Summary
Vi presenterar ett tvåstegsprotokoll för högkvalitativ mitokondriisolering som är kompatibel med proteinupptäckt och kvantifiering i proteomskala. Vårt protokoll kräver ingen genteknik och är därför lämpligt för att studera mitokondrier från alla primära celler och vävnader.
Abstract
De flesta fysiologiska och sjukdomsprocesser, från central metabolism till immunsvar mot neurodegeneration, involverar mitokondrier. Det mitokondriella proteomet består av mer än 1000 proteiner, och överflödet av var och en kan variera dynamiskt som svar på yttre stimuli eller under sjukdomsprogression. Här beskriver vi ett protokoll för att isolera högkvalitativa mitokondrier från primära celler och vävnader. Tvåstegsförfarandet omfattar (1) mekanisk homogenisering och differentialcentrifugering för att isolera råa mitokondrier och (2) taggfri immuninfångning av mitokondrier för att isolera rena organeller och eliminera föroreningar. Mitokondriella proteiner från varje reningssteg analyseras med kvantitativ masspektrometri och anrikningsutbyten beräknas, vilket möjliggör upptäckt av nya mitokondriella proteiner genom subtraktiv proteomik. Vårt protokoll ger ett känsligt och omfattande tillvägagångssätt för att studera mitokondriellt innehåll i cellinjer, primära celler och vävnader.
Introduction
Mitokondrier är komplexa och dynamiska organeller som kan känna av och anpassa sig till cellens metaboliska behov. Centralt för komplexiteten i cellulär metabolism fungerar mitokondrier som metaboliska nav där kolhydrat-, protein-, lipid-, nukleinsyra- och co-faktormetabolismreaktioner konvergerar1. De fungerar också som signalorganeller för vägar för det medfödda immunsvaret och som svar på förändringar i joner och reaktiva syrearter 2,3. Hittills har cirka 1 100 proteiner kartlagts till mitokondrier 4,5,6, men vi kan anta att många fler återstår att upptäcka, särskilt de som endast uttrycks i vissa celltyper eller tillfälligt under specifika miljöförhållanden. Att utveckla nya metoder för att kvantifiera förändringar i mitokondriell sammansättning i metaboliska tillstånd av intresse kommer att öka vår kunskap om dessa organeller och belysa nya terapeutiska vägar för de störningar som kännetecknas av mitokondriell dysfunktion7.
För närvarande finns olika mitokondriisoleringsprotokoll tillgängliga, med olika utbyten och renhetsnivåer8. Centrifugeringsbaserade metoder är de mest populära på grund av deras enkelhet och låga kostnader. Även om differentialcentrifugering är lämplig för de flesta tillämpningar, har den nackdelen att den uppnår lägre mitokondriell renhet och kräver stora mängder utgångsmaterial när mer komplexa densitetsgradientbaserade applikationer används. Under senare år har nya metoder för mitokondriisolering dykt upp, såsom tag-based immune capture ("MITO-IP")9 och fluorescensaktiverad organellsortering10. Även om båda förfarandena kan generera prover med hög renhet, kräver den förra genteknik för att märka mitokondrier för affinitetsrening, vilket gör protokollen oförenliga med primärmaterial från omodifierade organismer eller mänskliga givare. Under tiden är den senare beroende av tillgång till flödescytometri och sorteringsinstrument. Att kombinera olika isoleringsmetoder ger löfte om att generera mer robusta protokoll och ökad renhet.
Här presenterar vi ett nytt protokoll för mitokondriisolering baserat på kombinationen av två befintliga metoder: (1) differentiell centrifugering för att isolera en rå mitokondriell fraktion, och (2) tagfri immuninfångning av mitokondrier med superparamagnetiska pärlor kovalent bundna till antikroppar mot translokas av yttre mitokondriellt membran 22 (Tomm22)11, ett allestädes närvarande mitokondriellt yttermembranprotein (Figur 1). Förfarandet vi beskriver är kompatibelt med kvantitativ proteinmasspektrometri, och eftersom det är taggfritt och inte kräver genetisk manipulation kan det tillämpas på ett brett spektrum av forskningsmodeller, från cellinjer till kroppsvätskor till hela djurvävnader. Dessutom möjliggör användningen av två steg i protokollet användningen av subtraktiv proteomik 6,12 för upptäckt av nya mitokondriella proteiner och studier av deras uttryck.
Protocol
Handskar måste alltid bäras och cellodlingssteg utföras under en laminär flödeshuv. Cellerna hålls i en 37 °C inkubator med 5% CO2. Forskningen som presenteras i detta protokoll godkändes och utfördes i enlighet med universitetet i Lausanne och schweiziska riktlinjer för användning av djur.
