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Biology

बेहतर प्रोटीन खोज और परिमाणीकरण के लिए माइटोकॉन्ड्रिया का दो-चरण टैग-मुक्त अलगाव

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/65252
Automatic Translation
1, 1
1Department of Immunobiology, University of Lausanne

Summary

हम उच्च गुणवत्ता वाले माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव के लिए एक दो-चरण यी प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो प्रोटीन की खोज और प्रोटिओम पैमाने पर परिमाणीकरण के साथ संगत है। हमारे प्रोटोकॉल को आनुवंशिक इंजीनियरिंग की आवश्यकता नहीं है और इस प्रकार किसी भी प्राथमिक कोशिकाओं और ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है।

Abstract

अधिकांश शारीरिक और रोग प्रक्रियाएं, केंद्रीय चयापचय से लेकर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से लेकर न्यूरोडीजेनेरेशन तक, माइटोकॉन्ड्रिया को शामिल करती हैं। माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटिओम 1,000 से अधिक प्रोटीन से बना है, और प्रत्येक की बहुतायत बाहरी उत्तेजनाओं के जवाब में या रोग की प्रगति के दौरान गतिशील रूप से भिन्न हो सकती है। यहां, हम प्राथमिक कोशिकाओं और ऊतकों से उच्च गुणवत्ता वाले माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। दो-चरणीय प्रक्रिया में (1) कच्चे माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने के लिए यांत्रिक समरूपीकरण और अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन शामिल हैं, और (2) शुद्ध ऑर्गेनेल को अलग करने और दूषित पदार्थों को खत्म करने के लिए माइटोकॉन्ड्रिया का टैग-मुक्त प्रतिरक्षा कैप्चर शामिल है। प्रत्येक शुद्धि चरण से माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन का मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया जाता है, और संवर्धन पैदावार की गणना की जाती है, जिससे घटाव प्रोटिओमिक्स द्वारा नए माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की खोज की अनुमति मिलती है। हमारा प्रोटोकॉल सेल लाइनों, प्राथमिक कोशिकाओं और ऊतकों में माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री का अध्ययन करने के लिए एक संवेदनशील और व्यापक दृष्टिकोण प्रदान करता है।

Introduction

माइटोकॉन्ड्रिया जटिल और गतिशील अंग हैं जो कोशिका की चयापचय आवश्यकताओं को समझने और अनुकूलित करने में सक्षम हैं। सेलुलर चयापचय की जटिलता के केंद्रीय, माइटोकॉन्ड्रिया चयापचय हब के रूप में कार्य करते हैं जहां कार्बोहाइड्रेट, प्रोटीन, लिपिड, न्यूक्लिक एसिड और सह-कारक चयापचय प्रतिक्रियाएं अभिसरणकरती हैं। वे जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के मार्गों के लिए और आयनों और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों 2,3 में परिवर्तन के जवाब में सिग्नलिंग ऑर्गेनेल के रूप में भी काम करते हैं। आज तक, लगभग 1,100 प्रोटीन ों को माइटोकॉन्ड्रिया 4,5,6 में मैप किया गया है, फिर भी हम मान सकते हैं कि कई और खोजे जाने बाकी हैं, विशेष रूप से वे जो केवल कुछ सेल प्रकारों में या विशिष्ट पर्यावरणीय परिस्थितियों में क्षणिक रूप से व्यक्त किए जाते हैं। रुचि के चयापचय राज्यों में माइटोकॉन्ड्रियल संरचना में परिवर्तन को निर्धारित करने के लिए नए दृष्टिकोण विकसित करने से इन ऑर्गेनेल के बारे में हमारे ज्ञान में वृद्धि होगी और माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन7 की विशेषता वाले विकारों के लिए नए चिकित्सीय रास्ते उजागर होंगे।

वर्तमान में, विभिन्न माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव प्रोटोकॉल उपलब्ध हैं, अलग-अलग पैदावार और शुद्धता के स्तर8. सेंट्रीफ्यूजेशन-आधारित दृष्टिकोण उनकी सादगी और कम लागत के कारण सबसे लोकप्रिय हैं। हालांकि अधिकांश अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है, अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन में कम माइटोकॉन्ड्रियल शुद्धता प्राप्त करने का नुकसान होता है और अधिक जटिल घनत्व ढाल-आधारित अनुप्रयोगों का उपयोग किए जाने पर बड़ी मात्रा में प्रारंभिक सामग्री की आवश्यकता होती है। हाल के वर्षों में, माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव के लिए नए तरीके सामने आए हैं, जैसे टैग-आधारित प्रतिरक्षा कैप्चर ("मिटो-आईपी")9 और प्रतिदीप्ति-सक्रिय ऑर्गेनेल सॉर्टिंग10। यद्यपि दोनों प्रक्रियाएं उच्च शुद्धता के साथ नमूने उत्पन्न कर सकती हैं, पूर्व को आत्मीयता शुद्धिकरण के लिए माइटोकॉन्ड्रिया को टैग करने के लिए आनुवंशिक इंजीनियरिंग की आवश्यकता होती है, जिससे प्रोटोकॉल असंशोधित जीवों या मानव दाताओं से प्राथमिक सामग्री के साथ असंगत हो जाते हैं। इस बीच, उत्तरार्द्ध प्रवाह साइटोमेट्री और सॉर्टिंग उपकरणों तक पहुंच पर निर्भर है। विभिन्न अलगाव विधियों का संयोजन अधिक मजबूत प्रोटोकॉल और बढ़ी हुई शुद्धता उत्पन्न करने का वादा प्रदान करता है।

यहां, हम दो मौजूदा तरीकों के संयोजन के आधार पर माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव के लिए एक नया प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं: (1) एक कच्चे माइटोकॉन्ड्रियल अंश को अलग करने के लिए अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन, और (2) बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली 22 (टॉम 22)11, एक सर्वव्यापी माइटोकॉन्ड्रियल बाहरी-झिल्ली प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी से बंधे सुपरपैरामैग्नेटिक मोतियों के साथ माइटोकॉन्ड्रिया का टैग-मुक्त प्रतिरक्षा कैप्चर (चित्रा 1). हम जिस प्रक्रिया का वर्णन करते हैं वह मात्रात्मक प्रोटीन मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ संगत है, और क्योंकि यह टैग-मुक्त है और आनुवंशिक हेरफेर की आवश्यकता नहीं है, इसे सेल लाइनों से शरीर के तरल पदार्थ से पूरे पशु ऊतकों तक अनुसंधान मॉडल की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल में दो चरणों का उपयोग उपन्यास माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की खोज और उनकी अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए घटाव प्रोटिओमिक्स 6,12 के उपयोग को सक्षम बनाता है।

