Summary
Vi presenterer en to-trinns protokoll for høykvalitets mitokondrieisolering som er kompatibel med proteinoppdagelse og kvantifisering på proteomskala. Vår protokoll krever ikke genteknologi og er dermed egnet for å studere mitokondrier fra primære celler og vev.
Abstract
De fleste fysiologiske prosesser og sykdomsprosesser, fra sentral metabolisme til immunrespons mot nevrodegenerasjon, involverer mitokondrier. Mitokondriell proteom består av mer enn 1000 proteiner, og overflod av hver kan variere dynamisk som respons på ytre stimuli eller under sykdomsprogresjon. Her beskriver vi en protokoll for isolering av mitokondrier av høy kvalitet fra primære celler og vev. To-trinns prosedyren omfatter (1) mekanisk homogenisering og differensialsentrifugering for å isolere rå mitokondrier, og (2) tagfri immunfangst av mitokondrier for å isolere rene organeller og eliminere forurensninger. Mitokondrielle proteiner fra hvert rensetrinn analyseres ved kvantitativ massespektrometri, og anrikningsutbytter beregnes, slik at oppdagelsen av nye mitokondrielle proteiner ved subtraktiv proteomikk kan oppdages. Vår protokoll gir en sensitiv og omfattende tilnærming til å studere mitokondrielt innhold i cellelinjer, primære celler og vev.
Introduction
Mitokondrier er komplekse og dynamiske organeller som er i stand til å fornemme og tilpasse seg cellens metabolske behov. Mitokondrier er sentrale for kompleksiteten i cellulær metabolisme og fungerer som metabolske knutepunkter der karbohydrat-, protein-, lipid-, nukleinsyre- og kofaktormetabolismereaksjoner konvergerer1. De tjener også som signalorganeller for veier av den medfødte immunresponsen og som respons på endringer i ioner og reaktive oksygenarter 2,3. Hittil har rundt 1,100 proteiner blitt kartlagt til mitokondrier 4,5,6, men vi kan anta at mange flere gjenstår å bli oppdaget, spesielt de som bare uttrykkes i visse celletyper eller forbigående under spesifikke miljøforhold. Utvikling av nye tilnærminger for å kvantifisere endringer i mitokondriell sammensetning i metabolske tilstander av interesse vil øke vår kunnskap om disse organellene og fremheve nye terapeutiske veier for lidelsene preget av mitokondriell dysfunksjon7.
For tiden er forskjellige mitokondrieisolasjonsprotokoller tilgjengelige, med forskjellige utbytter og renhetsnivåer8. Sentrifugeringsbaserte tilnærminger er de mest populære på grunn av deres enkelhet og lave kostnader. Selv om differensiell sentrifugering er egnet for de fleste applikasjoner, har den ulempen at den oppnår lavere mitokondriell renhet og krever store mengder utgangsmateriale når mer komplekse tetthetsgradientbaserte applikasjoner brukes. De siste årene har nye metoder for mitokondrieisolering dukket opp, som tag-basert immunfangst ("MITO-IP")9 og fluorescensaktivert organellsortering10. Selv om begge prosedyrene kan generere prøver med høy renhet, krever førstnevnte genteknologi for å merke mitokondrier for affinitetsrensing, noe som gjør protokollene uforenlige med primærmateriale fra umodifiserte organismer eller menneskelige givere. Samtidig er sistnevnte avhengig av tilgang til flowcytometri og sorteringsinstrumenter. Å kombinere forskjellige isolasjonsmetoder gir løftet om å generere mer robuste protokoller og økt renhet.
Her presenterer vi en ny protokoll for mitokondrieisolering basert på kombinasjonen av to eksisterende metoder: (1) differensiell sentrifugering for å isolere en rå mitokondriefraksjon, og (2) tagfri immunopptak av mitokondrier med superparamagnetiske perler kovalent bundet til antistoffer mot translokase av ytre mitokondriemembran 22 (Tomm22)11, et allestedsnærværende mitokondrielt ytre membranprotein (figur 1). Prosedyren vi beskriver er kompatibel med kvantitativ proteinmassespektrometri, og fordi den er tagfri og ikke krever genetisk manipulasjon, kan den brukes på et bredt spekter av forskningsmodeller, fra cellelinjer til kroppsvæsker til hele dyrevev. Videre muliggjør bruken av to trinn i protokollen bruk av subtraktiv proteomikk 6,12 for oppdagelsen av nye mitokondrielle proteiner og studiet av deres uttrykk.