1. Odling av RAW264.7 makrofagcellinje
- Odla mössens makrofag RAW264.7-celler i Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) med hög glukos och glutamin kompletterat med 5% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (HI-FBS) och 100 IE / ml penicillin och 100 μg / ml streptomycin (P / S).
OBS: För att isolera mitokondrier är en enda sammanflytande 15 cm platta (ca 70 x 10 7 RAW264.7 celler) tillräcklig. - Underhåll RAW264.7-cellerna i vävnadsodlingsplattor. En initial sådddensitet på 1 x 105 celler / ml leder till en sammanflytande platta på 3 dagar. Använd 25 ml cellsuspension i media för en 15 cm platta. RAW264.7-celler har en hög celldelningshastighet och måste delas oftare än de flesta cellinjer.
- Koppla från RAW264.7-celler
- Aspirera mediet och tvätta cellerna en gång med fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Tillsätt 8 ml varm RAW-dissociationsbuffert (270 mM kaliumklorid, 30 mM natriumcitratdihydrat iH2O, sterilfiltrerad) och inkubera cellerna vid 37 °C i 5 minuter.
- Tillsätt en motsvarande volym media till plattorna (1:1 utspädning av dissociationsbufferten) och pipettera för att lossa och homogenisera cellerna.
- Överför cellsuspensionen till ett koniskt rör och centrifugera röret vid 300 x g i 3 minuter vid rumstemperatur.
- Aspirera supernatanten och suspendera pelleten på nytt i en lämplig mängd media (beskrivs i steg 1.1) för cellräkning.
OBS: Andra metoder för att lossa RAW264.7-celler kan användas, såsom trypsin eller en cellskrapa. Dessa metoder är dock hårdare på cellerna och kan leda till deras polarisering till M1-liknande makrofager dagarna efter lossning.
2. Isolering och odling av benmärgshärledda makrofager (BMDM)
Protokollet som beskrivs här är för en enda mus och kan skalas upp för flera möss. Detaljerade protokoll för BMDM-isolering och kultur har beskrivits någon annanstans13,14.
- Offra en 8-12 veckor gammal C57BL / 6-mus med en hög dos CO2.
OBS: Antingen manliga eller kvinnliga möss kan användas. - Spraya musen med 75% etanol för att sterilisera den.
- Dissekera och samla höfter, lårben och skenben från musen15.
- För att samla benmärgen från lårbenen och skenbenet, ta bort knäledsänden på båda benen15. Återställ benmärgen från höfterna genom att ta bort acetabulum.
- Överför benen till ett 50 ml koniskt rör med 4 ml BMDM-media som hålls på is (DMEM med hög glukos och glutamin kompletterat med 5% HI-FBS, P / S och 10 mM HEPES).
OBS: Det är viktigt att hålla benen i media för att undvika torkning av benmärgen under dissektion. - Tillsätt 4 ml PBS och 4 ml varmt BMDM-medium i två olika brunnar på en 6-brunnsplatta.
- Överför benen och mediet från 50 ml koniska röret till en tom brunn på 6-brunnsplattan.
- Använd ett par pincett, överför benen till PBS-brunnen för att tvätta dem.
- Överför benen till brunnen som innehåller varmt BMDM-medium.
- Gör ett hål med 1-2 mm i diameter i botten av två 0,5 ml rör med pincetten och placera dem i ett 1,5 ml rör.
OBS: Det är inte nödvändigt att lägga till media i röret för detta snabba steg. - I varje 0,5 ml rör, placera ett lårben, skenben och höft på ett sådant sätt att benmärgen i de exponerade benen vetter mot botten av rören.
- Centrifugera rören vid 13 000 x g i 1 min vid rumstemperatur för att samla benmärgen och kvarvarande media genom hålet på 0,5 ml röret och in i 1,5 ml röret. Kassera 0,5 ml rören med benen.
- Resuspendera benmärgspellets i BMDM-media och överför till ett 15 ml koniskt rör.
- Lägg till BMDM-media upp till 10 ml.
- Placera en 40 μm cellsil på ett 50 ml koniskt rör och filtrera benmärgssuspensionen genom den.
- Centrifugera den filtrerade suspensionen vid 300 x g i 5 minuter vid rumstemperatur för att återvinna de intakta cellerna och avlägsna små skräp från cellsuspensionen.
- Bered 70 ml BMDM-media kompletterat med 50 ng/ml makrofagkolonistimulerande faktor (M-CSF).
- Återsuspendera pelleten i 10 ml M-CSF-kompletterat BMDM-medium.
- Tillsätt 9 ml M-CSF-kompletterat BMDM-medium till var och en av de sju 10 cm petriskålarna.