Protocol

दस्ताने हर समय पहने जाने चाहिए और सेल कल्चर चरणों को एक लामिनर प्रवाह हुड के तहत किया जाना चाहिए। कोशिकाओं को 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में बनाए रखा जाताहै। इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत शोध को जानवरों के उपयोग के लिए लॉज़ेन विश्वविद्यालय और स्विस दिशानिर्देशों के अनुपालन में अनुमोदित और प्रदर्शन किया गया था।

1. रॉ 264.7 मैक्रोफेज सेल लाइन की संस्कृति

  1. डलबेकको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) में चूहों मैक्रोफेज आरएडब्ल्यू 264.7 कोशिकाओं को उच्च ग्लूकोज और ग्लूटामाइन के साथ 5% गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (एचआई-एफबीएस) और 100 आईयू / एमएल पेनिसिलिन और 100 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) के साथ पूरक करें।
    नोट: माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने के लिए, एक एकल कंफ्लुएंट 15 सेमी प्लेट (लगभग 70 x 10 7 RAW264.7 कोशिकाएं) पर्याप्त है।
  2. ऊतक संवर्धन प्लेटों में RAW264.7 कोशिकाओं को बनाए रखें। 1 x 105 कोशिकाओं/एमएल का प्रारंभिक सीडिंग घनत्व 3 दिनों में एक कंफ्लुएंट प्लेट की ओर जाता है। 15 सेमी प्लेट के लिए मीडिया में 25 एमएल सेल सस्पेंशन का उपयोग करें। RAW264.7 कोशिकाओं में एक उच्च कोशिका विभाजन दर होती है और अधिकांश सेल लाइनों की तुलना में अधिक बार विभाजित करने की आवश्यकता होती है।
  3. RAW264.7 कोशिकाओं को अलग करना
    1. मीडिया को एस्पिरेट करें और फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें।
    2. 15 सेमी प्लेट के लिए, 8 मिलीलीटर गर्म रॉ पृथक्करण बफर (270 एमएम पोटेशियम क्लोराइड, एच2ओ में 30 एमएम सोडियम साइट्रेट डाइहाइड्रेट, बाँझ फ़िल्टर) जोड़ें और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    3. प्लेटों में मीडिया की एक समान मात्रा जोड़ें (पृथक्करण बफर का 1: 1 कमजोर होना), और कोशिकाओं को अलग करने और समरूप करने के लिए पिपेट ।
    4. सेल सस्पेंशन को शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 300 x g पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें।
    5. सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें और सेल गिनती के लिए मीडिया की उचित मात्रा (चरण 1.1 में वर्णित) में गोली को फिर से निलंबित करें।
      नोट: RAW264.7 कोशिकाओं को अलग करने के अन्य तरीकों का उपयोग किया जा सकता है, जैसे ट्रिप्सिन या सेल स्क्रैपर। हालांकि, ये विधियां कोशिकाओं पर कठोर होती हैं और अलग होने के बाद के दिनों में एम 1 जैसे मैक्रोफेज में उनके ध्रुवीकरण का कारण बन सकती हैं।

2. अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज (बीएमडीएम) का अलगाव और संस्कृति।

नोट: यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक माउस के लिए है और इसे कई चूहों के लिए बढ़ाया जा सकता है। बीएमडीएम अलगाव और संस्कृति के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल कहीं और वर्णित किया गयाहै 13,14.