Protocol
Hansker må brukes til enhver tid og cellekulturtrinn må utføres under en laminær hette. Cellene vedlikeholdes i en 37 °C inkubator med 5% CO2. Forskningen som presenteres i denne protokollen ble godkjent og utført i samsvar med Universitetet i Lausanne og sveitsiske retningslinjer for bruk av dyr.
1. Kultur av RAW264.7 makrofagcellelinje
- Dyrk musens makrofag RAW264.7-celler i Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) med høy glukose og glutamin supplert med 5% varmeinaktivert føtal bovint serum (HI-FBS) og 100 IE / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin (P / S).
MERK: For å isolere mitokondrier er en enkelt konfluent 15 cm plate (ca. 70 x 107 RAW264.7-celler) tilstrekkelig. - Vedlikehold RAW264.7-cellene i vevskulturplater. En innledende såtetthet på 1 x 105 celler / ml fører til en konfluerende plate på 3 dager. Bruk 25 ml cellesuspensjon i mediet for en 15 cm plate. RAW264.7-celler har en høy celledelingshastighet og må splittes oftere enn de fleste cellelinjer.
- Koble fra RAW264.7-celler
- Aspirer mediet og vask cellene en gang med fosfatbufret saltvann (PBS).
- For en 15 cm plate, tilsett 8 ml varm RÅ dissosiasjonsbuffer (270 mM kaliumklorid, 30 mM natriumcitratdihydrat i H2O, sterilt filtrert) og inkuber cellene ved 37 °C i 5 minutter.
- Legg til et tilsvarende volum media til platene (1: 1 fortynning av dissosiasjonsbufferen), og pipette for å løsne og homogenisere cellene.
- Overfør cellesuspensjonen til et konisk rør og sentrifuge røret ved 300 x g i 3 minutter ved romtemperatur.
- Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i et passende volum media (beskrevet i trinn 1.1) for celletelling.
MERK: Andre metoder for å løsne RAW264.7-celler kan brukes, for eksempel trypsin eller en celleskraper. Imidlertid er disse metodene strengere på cellene og kan føre til polarisering i M1-lignende makrofager i dagene etter løsrivelse.
2. Isolering og dyrkning av benmargsderiverte makrofager (BMDM)
MERK: Protokollen beskrevet her er for en enkelt mus og kan skaleres opp for flere mus. Detaljerte protokoller for BMDM-isolasjon og kultur er beskrevet andre steder13,14.
- Ofre en 8-12 uker gammel C57BL/6 mus med en høy dose CO2.
MERK: Enten hann- eller hunnmus kan brukes. - Spray musen med 75% etanol for å sterilisere den.
- Dissekere og samle hofter, lårben og tibias fra musen15.
- For å samle benmargen fra lårbenene og tibias, fjern kneleddenden av begge bein15. Gjenopprette benmarg fra hoftene ved å fjerne acetabulum.
- Overfør knoklene til et 50 ml konisk rør med 4 ml BMDM-medier holdt på is (DMEM med høy glukose og glutamin supplert med 5% HI-FBS, P/S og 10 mM HEPES).
MERK: Det er viktig å holde beinene i media for å unngå tørking av benmargen under disseksjon. - Tilsett 4 ml PBS og 4 ml varmt BMDM-medium i to forskjellige brønner i en 6-brønnsplate.
- Overfør bein og media fra 50 ml konisk rør til en tom brønn på 6-brønnsplaten.
- Bruk et par tang, overfør beinene til PBS-brønnen for å vaske dem.
- Overfør beinene til brønnen som inneholder varmt BMDM-medium.
- Lag et hull på 1-2 mm i diameter i bunnen av to 0,5 ml rør med tangen og plasser dem i et 1,5 ml rør.
MERK: Det er ikke nødvendig å legge til medier i røret for dette raske trinnet. - I hvert 0,5 ml rør, plasser et lårben, tibia og hofte på en slik måte at benmargen til de eksponerte beinene vender mot bunnen av rørene.
- Sentrifuger rørene ved 13 000 x g i 1 min ved romtemperatur for å samle benmargen og gjenværende medier gjennom hullet på 0,5 ml røret og inn i 1,5 ml røret. Kast 0,5 ml rørene med beinene.