- Platta 1 ml celler (cirka 1 x 107 celler) i var och en av de sju 10 cm petriskålarna.
- Homogenisera cellsuspensionen i varje platta genom att försiktigt pipettera upp och ner på plattan och överför plattorna till inkubatorn.
- Efter 3 dagar, tillsätt 5 ml varmt BMDM-medium kompletterat med 50 ng/mL M-CSF till varje platta.
- Efter 3 dagar (dag 6, efter benmärgsisolering), verifiera vidhäftning och differentiering av BMDM genom mikroskopi.
OBS: Vid denna tidpunkt är det möjligt att fortsätta direkt till mitokondriisolering (steg 3). Alternativt kan man platta om BMDM, vilket gör det möjligt att behandla dem med cytokiner och små molekyler. - Koppla bort BMDM:erna
- Aspirera mediet från varje platta och tillsätt 7 ml kall PBS kompletterad med 5 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA).
- Inkubera cellerna vid 4 °C i 7–8 minuter.
- Lossa BMDM:erna genom att försiktigt pipettera upp och ner med en 10 ml pipett.
- Slå samman de återsuspenderade BMDM:erna från alla sju plattorna i ett enda 50 ml koniskt rör och centrifugera vid 300 x g i 3 minuter vid rumstemperatur.
- Aspirera supernatanten och suspendera cellerna i 40 ml varmt BMDM-medium för cellräkning.
OBS: Mellan 7-9 x 107 BMDM erhålls per mus. Minst 6 x 107 BMDM för mitokondriisolering rekommenderas för proteomik. - Om så önskas, platta och behandla BMDM enligt experimentmålet. Om inte, fortsätt direkt till steg 3.3.
3. Beredning av en obearbetad mitokondriell fraktion genom differentialcentrifugering
Observera: Utför alla centrifugeringssteg vid 4 °C. Två centrifuger krävs, en med en utsvängbar rotor och adaptrar för koniska rör med en relativ centrifugalkraft på minst 300 x g, den andra med en relativ centrifugalkraft på minst 21 000 x g lämplig för 1,5 ml rör. Använd en cellskrapa när du använder vidhäftande celler.
- För vidhäftande celler, aspirera mediet och tillsätt 10 ml PBS per 15 cm platta.
OBS: Skrapa celler i PBS gör att man kan tvätta dem samtidigt. Om cellerna redan finns i suspensionen, fortsätt direkt till steg 3.3. - Lossa cellerna med en cellskrapa och slå dem i ett enda 50 ml koniskt rör. Homogenisera cellsuspensionen genom pipettering upp och ner.
OBS: Celler kan lossas med hjälp av en cellskrapa, eftersom detta är snabbare och de kommer att lyseras strax efter. - För varje experimentellt betingelse, överför 5% av cellsuspensionsvolymen till ett 1,5 ml rör och centrifugera det vid 300 x g i 5 min vid rumstemperatur.
OBS: När du använder suspensionsceller, se till att tvätta cellerna en gång med PBS innan för att ta bort eventuella föroreningar från media som FBS. - Kassera supernatanten och håll pelleten på is.
OBS: Detta kommer att representera "total cell" -fraktionen för proteomik. - Centrifugera resten av proverna från steg 3.1 eller 3.2 vid 300 x g i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Utför alla följande steg på is och använd iskalla buffertar.
- Aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 5 ml iskall mitokondribuffert (MB) (210 mM mannitol, 70 mM sackaros, 10 mM HEPES/NaOH [pH 7,4] och 1 mM EDTA).
- Återställ cellerna genom centrifugering vid 300 x g i 5 min vid 4 °C.
- Resuspendera cellpelleten i 0,5 ml kall MB och överför den till ett 1,5 ml rör.
OBS: Denna procedur ger en ungefärlig cellkoncentration på 1,5 x 10 8 BMDM-celler / ml eller 3 x 108 RAW264,7 celler / ml. - Använd en 1 ml spruta försedd med en 25 G nål och homogenisera cellsuspensionen med 30 passager genom nålen (figur 1A).
- Tillsätt 1 ml kall MB till röret och blanda genom inversion. Centrifugera den homogeniserade cellsuspensionen vid 2 000 x g i 5 min vid 4 °C.
- Överför 1 ml av supernatanten till ett nytt 1,5 ml rör på is utan att störa cellpelleten. Återsuspendera cellpelleten och homogenisera den igen, som i steg 3.7.
- Slå samman den homogeniserade cellpelleten och supernatanten från de två föregående stegen i ett enda 1,5 ml rör och centrifugera det vid 2 000 x g i 5 minuter vid 4 °C.