  1. सीओ2 की उच्च खुराक के साथ 8-12 सप्ताह के सी 57बीएल / 6 माउस का बलिदान करें।
    नोट: या तो नर या मादा चूहों का उपयोग किया जा सकता है।
  2. इसे निष्फल करने के लिए माउस को 75% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें।
  3. माउस15 से कूल्हों, फीमर और टिबिया को विच्छेदित और एकत्र करें।
  4. फीमर और टिबिया से अस्थि मज्जा को इकट्ठा करने के लिए,दोनों हड्डियों के घुटने के जोड़ के अंत को हटा दें। एसिटाबुलम को हटाकर कूल्हों से अस्थि मज्जा को पुनर्प्राप्त करें।
  5. हड्डियों को बर्फ पर रखे 4 एमएल बीएमडीएम मीडिया के साथ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें (उच्च ग्लूकोज और ग्लूटामाइन के साथ डीएमईएम 5% एचआई-एफबीएस, पी / एस, और 10 एमएम एचईपीईएस के साथ पूरक)।
    नोट: विच्छेदन के दौरान अस्थि मज्जा के सूखने से बचने के लिए हड्डियों को मीडिया में रखना महत्वपूर्ण है।
  6. 6-वेल प्लेट के दो अलग-अलग कुओं में 4 एमएल पीबीएस और 4 एमएल गर्म बीएमडीएम मीडिया जोड़ें।
  7. हड्डियों और मीडिया को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब से 6-वेल प्लेट के एक खाली कुएं में स्थानांतरित करें।
  8. बल की एक जोड़ी का उपयोग करके, हड्डियों को अच्छी तरह से धोने के लिए पीबीएस में स्थानांतरित करें।
  9. हड्डियों को गर्म बीएमडीएम मीडिया वाले कुएं में स्थानांतरित करें।
  10. बल के साथ दो 0.5 एमएल ट्यूबों के तल में 1-2 मिमी व्यास का एक छेद बनाएं और उन्हें 1.5 एमएल ट्यूब में रखें।
    नोट: इस त्वरित कदम के लिए ट्यूब में मीडिया जोड़ना आवश्यक नहीं है।
  11. प्रत्येक 0.5 एमएल ट्यूब में, एक फीमर, टिबिया और कूल्हे को इस तरह से रखें कि उजागर हड्डियों का अस्थि मज्जा ट्यूबों के नीचे की ओर हो।
  12. 0.5 एमएल ट्यूब के छेद के माध्यम से अस्थि मज्जा और बचे हुए मीडिया को इकट्ठा करने के लिए कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 13,000 x g पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें। हड्डियों के साथ 0.5 एमएल ट्यूबों को फेंक दें।
  13. बीएमडीएम मीडिया में अस्थि मज्जा छर्रों को पुन: निलंबित करें और 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  14. 10 एमएल तक बीएमडीएम मीडिया जोड़ें।
  15. 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब पर 40 μm सेल स्ट्रेनर रखें और इसके माध्यम से अस्थि मज्जा निलंबन को फ़िल्टर करें।
  16. बरकरार कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करने और सेल निलंबन से छोटे मलबे को हटाने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर फ़िल्टर किए गए निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें।
  17. मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) के 50 एनजी / एमएल के साथ पूरक बीएमडीएम मीडिया के 70 एमएल तैयार करें।
  18. एम-सीएसएफ-पूरक बीएमडीएम मीडिया के 10 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें।
  19. सात 10 सेमी पेट्री व्यंजनों में से प्रत्येक में एम-सीएसएफ-पूरक बीएमडीएम मीडिया के 9 एमएल जोड़ें।
  20. सात 10 सेमी पेट्री व्यंजनों में से प्रत्येक में प्लेट 1 एमएल कोशिकाओं (लगभग 1 x 107 कोशिकाएं) हैं।
  21. प्लेट पर सावधानीपूर्वक ऊपर और नीचे पाइप करके प्रत्येक प्लेट में सेल निलंबन को समरूप करें और प्लेटों को इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें।
  22. 3 दिनों के बाद, प्रत्येक प्लेट में 50 एनजी / एमएल एम-सीएसएफ के साथ पूरक गर्म बीएमडीएम मीडिया के 5 एमएल जोड़ें।
  23. 3 दिनों के बाद (दिन 6, अस्थि मज्जा अलगाव के बाद), माइक्रोस्कोपी द्वारा बीएमडीएम के आसंजन और भेदभाव को सत्यापित करें।
    नोट: इस बिंदु पर, माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव (चरण 3) के लिए सीधे आगे बढ़ना संभव है। वैकल्पिक रूप से, कोई बीएमडीएम को दोहरा सकता है, जो उन्हें साइटोकिन्स और छोटे अणुओं के साथ इलाज करने की अनुमति देता है।
  24. BMDM को अलग करना
    1. प्रत्येक प्लेट से मीडिया को एस्पिरेट करें और 5 एमएम एथिलीनडायमाइनटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) के साथ पूरक 7 एमएल ठंडा पीबीएस जोड़ें।
    2. 7-8 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    3. 10 एमएल पिपेट का उपयोग करके बीएमडीएम को सावधानीपूर्वक ऊपर और नीचे पाइप करके अलग करें।
    4. सभी सात प्लेटों से पुन: निलंबित बीएमडीएम को एक साथ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में पूल करें और कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    5. सतह पर तैरनेवाला को एस्पिरेट करें और सेल गिनती के लिए गर्म बीएमडीएम मीडिया के 40 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
      नोट: 7-9 x 10के बीच 7 BMDM प्रति माउस प्राप्त किए जाते हैं। प्रोटिओमिक्स के लिए माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव के लिए न्यूनतम 6 x 107 बीएमडीएम की सिफारिश की जाती है।
    6. यदि वांछित हो, तो प्रयोगात्मक लक्ष्य के अनुसार बीएमडीएम को प्लेट और उपचार करें। यदि नहीं, तो सीधे चरण 3.3 पर आगे बढ़ें।

3. अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एक कच्चे माइटोकॉन्ड्रियल अंश की तैयारी।

नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी सेंट्रीफ्यूजेशन चरणों का पालन करें। दो सेंट्रीफ्यूज की आवश्यकता होती है, एक स्विंग-आउट रोटर के साथ और शंक्वाकार ट्यूबों के लिए कम से कम 300 x g के सापेक्ष केन्द्रापसारक बल के साथ, दूसरा 1.5 एमएल ट्यूबों के लिए उपयुक्त कम से कम 21,000 x g के सापेक्ष केन्द्रापसारक बल के साथ। अनुयायी कोशिकाओं का उपयोग करते समय, सेल स्क्रैपर का उपयोग करें।