- Resuspender benmargspellets i BMDM media og overfør til en 15 ml konisk tube.
- Legg til BMDM-medier opptil 10 ml.
- Plasser en 40 μm cellesil på et 50 ml konisk rør og filtrer benmargssuspensjonen gjennom den.
- Sentrifuger den filtrerte suspensjonen ved 300 x g i 5 minutter ved romtemperatur for å gjenopprette de intakte cellene og fjerne små rusk fra cellesuspensjonen.
- Klargjør 70 ml BMDM-medier supplert med 50 ng/ml makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF).
- Resuspender pelleten i 10 ml M-CSF-supplert BMDM-medium.
- Tilsett 9 ml M-CSF-supplert BMDM-medium til hver av de syv 10 cm petriskålene.
- Tallerken 1 ml celler (ca. 1 x 107 celler) i hver av de syv 10 cm petriskålene.
- Homogeniser cellesuspensjonen i hver plate ved å pipettere forsiktig opp og ned på platen og overføre platene til inkubatoren.
- Etter 3 dager tilsettes 5 ml varmt BMDM-medium supplert med 50 ng/ml M-CSF på hver plate.
- Etter 3 dager (dag 6, etter benmargsisolering), verifiser adhesjon og differensiering av BMDM ved mikroskopi.
MERK: På dette tidspunktet er det mulig å gå videre til mitokondrieisolasjon (trinn 3). Alternativt kan man relatere BMDM, som gjør det mulig å behandle dem med cytokiner og små molekyler. - Løsne BMDM-ene
- Aspirer mediet fra hver plate og tilsett 7 ml kald PBS supplert med 5 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA).
- Inkuber cellene ved 4 °C i 7-8 minutter.
- Ta av BMDM-ene ved å pipettere forsiktig opp og ned med en 10 ml pipette.
- Slå sammen de resuspenderte BMDM-ene fra alle syv platene til et enkelt 50 ml konisk rør og sentrifuge ved 300 x g i 3 minutter ved romtemperatur.
- Aspirer supernatanten og resuspender cellene i 40 ml varmt BMDM-medium for celletelling.
MERK: Mellom 7-9 x 107 BMDM oppnås per mus. Minimum 6 x 107 BMDM for mitokondrieisolering anbefales for proteomikk. - Om ønskelig, plate og behandle BMDM-ene i henhold til eksperimentelt mål. Hvis ikke, fortsett direkte til trinn 3.3.
3. Fremstilling av en rå mitokondriell fraksjon ved differensial sentrifugering
MERK: Utfør alle sentrifugeringstrinn ved 4 °C. To sentrifuger kreves, en med en utsvingbar rotor og adaptere for koniske rør med en relativ sentrifugalkraft på minst 300 x g, den andre med en relativ sentrifugalkraft på minst 21 000 x g egnet for 1,5 ml rør. Når du bruker adherente celler, bruk en celleskraper.
- For adherente celler, aspirer mediet og tilsett 10 ml PBS per 15 cm plate.
MERK: Skraping av celler i PBS gjør at man kan vaske dem samtidig. Hvis cellene allerede er i suspensjonen, går du direkte til trinn 3.3. - Løsne cellene ved hjelp av en celleskraper og samle dem i et enkelt 50 ml konisk rør. Homogeniser cellesuspensjonen ved å pipettere opp og ned.
MERK: Celler kan løsnes ved hjelp av en celleskraper, siden dette er raskere og de vil bli lysert kort tid etter. - For hver eksperimentell tilstand, overfør 5% av cellesuspensjonsvolumet til et 1,5 ml rør og sentrifuger det ved 300 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
MERK: Når du bruker suspensjonsceller, må du vaske cellene en gang med PBS før, for å fjerne mulige forurensninger fra mediet som FBS. - Kast supernatanten og oppbevar pelleten på is.
MERK: Dette vil representere "total celle" fraksjon for proteomikk. - Sentrifuger resten av prøvene fra trinn 3,1 eller 3,2 ved 300 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
- Utfør alle følgende trinn på is og bruk iskalde buffere.
- Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten i 5 ml iskald mitokondriebuffer (MB) (210 mM mannitol, 70 mM sukrose, 10 mM HEPES/NaOH [pH 7,4] og 1 mM EDTA).
