokondrieisolering fra to makrofagkilder. (A) Proteinimmunoblotanalyse af RAW264.7 (øverst) og BMDM-celler (nederst) ved hjælp af antistoffer mod mitokondriecitratsyntase (Cs - mitokondrier), glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (Gapdh - cytosol), natrium-kaliumpumpe (Na/K ATPase - plasmamembran), Lamin B (Lamin B-kerne), lysosomalassocieret membranprotein 1 (Lamp1 - lysosom) og proteindisulfid-isomerase (Pdi - ER). (B) Elektronmikroskopi af oprensede mitokondrier fra RAW264.7-celler. Højdensitetspartikler omkring mitokondrier svarer til Tomm22-perlerne, der bæres videre med mito-rene prøver efter eluering fra søjlerne. Skalastænger: 80 nm. (C) Berigelsesscore på tværs af samlede celler, mito-rå og mito-ren fra syv cellulære rum i RAW264.7-celler. MitoCarta3.0 og GO blev brugt til proteinannotation, og de gennemsnitlige score er repræsenteret. Forkortelse: ER = endoplasmatisk retikulum. (D) Proteintæthedsværdier (riBAQ) for proteiner i samlede celler og mito-rene prøver fra RAW264.7-celler. MitoCarta3.0 proteiner er vist i orange. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3. Opdagelse af nye mitokondrieproteiner ved hjælp af subtraktiv proteomics. A) Subtraktiv proteomics-strategi til opdagelse af nye mitokondrieproteiner. Der anvendes høje udvælgelsestærskler (4x og 2x) for at minimere udvælgelsen af falske positiver. (B) Berigelsesudbytter (fold af samlede celler) af nye mitokondriekandidatproteiner, der ikke tidligere er kommenteret i MitoCarta3.0-opgørelsen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Vi har kombineret differentiel centrifugering og immunindfangning for at opnå en forbedret renhed for mitokondrieisolering. Vores procedure giver adgang til primært materiale til identifikation og karakterisering af nye mitokondrieproteiner. Protokollen er ligetil og robust og kan anvendes på cellelinjer, primære celler og væv uden behov for genetisk modifikation. Vi har valideret vores protokol ved immunoblotting og proteomics analyser på prøver taget på forskellige stadier i løbet af rensningsproceduren.
Sammenlignet med enkeltisoleringsmetoder genererer kombinationen af berigelsestrin af forskellig art - her centrifugering og immunmærkning - en mere robust protokol til isolering af mitokondrier. Dette skyldes, at mens mitokondrieproteiner vil blive beriget i begge rensninger, er det usandsynligt, at forurenende stoffer også vil blive beriget efter begge berigelsestrin. Selvom høj mitokondriel renhed også kan opnås ved densitetsgradient ultracentrifugering, kræver denne tilgang en stor mængde udgangsmateriale og adgang til en ultracentrifuge. Endelig kræver vores tilgang i modsætning til nyere metoder baseret på tagbaseret mitokondrieisolering20 ikke genetisk modifikation af prøven, hvilket gør den velegnet til primært materiale fra enhver kilde.
Nogle tekniske og biologiske overvejelser skal tages i betragtning i det eksperimentelle design, når vi anvender vores protokol. (1) Mængden af udgangsmateriale er kritisk for at opnå tilstrækkeligt materiale. Uundgåeligt vil et lille antal mitokondrier gå tabt under homogenisering (trin 3.10), da ikke alle celler lyseres eller under de tre søjlevasker (trin 4.6). Mens vores protokol fokuserer på renhed frem for udbytte, er effektiviteten af mitokondrieisolering og dermed deres udbytte ikke blevet målt eller optimeret. Brug af flere Tomm22-perler og flere søjler forventes at øge udbyttet af mitokondriegendannelse. Samtidig kan en grundig optimering af homogeniseringstrinnet også føre til forbedret mitokondrieudbytte. Denne protokol og de indledende cellenumre, vi rapporterer her for RAW264.7-celler og BMDM'er, er tilstrækkelige til proteomics og kan justeres til andre applikationer. I tilfælde af primære BMDM'er fandt vi, at en enkelt mus var tilstrækkelig til en replikat. Når det