  1. अनुयायी कोशिकाओं के लिए, मीडिया को एस्पिरेट करें और प्रति 15 सेमी प्लेट में 10 एमएल पीबीएस जोड़ें।
    नोट: पीबीएस में स्क्रैपिंग कोशिकाएं एक ही समय में उन्हें धोने की अनुमति देती हैं। यदि कक्ष पहले से ही निलंबन में हैं, तो सीधे चरण 3.3 पर आगे बढ़ें।
  2. सेल स्क्रैपर का उपयोग करके कोशिकाओं को अलग करें और उन्हें एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में पूल करें। ऊपर और नीचे पाइप करके सेल सस्पेंशन को समरूप करें।
    नोट: सेल स्क्रैपर का उपयोग करके कोशिकाओं को अलग किया जा सकता है, क्योंकि यह तेज है और उन्हें जल्द ही हटा दिया जाएगा।
  3. प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के लिए, सेल निलंबन मात्रा के 5% को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    नोट: निलंबन कोशिकाओं का उपयोग करते समय, एफबीएस जैसे मीडिया से संभावित दूषित पदार्थों को हटाने के लिए, पीबीएस के साथ कोशिकाओं को एक बार धोना सुनिश्चित करें।
  4. सतह पर तैरनेवाला को त्याग दें और गोली को बर्फ पर रखें।
    नोट: यह प्रोटिओमिक्स के लिए "कुल सेल" अंश का प्रतिनिधित्व करेगा।
  5. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर चरण 3.1 या 3.2 से बाकी नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करें।
  6. बर्फ पर और बर्फ-ठंडे बफर का उपयोग करके निम्नलिखित सभी चरणों का पालन करें।
  7. सतह पर तैरनेवाला को एस्पिरेट करें और सेल गोली को 5 मिलीलीटर बर्फ-ठंडे माइटोकॉन्ड्रिया बफर (एमबी) (210 एमएम मैनिटोल, 70 एमएम सुक्रोज, 10 एमएम एचईपीईएस / एनएओएच [पीएच 7.4], और 1 एमएम ईडीटीए) में फिर से निलंबित करें।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करें।
  9. सेल गोली को 0.5 एमएल कोल्ड एमबी में पुन: निलंबित करें और इसे 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: यह प्रक्रिया 1.5 x 10 8 BMDM कोशिकाओं / mL या 3 x 108 RAW264.7 कोशिकाओं / mL की अनुमानित सेल एकाग्रता उत्पन्न करती है।
  10. 25 ग्राम सुई के साथ फिट किए गए 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके, सुई के माध्यम से 30 मार्ग द्वारा सेल निलंबन को समरूप करें (चित्रा 1 ए)।
  11. ट्यूब में 1 मिलीलीटर ठंडा एमबी जोड़ें और व्युत्क्रम द्वारा मिलाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 2,000 x g पर होमोजिनाइज्ड सेल सस्पेंशन को सेंट्रीफ्यूज करें।
  12. सेल गोली को परेशान किए बिना बर्फ पर एक ताजा 1.5 एमएल ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला के 1 मिलीलीटर को स्थानांतरित करें। सेल गोली को पुन: निलंबित करें और इसे फिर से समरूप करें, जैसा कि चरण 3.7 में है।
  13. होमोजिनाइज्ड सेल पेलेट और सुपरनैटेंट को पिछले दो चरणों से एक एकल 1.5 एमएल ट्यूब में पूल करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 2,000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    नोट: इस बिंदु पर, गोली में ज्यादातर नाभिक और अटूट कोशिकाएं होती हैं और इसे छोड़ दिया जाता है। सतह पर तैरनेवाला में माइटोकॉन्ड्रिया (चित्रा 1 बी) सहित सेलुलर मलबे, साइटोसोल और ऑर्गेनेल होते हैं।
  14. सतह पर तैरनेवाले को चार 1.5 एमएल ट्यूबों में विभाजित करें।
    नोट: इस स्तर पर कई ट्यूबों के बीच सतह पर तैरनेवाला को विभाजित करने से निम्नलिखित चरणों में दूषित पदार्थों को हटाने में सुधार होता है।
  15. चार ट्यूबों में से प्रत्येक में 1 एमएल की अंतिम मात्रा बनाने के लिए एमबी जोड़ें। व्युत्क्रम द्वारा मिलाएं और ट्यूबों को 13,000 x g पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    नोट: इस चरण के बाद, दो परतों के साथ एक गोली दिखाई देती है। नीचे, दृढ़, भूरे रंग की गोली में माइटोकॉन्ड्रिया होता है और इसे आगे शुद्धिकरण के लिए रखा जाता है (चित्रा 1 सी)। ऊपरी, ढीली, सफेद गोली में अन्य सेलुलर संरचनाएं होती हैं और इसे छोड़ा जा सकता है।
  16. इस चरण को सावधानी पूर्वक करें। जितना संभव हो सके सफेद ऊपरी गोली के साथ सतह पर तैरनेवाला को हटा दें। उस पर धीरे से पाइप िंग करके, सफेद गोली को फिर से निलंबित करना और फिर इसे त्यागना संभव है, जिससे भूरे रंग की माइटोकॉन्ड्रियल गोली बरकरार रहती है।
  17. बर्फ पर माइटोकॉन्ड्रियल गोली के साथ चार ट्यूबों में से एक रखें। यह प्रोटिओमिक्स के लिए "क्रूड माइटोकॉन्ड्रिया" अंश का प्रतिनिधित्व करता है।
  18. अन्य तीन छर्रों को 1.5 एमएल ट्यूब में 1 एमएल एमबी की अंतिम मात्रा में एक साथ पूल करें।

4. माइटोकॉन्ड्रिया के सुपरपैरामैग्नेटिक एंटीबॉडी-आधारित शुद्धिकरण

नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर एक ठंडे कमरे में निम्नलिखित सभी चरणों का पालन करें।

  1. चरण 3.18 से 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में कच्चे माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी के 1 एमएल को स्थानांतरित करें और 150 एमएम एनएसीएल (एमबी + एनएसीएल) के साथ पूरक एमबी के 7 एमएल जोड़ें।
    नोट: एनएसीएल के अलावा एंटीबॉडी बाइंडिंग में सुधार होता है और मोतियों और माइटोकॉन्ड्रिया के लिए दूषित पदार्थों के गैर-विशिष्ट बंधन को कम करता है।
  2. 8 एमएल क्रूड माइटोकॉन्ड्रिया सस्पेंशन (चित्रा 1 डी) में 50 μL Tomm22 बीड्स जोड़ें और कम गति पर घूमने वाले पहिये पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए ट्यूब को इनक्यूबेट करें।
    नोट: टॉम 22 मोती माउस में उठाए गए टॉम 22 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी से सहसंयोजक रूप से बंधे होते हैं, जो सुपरपैरामैग्नेटिक मोतियों के साथ युग्मित होते हैं।
  3. इस बीच, चुंबक पर एक स्तंभ रखें।
  4. MB + NaCl के 8 mL के साथ स्तंभ को समतुल्य करें और प्रवाह को छोड़ दें।
  5. टॉम 22 मोतियों के साथ नमूने के 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, नमूने को कॉलम में स्थानांतरित करें। प्रवाह को छोड़ दें।
    नोट: माइटोकॉन्ड्रिया कॉलम में चुंबकीय मोतियों से जुड़ा रहेगा (चित्रा 1 ई)।
  6. कॉलम को 8 एमएल एमबी + एनएसीएल के साथ तीन बार धोएं।
  7. चुंबक से स्तंभ निकालें और इसे 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखें।
  8. कॉलम में 1.5 एमएल एमबी + एनएसीएल जोड़कर माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करें और ट्यूब में शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया को बाहर निकालने के लिए तुरंत एक प्लंजर लागू करें।
  9. इल्यूटेड माइटोकॉन्ड्रिया को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 21,000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    नोट: एक भूरे रंग की गोली बनेगी। इसमें पृथक माइटोकॉन्ड्रिया और कुछ एंटीबॉडी-युग्मित मोती (चित्रा 1 एफ) शामिल हैं।
  10. गोली से सतह पर तैरनेवाला को सावधानी से निकालें। गोली प्रोटिओमिक्स के लिए "शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया" अंश का प्रतिनिधित्व करती है। चरण 3.4 और 3.17 से छर्रों के साथ यह गोली -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत की जा सकती है और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए तैयार हैं।