- Gjenvinn cellene ved sentrifugering ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Resuspender cellepelleten i 0,5 ml kald MB og overfør den til et 1,5 ml rør.
MERK: Denne prosedyren gir en omtrentlig cellekonsentrasjon på 1,5 x 10 8 BMDM-celler/ml eller 3 x 108 RAW264,7 celler/ml. - Bruk en 1 ml sprøyte påsatt en 25 G kanyle til å homogenisere cellesuspensjonen med 30 passasjer gjennom nålen (figur 1A).
- Tilsett 1 ml kald MB i røret og bland ved inversjon. Sentrifuger den homogeniserte cellesuspensjonen ved 2000 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Overfør 1 ml av supernatanten til et nytt 1,5 ml rør på is uten å forstyrre cellepelleten. Resuspender cellepelleten og homogeniser den igjen, som i trinn 3.7.
- Slå sammen den homogeniserte cellepelleten og supernatanten fra de to foregående trinnene i et enkelt 1,5 ml rør og sentrifuger det ved 2000 x g i 5 minutter ved 4 °C.
MERK: På dette tidspunktet inneholder pelleten for det meste kjerner og ubrutte celler og kasseres. Supernatanten inneholder cellulært rusk, cytosol og organeller, inkludert mitokondrier (figur 1B). - Del supernatanten på fire rør på 1,5 ml.
MERK: Deling av supernatanten mellom flere rør på dette stadiet forbedrer fjerningen av kontaminanter i de følgende trinnene. - Legg MB for å lage et endelig volum på 1 ml i hver av de fire rørene. Bland ved inversjon og sentrifuger rørene ved 13 000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
NOTAT: Etter dette trinnet er en pellet med to lag synlig. Den nederste, faste, brune pelleten inneholder mitokondrier og holdes for videre rensing (figur 1C). Den øvre, løse, hvite pelleten inneholder andre cellulære strukturer og kan kastes. - Utfør dette trinnet nøye. Fjern supernatanten med så mye av den hvite øvre pelleten som mulig. Ved å pipettere forsiktig på den, er det mulig å resuspendere den hvite pelleten og deretter kaste den, slik at den brune mitokondrielle pelleten forblir intakt.
- Hold ett av de fire rørene med mitokondriepelleten på is. Dette representerer "rå mitokondrier" fraksjon for proteomikk.
- Slå sammen de tre andre pellets i et 1,5 ml rør i et endelig volum på 1 ml MB.
4. Superparamagnetisk antistoffbasert rensing av mitokondrier
MERK: Utfør alle de følgende trinnene i et kaldt rom ved 4 °C.
- Overfør 1 ml av det rå mitokondriepreparatet fra trinn 3,18 til et 15 ml konisk rør og tilsett 7 ml MB supplert med 150 mM NaCl (MB + NaCl).
MERK: Tilsetning av NaCl forbedrer antistoffbindingen og reduserer uspesifikk binding av forurensningene til kulene og mitokondriene. - Tilsett 50 μL Tomm22-perler til den 8 ml rå mitokondriefjæringen (figur 1D) og inkuber røret i 15 minutter ved 4 °C på et roterende hjul ved lav hastighet.
MERK: Tomm22-perler er kovalent bundet til Tomm22 monoklonale antistoffer hevet i mus, koblet til superparamagnetiske perler. - I mellomtiden plasserer du en kolonne på magneten.
- Balanser kolonnen med 8 ml MB + NaCl og kast gjennomstrømningen.
- Etter 15 minutters inkubasjon ved 4 °C av prøven med Tomm22-perlene, overfør prøven til kolonnen. Forkast gjennomstrømningen.
MERK: Mitokondrier vil forbli festet til magnetkulene i kolonnen (figur 1E). - Vask kolonnen tre ganger med 8 ml MB + NaCl.
- Fjern kolonnen fra magneten og plasser den i et 15 ml konisk rør.
- Elute mitokondriene ved å legge 1,5 ml MB + NaCl til kolonnen og påfør et stempel umiddelbart for å eluere de rensede mitokondriene i røret.
- Overfør de eluerte mitokondriene til et 1,5 ml rør og sentrifuger det ved 21 000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
MERK: En brun pellet vil dannes. Denne inneholder de isolerte mitokondriene og noen av de antistoffkoblede kulene (figur 1F). - Fjern supernatanten forsiktig fra pelleten. Pelleten representerer fraksjonen "rene mitokondrier" for proteomikk. Denne pelleten sammen med pellets fra trinn 3.4 og 3.17 kan lagres ved -20 °C og er klar for nedstrøms applikasjoner.