OBS: Vid denna tidpunkt innehåller pelleten mestadels kärnor och obrutna celler och kasseras. Supernatanten innehåller cellulärt skräp, cytosol och organeller, inklusive mitokondrier (figur 1B). - Dela supernatanten mellan fyra 1,5 ml rör.
OBS: Att dela supernatanten mellan flera rör i detta skede förbättrar avlägsnandet av föroreningar i följande steg. - Tillsätt MB för att göra en slutlig volym på 1 ml i vart och ett av de fyra rören. Blanda genom inversion och centrifugera rören vid 13 000 x g i 10 min vid 4 °C.
OBS: Efter detta steg är en pellets med två lager synlig. Den botten, fasta, bruna pelleten innehåller mitokondrier och hålls för ytterligare rening (figur 1C). Den övre, lösa, vita pelleten innehåller andra cellulära strukturer och kan kasseras. - Utför detta steg noggrant. Ta bort supernatanten med så mycket av den vita övre pelleten som möjligt. Genom att försiktigt pipettera på den är det möjligt att återsuspendera den vita pelleten och sedan kassera den och lämna den bruna mitokondriella pelleten intakt.
- Håll ett av de fyra rören med mitokondriell pellet på is. Detta representerar den "råa mitokondrier" -fraktionen för proteomik.
- Slå ihop de andra tre pelletsen i ett 1,5 ml rör i en slutlig volym på 1 ml MB.
4. Superparamagnetisk antikroppsbaserad rening av mitokondrier
OBS: Utför alla följande steg i ett kylrum vid 4 °C.
- Överför 1 ml av det råa mitokondriella preparatet från steg 3.18 till ett 15 ml koniskt rör och tillsätt 7 ml MB kompletterat med 150 mM NaCl (MB + NaCl).
OBS: Tillsatsen av NaCl förbättrar antikroppsbindningen och minskar icke-specifik bindning av föroreningarna till pärlorna och mitokondrierna. - Tillsätt 50 μl Tomm22-pärlor till den 8 ml råa mitokondrisuspensionen (figur 1D) och inkubera röret i 15 minuter vid 4 °C på ett roterande hjul med låg hastighet.
OBS: Tomm22-pärlor är kovalent bundna till Tomm22 monoklonala antikroppar upphöjda i mus, kopplade till superparamagnetiska pärlor. - Placera under tiden en kolumn på magneten.
- Balansera kolonnen med 8 ml MB + NaCl och ta bort genomflödet.
- Efter 15 minuters inkubation vid 4 °C av provet med Tomm22-pärlorna, överför provet till kolonnen. Ignorera genomflödet.
OBS: Mitokondrier kommer att förbli fästa vid magnetkulorna i kolonnen (figur 1E). - Tvätta kolonnen tre gånger med 8 ml MB + NaCl.
- Ta bort kolonnen från magneten och placera den i ett 15 ml koniskt rör.
- Eluera mitokondrierna genom att tillsätta 1,5 ml MB + NaCl till kolonnen och applicera en kolv omedelbart för att eluera de renade mitokondrierna i röret.
- Överför de eluerade mitokondrierna till ett 1,5 ml rör och centrifugera det vid 21 000 x g i 10 minuter vid 4 °C.
OBS: En brun pellet kommer att bildas. Detta innehåller de isolerade mitokondrierna och några av de antikroppskopplade pärlorna (figur 1F). - Ta försiktigt bort supernatanten från pelleten. Pelleten representerar den "rena mitokondrier" -fraktionen för proteomik. Denna pellet tillsammans med pellets från steg 3.4 och 3.17 kan lagras vid -20 °C och är redo för nedströmsapplikationer.
Representative Results
Tre prover med ökande grad av mitokondriell renhet genereras i detta protokoll: totala celler, råa mitokondrier ("mito-råa") och rena mitokondrier ("mito-rena") (figur 1). Vi validerade reningen av mitokondrier från RAW264.7 makrofagcellinjen genom att ladda lika stora proteinmängder av varje fraktion på en gel och immunoblot, och fann att mitokondriellt citratsyntas (Cs) anrikades vid varje reningssteg; Under tiden försvann proteiner från cytosolen (GAPDH), plasmamembranet (Na/K ATPas), kärnan (Lamin B), lysosomerna (Lamp1) och det endoplasmatiska nätverket (ER) (Pdi) gradvis (figur 2A). Liknande resultat erhölls med användning av BMDM. För ytterligare validering av renheten och integriteten hos de isolerade mitokondrierna utfördes elektronmikroskopi på den rena mitokondriella fraktionen. Vi observerade mitokondrier med en klassisk oval form och intakta cristae omgiven av elektrontäta partiklar som motsvarar de antikroppsbelagda pärlorna (figur 2B). Därför kan man dra slutsatsen att vårt protokoll berikar mitokondrier, utarmar andra cellulära komponenter och upprätthåller mitokondriell strukturell integritet.