Representative Results

वर्तमान प्रोटोकॉल में माइटोकॉन्ड्रियल शुद्धता की बढ़ती डिग्री के साथ तीन नमूने उत्पन्न होते हैं: कुल कोशिकाएं, कच्चे माइटोकॉन्ड्रिया ("माइटो-क्रूड"), और शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया ("माइटो-प्योर") (चित्रा 1)। हमने एक जेल और इम्यूनोब्लोटिंग पर प्रत्येक अंश की समान प्रोटीन मात्रा लोड करके रॉ 264.7 मैक्रोफेज सेल लाइन से माइटोकॉन्ड्रिया के शुद्धिकरण को मान्य किया, और पाया कि माइटोकॉन्ड्रियल साइट्रेट सिंथेज़ (सीएस) प्रत्येक शुद्धि चरण में समृद्ध था; इस बीच, साइटोसोल (जीएपीडीएच), प्लाज्मा झिल्ली (एनए / के एटीपीस), नाभिक (लैमिन बी), लाइसोसोम (लैंप 1), और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) (पीडीआई) से प्रोटीन उत्तरोत्तर गायब हो गए (चित्रा 2 ए)। बीएमडीएम का उपयोग करके इसी तरह के परिणाम प्राप्त किए गए थे। पृथक माइटोकॉन्ड्रिया की शुद्धता और अखंडता के आगे सत्यापन के लिए, शुद्ध माइटोकॉन्ड्रियल अंश पर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की गई थी। हमने माइटोकॉन्ड्रिया को एक शास्त्रीय अंडाकार आकार और बरकरार क्रिस्टे के साथ देखा, जो एंटीबॉडी-लेपित मोतियों के अनुरूप इलेक्ट्रॉन-घने कणों से घिरा हुआ है (चित्रा 2 बी)। इसलिए, यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि हमारा प्रोटोकॉल माइटोकॉन्ड्रिया को समृद्ध करता है, अन्य सेलुलर घटकों को कम करता है, और माइटोकॉन्ड्रियल संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखता है।

इसके बाद, मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी / एमएस) के साथ युग्मित तरल क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके प्रत्येक अंश का एक प्रोटिओम विश्लेषण किया गया था। कुल कोशिकाओं से अर्क में कुल 6,248 प्रोटीन, जिनमें से 907 को पहले माइटोकार्टा 3.0 इन्वेंट्री5 में माइटोकॉन्ड्रियल के रूप में एनोटेट किया गया था, की पहचान की गई थी। कम से कम दो अद्वितीय पेप्टाइड्स की सीमा के साथ प्रोटीन के लिए फ़िल्टर करने के बाद, हमने कुल कोशिकाओं की तुलना में उनकी तीव्रता के आधार पर प्रत्येक नमूने में प्रत्येक प्रोटीन के लिए एक संवर्धन स्कोर की गणना की। फिर हमने प्रोटीन को सात प्रमुख उपकोशिकीय डिब्बों में आवंटित किया: माइटोकॉन्ड्रिया, ईआर, लाइसोसोम, गोल्गी तंत्र, साइटोस्केलेटन, न्यूक्लियस और साइटोसोल, जीन ऑन्कोलॉजी (जीओ) 16,17 और मिटोकार्टा 3.05 का उपयोग संदर्भ के रूप में। महत्वपूर्ण रूप से, माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन के लिए एक औसत संवर्धन क्रमशः कच्चे और शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया अंशों में 10 गुना और 20 गुना से अधिक देखा गया था (चित्रा 2 सी)। इसके विपरीत, विश्लेषण किए गए अन्य छह सेलुलर डिब्बों के घटक शुद्धिकरण प्रक्रिया के दौरान समाप्त हो गए थे। विशेष ध्यान दें, कच्चे माइटोकॉन्ड्रिया अंश में, हमने ईआर और लाइसोसोमल प्रोटीन के लिए एक क्षणिक संवर्धन देखा, संदूषक प्रोटीन के दो वर्ग अक्सर अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन प्रोटोकॉल18 के बाद मौजूद होते हैं। यह संभवतः ऑर्गेनेल-ऑर्गेनेल इंटरैक्शन और अवसादन के समान गुणांक के कारण था, विशेष रूप से लाइसोसोम के लिए, जो मैक्रोफेज19 में अत्यधिक प्रचुर मात्रा में हैं। जबकि दोनों ज्यादातर प्रतिरक्षा कैप्चर के बाद समाप्त हो गए थे, हमने माइटो-शुद्ध अंश में ईआर-माइटोकॉन्ड्रिया संपर्क साइटों से प्रोटीन के लिए एक छोटे से संकेत का पता लगाया।

फिर हमने सीधे कुल कोशिकाओं और माइटो-शुद्ध नमूनों से प्रोटीन की प्रचुरता की तुलना की और माइटोकॉन्ड्रियल और गैर-माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन (चित्रा 2 डी) के अनुरूप दो अलग-अलग आबादी देखी। जबकि माइटोकार्टा प्रोटीन का विशाल बहुमत एक साथ क्लस्टर किया गया था, हमने कुछ (<5%) पाए जो गैर-माइटोकार्टा प्रोटीन के साथ क्लस्टर थे। ये प्रोटीन (1) साइटोसोलिक माइटोकॉन्ड्रिया-इंटरैक्टिंग प्रोटीन (माइटोकार्टा के संस्करण 3.0 में एनोटेट की गई एक नई श्रेणी), (2) दोहरे-स्थानीयकृत प्रोटीन, या (3) गलत-एनोटेट प्रोटीन का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। इसके विपरीत, हमें माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन के साथ गैर-माइटोकार्टा प्रोटीन क्लस्टरिंग के कुछ उदाहरण मिले। जबकि ऐसे प्रोटीन अलगाव प्रक्रिया के दूषित पदार्थों का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं, वे प्रोटीन का भी प्रतिनिधित्व कर सकते हैं जिन्हें पहले माइटोकॉन्ड्रिया में मौजूद होने के रूप में वर्गीकृत नहीं किया गया था।