Representative Results
I denne protokollen genereres tre prøver med økende grad av mitokondriell renhet: totalceller, rå mitokondrier ("mito-crude") og rene mitokondrier ("mito-pure") (figur 1). Vi validerte rensingen av mitokondrier fra RAW264.7-makrofagcellelinjen ved å laste like proteinmengder av hver fraksjon på en gel og immunoblotting, og fant at mitokondriell citratsyntase (Cs) ble anriket ved hvert rensetrinn; I mellomtiden forsvant proteiner fra cytosol (GAPDH), plasmamembranen (Na / K ATPase), kjernen (Lamin B), lysosomene (Lamp1) og endoplasmatisk retikulum (ER) (Pdi) gradvis (figur 2A). Lignende resultater ble oppnådd ved bruk av BMDM. For ytterligere validering av renheten og integriteten til de isolerte mitokondriene ble elektronmikroskopi på den rene mitokondriefraksjonen utført. Vi observerte mitokondrier med klassisk oval form og intakt cristae omgitt av elektrontette partikler svarende til de antistoffbelagte perlene (figur 2B). Derfor kan det konkluderes med at protokollen vår beriker mitokondrier, tømmer andre cellulære komponenter og opprettholder mitokondriell strukturell integritet.
Deretter ble det utført en proteomanalyse av hver fraksjon ved hjelp av væskekromatografi koblet til massespektrometri (LC/MS). Totalt 6.248 proteiner i ekstraktet fra totale celler, hvorav 907 tidligere var kommentert som mitokondrielle i MitoCarta3.0-beholdningen5, ble identifisert. Etter filtrering for proteiner med en terskel på minst to unike peptider, beregnet vi en anrikningsscore for hvert protein i hver prøve basert på intensiteten deres sammenlignet med totale celler. Vi tildelte deretter proteinene til syv store subcellulære rom: mitokondrier, ER, lysosomer, Golgi-apparat, cytoskjelett, kjerne og cytosol, ved å bruke genontologi (GO) 16,17 og MitoCarta3.05 som referanser. Det er viktig å merke seg at en gjennomsnittlig anrikning for mitokondrielle proteiner på mer enn 10 ganger og mer enn 20 ganger i henholdsvis rå og rene mitokondriefraksjoner ble observert (figur 2C). I motsetning til dette ble komponenter i de andre seks cellulære rommene som ble analysert, utarmet under renseprosedyren. Spesielt bemerkelsesverdig, i den rå mitokondriefraksjonen, observerte vi en forbigående anrikning for ER og lysosomale proteiner, to klasser av forurensende proteiner som ofte er tilstede etter differensielle sentrifugeringsprotokoller18. Dette skyldtes muligens organelle-organelle interaksjoner og lignende sedimentasjonskoeffisienter, spesielt for lysosomer, som er svært tallrike i makrofager19. Mens begge for det meste var utarmet etter immunfangst, oppdaget vi et lite signal for proteiner fra ER-mitokondrie-kontaktstedene i den mito-rene fraksjonen.
Vi sammenlignet deretter direkte proteinmengden fra totalcellene og fra mito-rene prøver og observerte to forskjellige populasjoner, tilsvarende mitokondrielle og ikke-mitokondrielle proteiner (figur 2D). Mens det store flertallet av MitoCarta-proteiner grupperte sammen, fant vi noen få (<5%) som grupperte seg med ikke-MitoCarta-proteiner. Disse proteinene kan representere (1) cytosoliske mitokondrier-interagerende proteiner (en ny kategori kommentert i versjon 3.0 av MitoCarta), (2) dobbeltlokaliserte proteiner eller (3) feilkommenterte proteiner. Omvendt fant vi noen få tilfeller av ikke-MitoCarta-proteiner som klynger seg sammen med mitokondrielle proteiner. Selv om slike proteiner kan representere forurensninger av isolasjonsprosedyren, kan de også representere proteiner som ikke tidligere er klassifisert som tilstede i mitokondrier.