Därefter utfördes en proteomanalys av varje fraktion med vätskekromatografi kopplad till masspektrometri (LC / MS). Totalt identifierades 6 248 proteiner i extraktet från totala celler, varav 907 tidigare annoterats som mitokondriella i MitoCarta3.0-inventeringen5. Efter filtrering för proteiner med ett tröskelvärde på minst två unika peptider beräknade vi en anrikningspoäng för varje protein i varje prov baserat på deras intensitet jämfört med totala celler. Vi tilldelade sedan proteinerna till sju stora subcellulära fack: mitokondrier, ER, lysosomer, Golgi-apparater, cytoskelett, kärna och cytosol, med hjälp av Gene Ontology (GO) 16,17 och MitoCarta3.05 som referenser. Viktigt är att en genomsnittlig anrikning för mitokondriella proteiner på mer än 10 gånger och mer än 20 gånger i de råa respektive rena mitokondrierna observerades (figur 2C). Däremot tömdes komponenterna i de andra sex analyserade cellfacken under reningsproceduren. Särskilt anmärkningsvärt, i den råa mitokondrifraktionen observerade vi en övergående anrikning för ER och lysosomala proteiner, två klasser av förorenande proteiner som ofta förekommer efter differentialcentrifugeringsprotokoll18. Detta berodde möjligen på organell-organellinteraktioner och liknande sedimentationskoefficienter, särskilt för lysosomer, som är mycket rikliga i makrofager19. Medan båda mestadels var utarmade efter immuninfångning, upptäckte vi en liten signal för proteiner från ER-mitokondriernas kontaktställen i den mitorena fraktionen.
Vi jämförde sedan direkt proteinöverflödet från de totala cellerna och från mitorena prover och observerade två distinkta populationer, motsvarande mitokondriella och icke-mitokondriella proteiner (figur 2D). Medan de allra flesta MitoCarta-proteiner kluster tillsammans, hittade vi några (<5%) som kluster med icke-MitoCarta-proteiner. Dessa proteiner kan representera (1) cytosoliska mitokondri-interagerande proteiner (en ny kategori kommenterad i version 3.0 av MitoCarta), (2) dubbellokaliserade proteiner eller (3) felannoterade proteiner. Omvänt fann vi några fall av icke-MitoCarta-proteiner som kluster med mitokondriella proteiner. Även om sådana proteiner kan representera föroreningar i isoleringsförfarandet, kan de också representera proteiner som inte tidigare klassificerats som närvarande i mitokondrier.
För att undersöka denna nya klass av potentiella mitokondriella proteiner, subtraktiv proteomik, användes ett tillvägagångssätt som har visat sig användbart för upptäckten av organellära proteomer, inklusive mitokondrier 6,12. Subtraktiv proteomik förutsätter att mitokondrier bör anrikas under reningsstegen och föroreningar bör bli utarmade6. Till exempel, medan föroreningar kan ackumuleras under differentiell centrifugering (t.ex. på grund av liknande sedimenteringsegenskaper) eller under immuninfångning (t.ex. på grund av icke-specifik antikroppsbindning), bör endast bona fide mitokondriella proteiner ackumuleras signifikant i båda. Det är således möjligt att filtrera bort proteiner som hittades i den rena mitokondrifraktionen men visade inkonsekventa anrikningsmönster. I det aktuella exemplet med RAW264.7-celler, genom att sätta ett tröskelvärde för unika peptider på ≥1 för mito-råa och mito-rena prover, och med hjälp av stränga anrikningsgränser, kunde vi förfina listan över återvunna mitokondriella proteom från 1 127 proteiner som ursprungligen hittades i den råa mitokondriella fraktionen efter differentiell centrifugering, ner till 481 proteiner efter den andra reningsrundan med Tomm22-immunval. Det reducerade antalet MitoCarta-annoterade proteiner i den mitorena fraktionen återspeglar den höga stringens som tillämpas för urval. Intressant var att 70 av proteinerna närvarande i den mitorena fraktionen inte var närvarande i MitoCarta3.0-inventeringen (figur 3A, B). Dessa senare proteiner kan representera potentiella nya mitokondriella kandidatproteiner, som endast kan uttryckas i RAW264.7-makrofagcellinjen och i besläktade celler, och som förtjänar ytterligare undersökning.