संभावित माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन के इस नए वर्ग की जांच करने के लिए, घटाए गए प्रोटिओमिक्स, एक दृष्टिकोण जो माइटोकॉन्ड्रिया 6,12 सहित ऑर्गेनेलर प्रोटिओम की खोज के लिए उपयोगी साबित हुआ है, का उपयोग किया गया था। घटाव प्रोटिओमिक्स मानता है कि शुद्धि चरणों के दौरान माइटोकॉन्ड्रिया समृद्ध हो जाना चाहिए, और दूषित पदार्थों को समाप्त हो जाना चाहिए6. उदाहरण के लिए, जबकि संदूषक अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन (जैसे, समान अवसादन गुणों के कारण) या प्रतिरक्षा कैप्चर के दौरान (जैसे, गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी बाइंडिंग के कारण) जमा हो सकते हैं, केवल बोनाफाइड माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन को दोनों में महत्वपूर्ण रूप से जमा होना चाहिए। इस प्रकार प्रोटीन को फ़िल्टर करना संभव है जो शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया अंश में पाए गए थे लेकिन संवर्धन के असंगत पैटर्न दिखाते थे। रॉ 264.7 कोशिकाओं के साथ वर्तमान उदाहरण में, माइटो-क्रूड और माइटो-प्योर नमूनों के लिए ≥1 के अद्वितीय पेप्टाइड्स के लिए एक सीमा निर्धारित करके, और संवर्धन की कड़ी सीमा का उपयोग करके, हम अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद कच्चे माइटोकॉन्ड्रियल अंश में शुरू में पाए जाने वाले 1,127 प्रोटीनों से बरामद माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटिओम की सूची को परिष्कृत करने में सक्षम थे, जो टॉम 22 इम्यूनोसिलेक्शन का उपयोग करके शुद्धिकरण के दूसरे दौर के बाद 481 प्रोटीन तक नीचे था। माइटो-शुद्ध अंश में माइटोकार्टा एनोटेट प्रोटीन की कम संख्या चयन के लिए लागू उच्च स्ट्रिंगको दर्शाती है। दिलचस्प बात यह है कि माइटो-शुद्ध अंश में मौजूद 70 प्रोटीन मिटोकार्टा 3.0 इन्वेंट्री (चित्रा 3 ए, बी) में मौजूद नहीं थे। ये बाद के प्रोटीन संभावित उपन्यास माइटोकॉन्ड्रियल उम्मीदवार प्रोटीन का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं, जिन्हें केवल रॉ 264.7 मैक्रोफेज सेल लाइन और संबंधित कोशिकाओं में व्यक्त किया जा सकता है, और जो आगे की जांच के योग्य हैं।

Figure 1
चित्रा 1: दो-चरण, टैग-मुक्त माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव प्रोटोकॉल का चित्रण । (ए) एक सेल निलंबन 25 ग्राम सुई के माध्यम से बाधित होता है। (बी) नाभिक और पूरी कोशिकाओं को 2,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अलग किया जाता है और सतह पर तैरनेवाला बचाया जाता है। (ग) कच्चे माइटोकॉन्ड्रिया को 13,000 x g (माइटो-क्रूड) पर सुपरनैटेंट के अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अलग किया जाता है। (डी) क्रूड माइटोकॉन्ड्रिया को तब टॉम 22 एंटीबॉडी (एबी) के साथ इनक्यूबेट किया जाता है जो सुपरपैरामैग्नेटिक बीड्स से सहसंयोजक रूप से जुड़ा होता है। (ई) माइटोकॉन्ड्रिया-टॉम 22 एंटीबॉडी-बीड्स कॉम्प्लेक्स को चुंबकीय स्तंभों का उपयोग करके दूषित पदार्थों से अलग किया जाता है और संश्लेषित किया जाता है। (एफ) शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया को सेंट्रीफ्यूजेशन (माइटो-प्योर) द्वारा एकत्र और केंद्रित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. दो मैक्रोफेज स्रोतों से माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव के प्रतिनिधि परिणाम। (ए) माइटोकॉन्ड्रियल साइट्रेट सिंथेज़ (सीएस - माइटोकॉन्ड्रिया), ग्लिसराल्डिहाइड 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (गैप्ड - साइटोसोल), सोडियम-पोटेशियम पंप (एनए / के एटीपीस - प्लाज्मा झिल्ली), लैमिन बी (लैमिन बी - न्यूक्लियस), लाइसोसोमल से जुड़े झिल्ली प्रोटीन 1 (लैंप 1 - लाइसोसोम), और प्रोटीन डाइसल्फ़ाइड-आइसोमेरेज़ (पीडीआई - ईआर) के एंटीबॉडी का उपयोग करके रॉ 264.7 (ऊपर) और बीएमडीएम कोशिकाओं (नीचे) का प्रोटीन इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण। (बी) रॉ 264.7 कोशिकाओं से शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया की इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी। माइटोकॉन्ड्रिया के आसपास के उच्च घनत्व वाले कण टॉम 22 मोतियों के अनुरूप होते हैं जो स्तंभों से क्षालन के बाद माइटो-शुद्ध नमूनों के साथ किए जाते हैं। स्केल बार: 80 एनएम। (सी) रॉ 264.7 कोशिकाओं में सात सेलुलर डिब्बों से कुल कोशिकाओं, माइटो-क्रूड और माइटो-प्योर में संवर्धन स्कोर। मिटोकार्टा 3.0 और जीओ का उपयोग प्रोटीन एनोटेशन के लिए किया गया था और औसत स्कोर का प्रतिनिधित्व किया जाता है। संक्षिप्त नाम: ईआर = एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम। (डी) कुल कोशिकाओं में प्रोटीन के लिए प्रोटीन प्रचुरता मान (आरआईबीएक्यू) और रॉ 264.7 कोशिकाओं से माइटो-शुद्ध नमूने। माइटोकार्टा 3.0 प्रोटीन नारंगी में दिखाए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. "घटाव प्रोटिओमिक्स का उपयोग करके नए माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की खोज". (ए) उपन्यास माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की खोज के लिए घटाव प्रोटिओमिक्स रणनीति। झूठी सकारात्मकता के चयन को कम करने के लिए उच्च चयन सीमा (4x और 2x) लागू की जाती है। (बी) नए माइटोकॉन्ड्रियल उम्मीदवार प्रोटीन की संवर्धन पैदावार (कुल कोशिकाओं की गुना) जो पहले मिटोकार्टा 3.0 इन्वेंट्री में एनोटेट नहीं की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