For å undersøke denne nye klassen av potensielle mitokondrielle proteiner, subtraktiv proteomikk, en tilnærming som har vist seg nyttig for oppdagelsen av organellære proteomer, inkludert mitokondrier 6,12, ble brukt. Subtraktiv proteomikk forutsetter at mitokondrier skal bli beriket under rensetrinnene, og forurensninger skal bli utarmet6. For eksempel, mens forurensninger kan akkumuleres under differensiell sentrifugering (f.eks. på grunn av lignende sedimenteringsegenskaper) eller under immunfangst (f.eks. på grunn av ikke-spesifikk antistoffbinding), bør bare bona fide mitokondrielle proteiner akkumuleres signifikant i begge. Det er derfor mulig å filtrere ut proteiner som ble funnet i den rene mitokondriefraksjonen, men som viste inkonsistente anrikningsmønstre. I dette eksemplet med RAW264.7-celler, ved å sette en terskel for unike peptider på ≥1 for mito-råolje og mito-rene prøver, og ved hjelp av strenge terskler for anrikning, var vi i stand til å avgrense listen over gjenvunnede mitokondrielle proteomer fra 1,127 proteiner som opprinnelig ble funnet i den rå mitokondriefraksjonen etter differensialsentrifugering, ned til 481 proteiner etter den andre runden av rensing ved bruk av Tomm22 immunoseleksjon. Det reduserte antallet MitoCarta-kommenterte proteiner i den mito-rene fraksjonen gjenspeiler den høye strengheten som brukes for seleksjon. Interessant nok var 70 av proteinene tilstede i den mito-rene fraksjonen ikke tilstede i MitoCarta3.0-beholdningen (figur 3A, B). Disse sistnevnte proteinene kan representere potensielle nye mitokondrielle kandidatproteiner, som bare kan uttrykkes i RAW264.7-makrofagcellelinjen og i beslektede celler, og som fortjener videre undersøkelse.
Figur 1: Illustrasjon av den totrinns, kodefrie isolasjonsprotokollen for mitokondrier . (A) En cellesuspensjon forstyrres gjennom en 25 G kanyle. (B) Kjerner og hele celler separeres ved sentrifugering ved 2000 x g og supernatanten lagres. (C) Rå mitokondrier isoleres ved differensiell sentrifugering av supernatanten ved 13 000 x g (mito-rå). (D) Rå mitokondrier blir deretter inkubert med Tomm22-antistoffer (Ab) kovalent knyttet til superparamagnetiske perler. (E) Mitokondrier-Tomm22 antistoff-perlekompleksene skilles fra forurensninger ved hjelp av magnetiske kolonner og elueres. (F) Rene mitokondrier samles og konsentreres ved sentrifugering (mito-pure). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Representative resultater av mitokondrieisolering fra to makrofagkilder. (A) Proteinimmunoblotanalyse av RAW264.7 (øverst) og BMDM-celler (nederst) ved bruk av antistoffer mot mitokondriell citratsyntase (Cs - mitokondrier), glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (Gapdh - cytosol), natrium-kaliumpumpe (Na / K ATPase - plasmamembran), Lamin B (Lamin B-kjerne), lysosomalt assosiert membranprotein 1 (Lamp1-lysosom) og proteindisulfid-isomerase (Pdi - ER). (B) Elektronmikroskopi av rensede mitokondrier fra RAW264.7-celler. Partikler med høy tetthet rundt mitokondrier tilsvarer Tomm22-kulene som videreføres med mito-rene prøver etter eluering fra søylene. Vektstenger: 80 nm. (C) Anrikningsscore på tvers av totale celler, mito-crude og mito-pure fra syv cellulære rom i RAW264.7-celler. MitoCarta3.0 og GO ble brukt til proteinannotering og gjennomsnittlig score er representert. Forkortelse: ER = endoplasmatisk retikulum. (D) Proteinmengder verdier (riBAQ) for proteiner i totale celler og mito-rene prøver fra RAW264.7 celler. MitoCarta3.0 proteiner er vist i oransje. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Oppdagelse av nye mitokondrielle proteiner ved bruk av subtraktiv proteomikk. (A) Subtraktiv proteomikkstrategi for oppdagelsen av nye mitokondrielle proteiner. Høye terskler for seleksjon (4x og 2x) brukes for å minimere utvalget av falske positiver. (B) Anrikningsutbytte (fold av totale celler) av nye mitokondrielle kandidatproteiner som ikke tidligere er kommentert i MitoCarta3.0-beholdningen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Vi har kombinert differensialsentrifugering og immunfangst for å oppnå en forbedret renhet for mitokondrieisolering. Vår prosedyre gir tilgang til primærmateriale for identifisering og karakterisering av nye mitokondrielle proteiner. Protokollen er enkel og robust, og kan brukes på cellelinjer, primære celler og vev uten behov for genetisk modifisering. Vi har validert protokollen vår ved immunblotting og proteomikkanalyser på prøver tatt på forskjellige stadier gjennom renseprosedyren.