er nødvendigt, kan proceduren skaleres op for at isolere BMDM'er fra flere dyr, som derefter kan samles for at opnå tilstrækkeligt materiale. Cellenummeret kan optimeres afhængigt af celletypen, dens størrelse og dens mitokondrieindhold. (2) Tomm22 udtrykkes på mitokondrier fra alle celletyper og væv21, men udtryksniveauet kan variere. Når man designer et eksperiment til sammenligning af forskellige forhold, er det derfor vigtigt at sikre, at ekspressionsniveauerne for Tomm22 er sammenlignelige. På grund af den allestedsnærværende ekspression af Tomm22 er det desuden ikke muligt at studere celletypespecifikke mitokondrieproteiner i komplekse væv. (3) Den tid, det tager at generere rene mitokondrier (ca. 2,5 timer), er uforenelig med en undersøgelse af forbigående hændelser, såsom ændringer i metaboliske profiler. I dette tilfælde anbefaler vi direkte tagbaseret immunindfangning9, som også gør det muligt at studere celletypespecifikke mitokondrier in vivo20. (4) Selvom undersøgelser af isolerede mitokondrier opnået ved hjælp af Tomm22-antistofmærkede perler alene har vist aktivitet i funktionelle assays11, er det endnu ikke fastslået, om mitokondrier, der genereres med vores protokol, er kompatible med downstream-aktivitetsbaserede assays. MitoTracker eller tetramethylrhodamin methylester perchlorat (TMRM) farvning eller respirometri målinger er potentielle tilgange til kvantificering af funktionaliteten af isolerede mitokondrier22. (5) Efter eluering af den "mitorene" prøve fra kolonnen vil nogle Tomm22-perler være til stede i den rene mitokondriefraktion (Figur 2B). Selvom vi ikke har observeret nogen interferens med trypsinfordøjelsen og proteinmassespektrometrien, bør tilstedeværelsen af disse perler og immunglobulinerne tages i betragtning i andre downstream-applikationer. Tomm22-antistoffet er et monoklonalt antistof produceret i mus23, og derfor er det vigtigt at huske på, at når der anvendes sekundære antistoffer mod mus i immunoblotting, vil det generere uspecifikke bånd på størrelse med immunglobulinkæderne. (6) Fuldstændig homogenisering af cellesuspensionen er nøglen til en vellykket isolering af mitokondrier. Her bruger vi en sprøjte med en 25 G nål til at lyse både RAW264.7 celler og BMDM'er. Afhængigt af celletypen og dens størrelse kan andre mekaniske homogeniseringsmetoder, såsom anvendelse af en Dounce-homogenisator eller mere kontrollerede tilgange som cellehomogeniseringsenheder, imidlertid være mere egnede. Ikke-mekaniske homogeniseringsmetoder, såsom blid sonikering, kan også overvejes. Vævshomogeniseringsmetoder diskuteres yderligere i andre undersøgelser24,25. (7) Selv om validering ved hjælp af immunblotting er den mest enkle og billigere metode, korrelerer resultaterne heraf ikke altid med ændringer på hele organelniveau. Derfor anbefaler vi at bruge proteomics til fuldt ud at validere berigelsen eller udtømningen af henholdsvis mitokondrier og andre organeller.
To-trins mitokondrierensningsprotokollen, der er beskrevet her, har gjort det muligt for os at generere sekventielle prøver med stigende mitokondriel renhed, og dette har gjort det muligt for os at opdage nye mitokondrieproteinkandidater gennem subtraktiv proteomics12. Til vores analyse bruger vi strenge tærskler til at selektere for signifikant berigede mitokondrieproteiner, og selvom dette muligvis ikke identificerer nogle kendte mitokondrieproteiner (figur 3A), reduceres den falsk-positive rate for opdagelse af nyt mitokondrieprotein. Ikke desto mindre er det vigtigt at understrege, at alle kandidatproteiner, der afsløres af vores protokol, skal valideres gennem ortogonale tilgange. Vi anbefaler carboxy-terminal GFP-mærkning eller brug af antistoffer mod det endogene protein for at validere association med mitokondrier enten mikroskopisk eller ved proteasebeskyttelsesassays.