हमने माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव के लिए बेहतर शुद्धता प्राप्त करने के लिए अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन और इम्यूनोकैप्चर को जोड़ा है। हमारी प्रक्रिया उपन्यास माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की पहचान और लक्षण वर्णन के लिए प्राथमिक सामग्री तक पहुंच की अनुमति देती है। प्रोटोकॉल सीधा और मजबूत है, और आनुवंशिक संशोधन की आवश्यकता के बिना सेल लाइनों, प्राथमिक कोशिकाओं और ऊतकों पर लागू किया जा सकता है। हमने शुद्धिकरण प्रक्रिया के दौरान विभिन्न चरणों में लिए गए नमूनों पर इम्यूनोब्लॉटिंग और प्रोटिओमिक्स विश्लेषण द्वारा हमारे प्रोटोकॉल को मान्य किया है।

एकल अलगाव विधियों की तुलना में, विभिन्न प्रकृति के संवर्धन चरणों का संयोजन - यहां, सेंट्रीफ्यूजेशन और प्रतिरक्षा लेबलिंग - माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने के लिए एक अधिक मजबूत प्रोटोकॉल उत्पन्न करता है। ऐसा इसलिए है, क्योंकि जबकि माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन दोनों शुद्धिकरण में समृद्ध हो जाएंगे, यह संभावना नहीं है कि दोनों संवर्धन चरणों के बाद दूषित पदार्थों को भी समृद्ध किया जाएगा। यद्यपि उच्च माइटोकॉन्ड्रियल शुद्धता घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा भी प्राप्त की जा सकती है, इस दृष्टिकोण के लिए बड़ी मात्रा में प्रारंभिक सामग्री और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज तक पहुंच की आवश्यकता होती है। अंत में, टैग-आधारित माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव20 पर आधारित हालिया तरीकों के विपरीत, हमारे दृष्टिकोण को नमूने के आनुवंशिक संशोधन की आवश्यकता नहीं है, जिससे यह किसी भी स्रोत से प्राथमिक सामग्री के लिए उपयुक्त है।

हमारे प्रोटोकॉल को लागू करते समय प्रयोगात्मक डिजाइन में कुछ तकनीकी और जैविक विचारों को ध्यान में रखा जाना चाहिए। (1) पर्याप्त सामग्री प्राप्त करने के लिए प्रारंभिक सामग्री की मात्रा महत्वपूर्ण है। अनिवार्य रूप से, होमोजेनाइजेशन (चरण 3.10) के दौरान माइटोकॉन्ड्रिया की एक छोटी संख्या खो जाएगी, क्योंकि सभी कोशिकाओं को लाइसिस नहीं किया जाता है, या तीन कॉलम वॉश (चरण 4.6) के दौरान। जबकि हमारा प्रोटोकॉल उपज पर शुद्धता पर केंद्रित है, माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव की दक्षता, और इसलिए उनकी उपज, को मापा या अनुकूलित नहीं किया गया है। अधिक टॉम 22 मोतियों और अधिक कॉलम का उपयोग करने से माइटोकॉन्ड्रिया वसूली की उपज में वृद्धि होने की उम्मीद है। इसी समय, होमोजेनाइजेशन चरण का एक संपूर्ण अनुकूलन भी माइटोकॉन्ड्रियल उपज में सुधार कर सकता है। यह प्रोटोकॉल और प्रारंभिक सेल नंबर जो हम रॉ 264.7 कोशिकाओं और बीएमडीएम के लिए यहां रिपोर्ट करते हैं, प्रोटिओमिक्स के लिए पर्याप्त हैं और अन्य अनुप्रयोगों के लिए समायोजित किए जा सकते हैं। प्राथमिक बीएमडीएम के मामले में, हमने पाया कि एक प्रतिकृति के लिए एक माउस पर्याप्त था। जब आवश्यक हो, तो प्रक्रिया को कई जानवरों से बीएमडीएम को अलग करने के लिए बढ़ाया जा सकता है, जिसे तब पर्याप्त सामग्री प्राप्त करने के लिए पूल किया जा सकता है। सेल नंबर को सेल प्रकार, इसके आकार और इसकी माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री के आधार पर अनुकूलित किया जा सकता है। (2) टॉम 22 सभी सेल प्रकारों और ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया पर व्यक्त किया जाता है।21, लेकिन इसकी अभिव्यक्ति का स्तर भिन्न हो सकता है। इसलिए, विभिन्न स्थितियों की तुलना करने के लिए एक प्रयोग डिजाइन करते समय, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि टॉम 22 के अभिव्यक्ति स्तर तुलनीय हैं। इसके अलावा, टॉम 22 की सर्वव्यापी अभिव्यक्ति के कारण, जटिल ऊतकों के भीतर सेल-प्रकार विशिष्ट माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन का अध्ययन करना संभव नहीं है। (3) शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया (लगभग 2.5 घंटे) उत्पन्न करने के लिए आवश्यक समय क्षणिक घटनाओं के अध्ययन के साथ असंगत है, जैसे कि चयापचय प्रोफाइल में परिवर्तन। इस मामले में, हम प्रत्यक्ष टैग-आधारित प्रतिरक्षा कैप्चर की सलाह देते हैं।9, जो सेल-प्रकार विशिष्ट माइटोकॉन्ड्रिया का अध्ययन करने की भी अनुमति देता है। in vivo20. (4) हालांकि अकेले टॉम 22 एंटीबॉडी-लेबल मोतियों का उपयोग करके प्राप्त पृथक माइटोकॉन्ड्रिया पर अध्ययन ने कार्यात्मक परख में गतिविधि दिखाई है।11, यह निर्धारित किया जाना बाकी है कि क्या हमारे प्रोटोकॉल के साथ उत्पन्न माइटोकॉन्ड्रिया डाउनस्ट्रीम गतिविधि-आधारित परख के साथ संगत हैं। माइटोट्रैकर या टेट्रामेथिलरोडामाइन मिथाइल एस्टर परक्लोरेट (टीएमआरएम) धुंधलापन, या श्वसन-मेपन, पृथक माइटोकॉन्ड्रिया की कार्यक्षमता को निर्धारित करने के लिए संभावित दृष्टिकोण हैं।22. (5) कॉलम से "माइटो-प्योर" नमूने को सलामी देने के बाद, कुछ टॉम 22 मोती शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया अंश (चित्र 2B). जबकि हमने ट्रिप्सिन पाचन और प्रोटीन मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ कोई हस्तक्षेप नहीं देखा है, इन मोतियों और इम्युनोग्लोबुलिन की उपस्थिति को अन्य डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में ध्यान में रखा जाना चाहिए। टॉम 22 एंटीबॉडी चूहों में उत्पादित एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी है।23, और इसलिए यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि, इम्यूनोब्लोटिंग में चूहों के खिलाफ द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग करते समय, यह इम्युनोग्लोबुलिन श्रृंखलाओं के आकार में विशिष्ट बैंड उत्पन्न करेगा। (6) कोशिका निलंबन का पूर्ण समरूपीकरण माइटोकॉन्ड्रिया के सफल अलगाव के लिए महत्वपूर्ण है। यहां, हम RAW264.7 कोशिकाओं और BMDM दोनों को अलग करने के लिए 25 ग्राम सुई के साथ एक सिरिंज का उपयोग करते हैं। हालांकि, सेल प्रकार और इसके आकार के आधार पर, अन्य यांत्रिक होमोजेनाइज़ेशन विधियां, जैसे कि डोंस होमोजेनाइज़र का उपयोग, या सेल होमोजेनाइज़र उपकरणों जैसे अधिक नियंत्रित दृष्टिकोण, अधिक उपयुक्त हो सकते हैं। गैर-यांत्रिक समरूपीकरण विधियों, जैसे कि कोमल सोनिकेशन, पर भी विचार किया जा सकता है। ऊतक समरूपीकरण दृष्टिकोण अन्य अध्ययनों में आगे चर्चा की जाती है।24,25. (7) हालांकि इम्यूनोब्लोटिंग द्वारा सत्यापन सबसे सीधा और सस्ता तरीका है, इसके परिणाम हमेशा पूरे ऑर्गेनेल स्तर पर परिवर्तन के साथ सहसंबंधित नहीं हो सकते हैं। यही कारण है कि हम क्रमशः माइटोकॉन्ड्रिया और अन्य ऑर्गेनेल के संवर्धन या कमी को पूरी तरह से मान्य करने के लिए प्रोटिओमिक्स का उपयोग करने की सलाह देते हैं।