Sammenlignet med enkeltisolasjonsmetoder genererer kombinasjonen av anrikningstrinn av forskjellig art - her sentrifugering og immunmerking - en mer robust protokoll for å isolere mitokondrier. Dette skyldes at mens mitokondrielle proteiner vil bli beriket i begge rensingene, er det lite sannsynlig at forurensninger også vil bli anriket etter begge anrikningstrinnene. Selv om høy mitokondriell renhet også kan oppnås ved ultrasentrifugering av tetthetsgradient, krever denne tilnærmingen en stor mengde utgangsmateriale og tilgang til en ultrasentrifuge. Til slutt, i motsetning til nyere metoder basert på tag-basert mitokondriell isolasjon20, krever vår tilnærming ikke genetisk modifisering av prøven, noe som gjør den egnet for primærmateriale fra hvilken som helst kilde.
Noen tekniske og biologiske hensyn må tas i betraktning i det eksperimentelle designet når vi bruker protokollen vår. (1) Mengden utgangsmateriale er kritisk for å oppnå tilstrekkelig materiale. Uunngåelig vil et lite antall mitokondrier gå tapt under homogenisering (trinn 3.10), da ikke alle celler lyseres, eller under de tre kolonnevaskene (trinn 4.6). Mens protokollen vår fokuserer på renhet over utbytte, har effektiviteten av mitokondrieisolering, og dermed utbyttet, ikke blitt målt eller optimalisert. Bruk av flere Tomm22-perler og flere kolonner forventes å øke utbyttet av mitokondrieutvinning. Samtidig kan en grundig optimalisering av homogeniseringstrinnet også føre til forbedret mitokondrielt utbytte. Denne protokollen og de første cellenumrene vi rapporterer her for RAW264.7-celler og BMDM-er, er tilstrekkelige for proteomikk og kan justeres for andre applikasjoner. Når det gjelder primære BMDM-er, fant vi at en enkelt mus var tilstrekkelig for en replikasjon. Når det er nødvendig, kan prosedyren skaleres opp for å isolere BMDM fra flere dyr, som deretter kan samles for å oppnå tilstrekkelig materiale. Cellenummeret kan optimaliseres avhengig av celletype, størrelse og mitokondrieinnhold. (2) Tomm22 uttrykkes på mitokondrier fra alle celletyper og vev21, men uttrykksnivået kan variere. Når du designer et eksperiment for å sammenligne forskjellige forhold, er det derfor viktig å sikre at uttrykksnivåene til Tomm22 er sammenlignbare. Videre, på grunn av det allestedsnærværende uttrykket av Tomm22, er det ikke mulig å studere celletypespesifikke mitokondrielle proteiner i komplekse vev. (3) Tiden som er nødvendig for å generere rene mitokondrier (ca. 2,5 timer) er uforenlig med en studie av forbigående hendelser, for eksempel endringer i metabolske profiler. I dette tilfellet anbefaler vi direkte tag-basert immunfangst9, som også gjør det mulig å studere celletypespesifikke mitokondrier in vivo20. (4) Selv om studier på isolerte mitokondrier oppnådd ved bruk av Tomm22-antistoffmerkede perler alene har vist aktivitet i funksjonelle analyser11, gjenstår det å avgjøre om mitokondrier generert med protokollen vår er kompatible med nedstrøms aktivitetsbaserte analyser. MitoTracker eller tetrametylrhodamin metylester perklorat (TMRM) farging, eller respirometrimålinger, er potensielle tilnærminger for å kvantifisere funksjonaliteten til isolerte mitokondrier22. (5) Etter å ha eluert den "mito-rene" prøven fra kolonnen, vil noen Tomm22-perler være til stede i den rene mitokondriefraksjonen (Figur 2B). Selv om vi ikke har observert noen interferens med trypsinfordøyelse og proteinmassespektrometri, bør tilstedeværelsen av disse kulene og immunglobulinene tas i betraktning i andre nedstrøms applikasjoner. Tomm22-antistoffet er et monoklonalt antistoff produsert hos mus23, og derfor er det viktig å huske på at når du bruker sekundære antistoffer mot mus i immunoblotting, vil det generere uspesifikke bånd ved størrelsen på immunoglobulinkjedene. (6) Fullstendig homogenisering av cellesuspensjonen er nøkkelen til vellykket isolering