Figur 1: Illustration av det tvåstegs, taggfria mitokondriisoleringsprotokollet . (A) En cellsuspension störs genom en 25 G nål. B) Kärnor och hela celler separeras genom centrifugering vid 2 000 x g och supernatanten sparas. (C) Obearbetade mitokondrier isoleras genom differentialcentrifugering av supernatanten vid 13 000 x g (mitorå). (D) Obearbetade mitokondrier inkuberas sedan med Tomm22-antikroppar (Ab) kovalent kopplade till superparamagnetiska pärlor. (E) Mitokondrier-Tomm22-antikroppspärlkomplexen separeras från föroreningar med hjälp av magnetiska kolonner och elueras. (F) Rena mitokondrier samlas upp och koncentreras genom centrifugering (mitorena). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2. Representativa resultat av mitokondrier isolering från två makrofagkällor. (A) Proteinimmunoblotanalys av RAW264.7 (överst) och BMDM-celler (botten) med antikroppar mot mitokondriellt citratsyntas (Cs - mitokondrier), glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (Gapdh-cytosol), natrium-kaliumpump (Na/K ATPas - plasmamembran), Lamin B (Lamin B-kärna), lysosomalt associerat membranprotein 1 (Lamp1 - lysosom) och proteindisulfid-isomeras (Pdi-ER). (B) Elektronmikroskopi av renade mitokondrier från RAW264.7-celler. Högdensitetspartiklar som omger mitokondrier motsvarar Tomm22-pärlorna som bärs vidare med mitorena prover efter eluering från kolonnerna. Skalstänger: 80 nm. (C) Anrikningspoäng över totala celler, mito-rå och mito-ren från sju cellulära fack i RAW264.7-celler. MitoCarta3.0 och GO användes för proteinannotering och de genomsnittliga poängen är representerade. Förkortning: ER = endoplasmatisk retikulum. (D) Proteinmängdsvärden (riBAQ) för proteiner i totala celler och mitorena prover från RAW264.7-celler. MitoCarta3.0-proteiner visas i orange. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3. Upptäckt av nya mitokondriella proteiner med hjälp av subtraktiv proteomik. (A) Subtraktiv proteomikstrategi för upptäckt av nya mitokondriella proteiner. Höga tröskelvärden (4x och 2x) tillämpas för att minimera valet av falska positiva identifieringar. (B) Anrikning ger (veck av totala celler) av nya mitokondriella kandidatproteiner som inte tidigare kommenterats i MitoCarta3.0-inventeringen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Vi har kombinerat differentialcentrifugering och immunocapture för att uppnå en förbättrad renhet för mitokondriisolering. Vår procedur ger tillgång till primärmaterial för identifiering och karakterisering av nya mitokondriella proteiner. Protokollet är enkelt och robust och kan tillämpas på cellinjer, primära celler och vävnader utan behov av genetisk modifiering. Vi har validerat vårt protokoll genom immunoblot- och proteomikanalyser på prover tagna i olika steg under reningsproceduren.
I jämförelse med enstaka isoleringsmetoder genererar kombinationen av anrikningssteg av olika slag - här centrifugering och immunmärkning - ett mer robust protokoll för att isolera mitokondrier. Detta beror på att medan mitokondriella proteiner kommer att anrikas i båda reningarna, är det osannolikt att föroreningar också kommer att anrikas efter båda anrikningsstegen. Även om hög mitokondriell renhet också kan uppnås genom ultracentrifugering av densitetsgradient, kräver detta tillvägagångssätt en stor mängd utgångsmaterial och tillgång till en ultracentrifug. Slutligen, i motsats till de senaste metoderna baserade på taggbaserad mitokondriell isolering20, kräver vårt tillvägagångssätt inte genetisk modifiering av provet, vilket gör det lämpligt för primärmaterial från vilken källa som helst.