Den direkte anvendelse af vores metode i tilfælde af umodificerede celler og væv tilbyder et kraftfuldt værktøj til at undersøge, hvordan mitokondrier ændrer sig og tilpasser sig deres miljø under sunde og sygdomsforhold. Anvendelse af vores protokol til cellelinjer, dyresygdomsmodeller, humane væsker og endda biopsier fra kirurgi kan vise sig at være særligt nyttige til at forbedre vores forståelse af mitokondrier og deres tilknyttede lidelser.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Manfredo Quadroni, proteinanalysefaciliteten og elektronmikroskopifaciliteten ved universitetet i Lausanne for deres hjælp. Vi takker også H.G. Sprenger, K. Maundrell og medlemmer af Jourdain-laboratoriet for råd og feedback på manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af Foundation Pierre-Mercier pour la Science og Swiss National Science Foundation (projektbevilling 310030_200796).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD Plastipal | 309628 | |
| 25 G Needle | BD Microlance | 300400 | |
| 40 µm cell strainer | Corning | 352340 | |
| Anti-TOM22 Microbeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-127-693 | |
| Cell scraper | FisherScientific | 11577692 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | ThermoFisher | 31966 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | FisherScientific | BP-120-1 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270 | |
| HEPES | BioConcept | 5-31F00-H | |
| LS columns and plungers | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Macrophage colony-stimulating factor | Immunotools | 12343115 | |
| Mannitol | Sigma | M4125 | |
| Sodium chloride | Sigma | 71380 | |
| Sucrose | Sigma | S1888 | |
| Penicillin/Streptomycin | BioConcept | 4-01F00-H | |
| Petri dishes | Corning | BH93B-102 | |
| Phosphate-buffered saline 10X | Eurobio Scientific | CS3PBS01-01 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Vi-CELL BLU Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter | C19196 |
References
- Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
- West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S.
- Chakrabarty, R. P., Chandel, N. S. Mitochondria as signaling organelles control mammalian stem cell fate. Cell Stem Cell. 28 (3), 394-408 (2021).
- Morgenstern, M., et al. Quantitative high-confidence human mitochondrial proteome and its dynamics in cellular context. Cell Metabolism. 33 (12), 2464-2483 (2021).
- Rath, S., et al. MitoCarta3.0: an updated mitochondrial proteome now with sub-organelle localization and pathway annotations. Nucleic Acids Research. 49, D1541-D1547 (2021).
- Pagliarini, D. J., et al. A mitochondrial protein compendium elucidates complex I disease biology. Cell. 134 (1), 112-123 (2008).
- Diaz-Vegas, A., et al. Is mitochondrial dysfunction a common root of noncommunicable chronic diseases. Endocrine Reviews. 41 (3), 005 (2020).
- Bury, A. G., Vincent, A. E., Turnbull, D. M., Actis, P., Hudson, G. Mitochondrial isolation: when size matters. Wellcome Open Research. 5, 226 (2020).
- Chen, W. W., Freinkman, E., Sabatini, D. M. Rapid immunopurification of mitochondria for metabolite profiling and absolute quantification of matrix metabolites. Nature Protocols. 12 (10), 2215-2231 (2017).
- Daniele, J. R., Heydari, K., Arriaga, E. A., Dillin, A. Identification and characterization of mitochondrial subtypes in Caenorhabditis elegans via analysis of individual mitochondria by flow cytometry. Analytical Chemistry. 88 (12), 6309-6316 (2016).
- Franko, A., et al. Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads. PLoS One. 8 (12), e82392 (2013).
- Yates, J. R., Gilchrist, A., Howell, K. E., Bergeron, J. J. M. Proteomics of organelles and large cellular structures. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (9), 702-714 (2005).
- Trouplin, V., et al.
- Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages. Journal of Visualized Experiments. (76), e50323 (2013).
- Toda, G., Yamauchi, T., Kadowaki, T., Ueki, K. Preparation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice for functional analysis. STAR Protocols. 2 (1), 100246 (2020).
- Gene Ontology Consortium. The Gene Ontology resource: enriching a GOld mine. Nucleic Acids Research. 49, D325-D334 (2021).
- Ashburner, M., et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nature Genetics. 25 (1), 25-29 (2000).
- Hartwig, S., et al. A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation. Proteomics. 9 (11), 3209-3214 (2009).
- Delamarre, L., Pack, M., Chang, H., Mellman, I., Trombetta, E. S. Differential lysosomal proteolysis in antigen-presenting cells determines antigen fate. Science. 307 (5715), 1630-1634 (2005).
- Bayraktar, E. C., et al. MITO-Tag mice enable rapid isolation and multimodal profiling of mitochondria from specific cell types in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (1), 303-312 (2019).
- Nusinow, D. P., et al. Quantitative proteomics of the cancer cell line encyclopedia. Cell. 180 (2), 387-402 (2020).
- Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
- Hornig-Do, H. T., et al. Isolation of functional pure mitochondria by superparamagnetic microbeads. Analytical Biochemistry. 389 (1), 1-5 (2009).
- Liao, P. C., Bergamini, C., Fato, R., Pon, L. A., Pallotti, F. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Methods in Cell Biology. 155, 3-31 (2020).
- Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods in Enzymology. 457, 349-372 (2009).