यहां वर्णित दो-चरण माइटोकॉन्ड्रिया शुद्धिकरण प्रोटोकॉल ने हमें माइटोकॉन्ड्रियल शुद्धता बढ़ाने के साथ अनुक्रमिक नमूने उत्पन्न करने की अनुमति दी है, और इसने हमें घटाव प्रोटिओमिक्स12 के माध्यम से नए माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन उम्मीदवारों की खोज करने में सक्षम बनाया है। हमारे विश्लेषण के लिए, हम काफी समृद्ध माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन का चयन करने के लिए कड़े थ्रेसहोल्ड का उपयोग करते हैं, और हालांकि यह कुछ ज्ञात माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन (चित्रा 3 ए) की पहचान करने में विफल हो सकता है, नए माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की खोज के लिए झूठी-सकारात्मक दर कम हो जाती है। फिर भी, यह जोर देना महत्वपूर्ण है कि हमारे प्रोटोकॉल द्वारा प्रकट किसी भी उम्मीदवार प्रोटीन को ऑर्थोगोनल दृष्टिकोण के माध्यम से मान्य किया जाना चाहिए। हम कार्बोक्सी-टर्मिनल जीएफपी-टैगिंग या अंतर्जात प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी के उपयोग की सलाह देते हैं ताकि माइटोकॉन्ड्रिया के साथ संबंध को सूक्ष्म रूप से या प्रोटीज संरक्षण परख द्वारा मान्य किया जा सके।

असंशोधित कोशिकाओं और ऊतकों के मामले में हमारी विधि का प्रत्यक्ष अनुप्रयोग यह जांचने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है कि स्वस्थ और रोग स्थितियों में माइटोकॉन्ड्रिया कैसे बदलते हैं और अपने पर्यावरण के अनुकूल होते हैं। सेल लाइनों, पशु रोग मॉडल, मानव तरल पदार्थ, और यहां तक कि सर्जरी से बायोप्सी के लिए हमारे प्रोटोकॉल का आवेदन माइटोकॉन्ड्रिया और उनके संबंधित विकारों की हमारी समझ को बढ़ाने के लिए विशेष रूप से उपयोगी साबित हो सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम उनकी मदद के लिए लॉज़ेन विश्वविद्यालय में मैनफ्रेडो क्वाड्रोनी, प्रोटीन विश्लेषण सुविधा और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सुविधा को धन्यवाद देते हैं। हम पांडुलिपि पर सलाह और प्रतिक्रिया के लिए एचजी स्प्रेंजर, के मौंड्रेल और जॉर्डन प्रयोगशाला के सदस्यों को भी धन्यवाद देते हैं। इस काम को फाउंडेशन पियरे-मर्सियर पोर ला साइंस और स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (परियोजना अनुदान 310030_200796) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD Plastipal 309628
25 G Needle BD Microlance 300400
40 µm cell strainer Corning 352340
Anti-TOM22 Microbeads, mouse Miltenyi Biotec 130-127-693
Cell scraper FisherScientific 11577692
DMEM, high glucose, GlutaMAX ThermoFisher 31966
Ethylenediaminetetraacetic acid FisherScientific BP-120-1
Fetal bovine serum Gibco 10270
HEPES BioConcept 5-31F00-H
LS columns and plungers Miltenyi Biotec 130-042-401
Macrophage colony-stimulating factor Immunotools 12343115 
Mannitol Sigma M4125
Sodium chloride Sigma 71380
Sucrose Sigma S1888
Penicillin/Streptomycin BioConcept 4-01F00-H
Petri dishes Corning BH93B-102
Phosphate-buffered saline 10X Eurobio Scientific CS3PBS01-01
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976
Vi-CELL BLU Cell Viability Analyzer Beckman Coulter C19196

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References

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बेहतर प्रोटीन खोज और परिमाणीकरण के लिए माइटोकॉन्ड्रिया का दो-चरण टैग-मुक्त अलगाव
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Blanco-Fernandez, J., Jourdain, A.… More

Blanco-Fernandez, J., Jourdain, A. A. Two-Step Tag-Free Isolation of Mitochondria for Improved Protein Discovery and Quantification. J. Vis. Exp. (196), e65252, doi:10.3791/65252 (2023).

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