Vissa tekniska och biologiska överväganden måste beaktas i den experimentella designen när vi tillämpar vårt protokoll. (1) Mängden utgångsmaterial är avgörande för att få tillräckligt med material. Oundvikligen kommer ett litet antal mitokondrier att gå förlorade under homogenisering (steg 3.10), eftersom inte alla celler lyseras, eller under tvättarna med tre kolonner (steg 4.6). Medan vårt protokoll fokuserar på renhet över avkastning, har effektiviteten av mitokondriernas isolering, och därmed deras utbyte, inte mätts eller optimerats. Att använda fler Tomm22-pärlor och fler kolumner förväntas öka utbytet av mitokondrieråterhämtning. Samtidigt kan en grundlig optimering av homogeniseringssteget också leda till förbättrat mitokondriellt utbyte. Detta protokoll och de initiala cellnumren vi rapporterar här för RAW264.7-celler och BMDM är lämpliga för proteomik och kan justeras för andra applikationer. När det gäller primära BMDM fann vi att en enda mus var tillräcklig för en replikat. Vid behov kan proceduren skalas upp för att isolera BMDM från flera djur, som sedan kan slås samman för att få tillräckligt med material. Cellnumret kan optimeras beroende på celltyp, dess storlek och dess mitokondriella innehåll. (2) Tomm22 uttrycks på mitokondrier från alla celltyper och vävnader21, men uttrycksnivån kan variera. När man utformar ett experiment för att jämföra olika förhållanden är det därför viktigt att se till att uttrycksnivåerna för Tomm22 är jämförbara. På grund av det allestädes närvarande uttrycket av Tomm22 är det inte möjligt att studera celltypspecifika mitokondriella proteiner i komplexa vävnader. (3) Den tid som krävs för att generera rena mitokondrier (cirka 2,5 timmar) är oförenlig med en studie av övergående händelser, såsom förändringar i metaboliska profiler. I det här fallet rekommenderar vi direkt taggbaserad immunfångst9, vilket också gör det möjligt att studera celltypspecifika mitokondrier in vivo20. (4) Även om studier på isolerade mitokondrier som erhållits med enbart Tomm22-antikroppsmärkta pärlor har visat aktivitet i funktionella analyser11återstår det att avgöra om mitokondrier som genereras med vårt protokoll är kompatibla med aktivitetsbaserade analyser nedströms. MitoTracker eller tetrametylrhodamin metylesterperklorat (TMRM) färgning, eller respirometrimätningar, är potentiella metoder för att kvantifiera funktionaliteten hos isolerade mitokondrier22. (5) Efter att ha eluerat det "mitorena" provet från kolonnen kommer några Tomm22-pärlor att finnas i den rena mitokondrifraktionen (Figur 2B). Även om vi inte har observerat någon interferens med trypsinuppslutning och proteinmasspektrometri, bör förekomsten av dessa pärlor och immunglobulinerna beaktas i andra nedströmsapplikationer. Tomm22-antikroppen är en monoklonal antikropp som produceras hos möss23, och därför är det viktigt att komma ihåg att när man använder sekundära antikroppar mot möss i immunoblot, kommer det att generera ospecifika band vid storleken på immunglobulinkedjorna. (6) Fullständig homogenisering av cellsuspensionen är nyckeln till framgångsrik isolering av mitokondrier. Här använder vi en spruta med en 25 G nål för att lysera både RAW264.7-celler och BMDM. Beroende på celltypen och dess storlek kan emellertid andra mekaniska homogeniseringsmetoder, såsom användning av en Dounce-homogenisator, eller mer kontrollerade tillvägagångssätt som cellhomogenisatoranordningar, vara mer lämpliga. Icke-mekaniska homogeniseringsmetoder, såsom mild ultraljudsbehandling, kan också övervägas. Vävnadshomogeniseringsmetoder diskuteras vidare i andra studier24,25. (7) Även om validering genom immunoblot är den enklaste och billigare metoden, korrelerar resultaten inte alltid med förändringar på organellnivå. Det är därför vi rekommenderar att du använder proteomik för att fullt ut validera anrikning eller utarmning av mitokondrier respektive andra organeller.
Det tvåstegs mitokondriernas reningsprotokoll som beskrivs här har gjort det möjligt för oss att generera sekventiella prover med ökande mitokondriell renhet, och detta har gjort det möjligt för oss att upptäcka nya mitokondriella proteinkandidater genom subtraktiv proteomik12. För vår analys använder vi stränga tröskelvärden för att välja för signifikant anrikade mitokondriella proteiner, och även om detta kan misslyckas med att identifiera några kända mitokondriella proteiner (Figur 3A), minskar den falskt positiva hastigheten för ny mitokondriell proteinupptäckt. Det är dock viktigt att betona att alla kandidatproteiner som avslöjas av vårt protokoll måste valideras genom ortogonala metoder. Vi rekommenderar karboxiterminal GFP-märkning eller användning av antikroppar mot det endogena proteinet för att validera samband med mitokondrier antingen mikroskopiskt eller genom proteasskyddsanalyser.
Den direkta tillämpningen av vår metod när det gäller omodifierade celler och vävnader erbjuder ett kraftfullt verktyg för att undersöka hur mitokondrier förändras och anpassar sig till sin miljö vid friska och sjukdomstillstånd. Tillämpning av vårt protokoll på cellinjer, djursjukdomsmodeller, mänskliga vätskor och till och med biopsier från kirurgi kan visa sig vara särskilt användbara för att förbättra vår förståelse av mitokondrier och deras associerade störningar.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Manfredo Quadroni, Protein Analysis Facility och Electron Microscopy Facility vid University of Lausanne för deras hjälp. Vi tackar också H.G. Sprenger, K. Maundrell och medlemmar av Jourdain-laboratoriet för råd och feedback på manuskriptet. Detta arbete stöddes av stiftelsen Pierre-Mercier pour la Science och Swiss National Science Foundation (projektbidrag 310030_200796).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD Plastipal | 309628 | |
| 25 G Needle | BD Microlance | 300400 | |
| 40 µm cell strainer | Corning | 352340 | |
| Anti-TOM22 Microbeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-127-693 | |
| Cell scraper | FisherScientific | 11577692 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | ThermoFisher | 31966 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | FisherScientific | BP-120-1 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270 | |
| HEPES | BioConcept | 5-31F00-H | |
| LS columns and plungers | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Macrophage colony-stimulating factor | Immunotools | 12343115 | |
| Mannitol | Sigma | M4125 | |
| Sodium chloride | Sigma | 71380 | |
| Sucrose | Sigma | S1888 | |
| Penicillin/Streptomycin | BioConcept | 4-01F00-H | |
| Petri dishes | Corning | BH93B-102 | |
| Phosphate-buffered saline 10X | Eurobio Scientific | CS3PBS01-01 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Vi-CELL BLU Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter | C19196 |
References
- Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
- West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S.
- Chakrabarty, R. P., Chandel, N. S. Mitochondria as signaling organelles control mammalian stem cell fate. Cell Stem Cell. 28 (3), 394-408 (2021).
- Morgenstern, M., et al. Quantitative high-confidence human mitochondrial proteome and its dynamics in cellular context. Cell Metabolism. 33 (12), 2464-2483 (2021).
- Rath, S., et al. MitoCarta3.0: an updated mitochondrial proteome now with sub-organelle localization and pathway annotations. Nucleic Acids Research. 49, D1541-D1547 (2021).
- Pagliarini, D. J., et al. A mitochondrial protein compendium elucidates complex I disease biology. Cell. 134 (1), 112-123 (2008).
- Diaz-Vegas, A., et al. Is mitochondrial dysfunction a common root of noncommunicable chronic diseases. Endocrine Reviews. 41 (3), 005 (2020).
- Bury, A. G., Vincent, A. E., Turnbull, D. M., Actis, P., Hudson, G. Mitochondrial isolation: when size matters. Wellcome Open Research. 5, 226 (2020).
- Chen, W. W., Freinkman, E., Sabatini, D. M. Rapid immunopurification of mitochondria for metabolite profiling and absolute quantification of matrix metabolites. Nature Protocols. 12 (10), 2215-2231 (2017).
- Daniele, J. R., Heydari, K., Arriaga, E. A., Dillin, A. Identification and characterization of mitochondrial subtypes in Caenorhabditis elegans via analysis of individual mitochondria by flow cytometry. Analytical Chemistry. 88 (12), 6309-6316 (2016).
- Franko, A., et al. Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads. PLoS One. 8 (12), e82392 (2013).
- Yates, J. R., Gilchrist, A., Howell, K. E., Bergeron, J. J. M. Proteomics of organelles and large cellular structures. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (9), 702-714 (2005).
- Trouplin, V., et al.
- Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages. Journal of Visualized Experiments. (76), e50323 (2013).
- Toda, G., Yamauchi, T., Kadowaki, T., Ueki, K. Preparation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice for functional analysis. STAR Protocols. 2 (1), 100246 (2020).
- Gene Ontology Consortium. The Gene Ontology resource: enriching a GOld mine. Nucleic Acids Research. 49, D325-D334 (2021).
- Ashburner, M., et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nature Genetics. 25 (1), 25-29 (2000).
- Hartwig, S., et al. A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation. Proteomics. 9 (11), 3209-3214 (2009).
- Delamarre, L., Pack, M., Chang, H., Mellman, I., Trombetta, E. S. Differential lysosomal proteolysis in antigen-presenting cells determines antigen fate. Science. 307 (5715), 1630-1634 (2005).
- Bayraktar, E. C., et al. MITO-Tag mice enable rapid isolation and multimodal profiling of mitochondria from specific cell types in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (1), 303-312 (2019).
- Nusinow, D. P., et al. Quantitative proteomics of the cancer cell line encyclopedia. Cell. 180 (2), 387-402 (2020).
- Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
- Hornig-Do, H. T., et al. Isolation of functional pure mitochondria by superparamagnetic microbeads. Analytical Biochemistry. 389 (1), 1-5 (2009).
- Liao, P. C., Bergamini, C., Fato, R., Pon, L. A., Pallotti, F. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Methods in Cell Biology. 155, 3-31 (2020).
- Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods in Enzymology. 457, 349-372 (2009).