av mitokondrier. Her bruker vi en sprøyte med 25 G kanyle til å lyse både RAW264.7-celler og BMDM-er. Imidlertid, avhengig av celletype og dens størrelse, kan andre mekaniske homogeniseringsmetoder, for eksempel bruk av en Dounce-homogenisator, eller mer kontrollerte tilnærminger som cellehomogeniseringsanordninger, være mer egnet. Ikke-mekaniske homogeniseringsmetoder, som mild lydbehandling, kan også vurderes. Vevshomogeniseringstilnærminger er videre diskutert i andre studier24,25. (7) Selv om validering ved immunoblotting er den enkleste og billigere metoden, kan resultatene ikke alltid korrelere med endringer på hele organellnivået. Derfor anbefaler vi å bruke proteomikk for å fullt ut validere anrikning eller uttømming av henholdsvis mitokondrier og andre organeller.
To-trinns mitokondrierensingsprotokollen beskrevet her har gitt oss mulighet til å generere sekvensielle prøver med økende mitokondriell renhet, og dette har gjort det mulig for oss å oppdage nye mitokondrielle proteinkandidater gjennom subtraktiv proteomikk12. For vår analyse bruker vi strenge terskler for å selektere for signifikant anrikede mitokondrieproteiner, og selv om dette kanskje ikke identifiserer noen kjente mitokondrielle proteiner (figur 3A), reduseres den falske positive raten for ny mitokondriell proteinoppdagelse. Likevel er det viktig å understreke at eventuelle kandidatproteiner avslørt av protokollen vår må valideres gjennom ortogonale tilnærminger. Vi anbefaler karboksyterminal GFP-merking eller bruk av antistoffer mot det endogene proteinet for å validere assosiasjon til mitokondrier enten mikroskopisk eller ved proteasebeskyttelsestester.
Den direkte anvendelsen av vår metode i tilfelle av umodifiserte celler og vev gir et kraftig verktøy for å undersøke hvordan mitokondrier endres og tilpasser seg deres miljø i sunne og sykdomsforhold. Anvendelse av vår protokoll til cellelinjer, dyresykdomsmodeller, humane væsker og til og med biopsier fra kirurgi kan vise seg å være spesielt nyttig for å forbedre vår forståelse av mitokondrier og deres tilknyttede lidelser.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Manfredo Quadroni, Protein Analysis Facility, og Electron Microscopy Facility ved Universitetet i Lausanne for deres hjelp. Vi takker også H.G. Sprenger, K. Maundrell og medlemmer av Jourdain-laboratoriet for råd og tilbakemelding på manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av stiftelsen Pierre-Mercier pour la Science, og Swiss National Science Foundation (prosjektstipend 310030_200796).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD Plastipal | 309628 | |
| 25 G Needle | BD Microlance | 300400 | |
| 40 µm cell strainer | Corning | 352340 | |
| Anti-TOM22 Microbeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-127-693 | |
| Cell scraper | FisherScientific | 11577692 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | ThermoFisher | 31966 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | FisherScientific | BP-120-1 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270 | |
| HEPES | BioConcept | 5-31F00-H | |
| LS columns and plungers | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Macrophage colony-stimulating factor | Immunotools | 12343115 | |
| Mannitol | Sigma | M4125 | |
| Sodium chloride | Sigma | 71380 | |
| Sucrose | Sigma | S1888 | |
| Penicillin/Streptomycin | BioConcept | 4-01F00-H | |
| Petri dishes | Corning | BH93B-102 | |
| Phosphate-buffered saline 10X | Eurobio Scientific | CS3PBS01-01 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Vi-CELL BLU Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter | C19196 |
References
- Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
- West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S.
- Chakrabarty, R. P., Chandel, N. S. Mitochondria as signaling organelles control mammalian stem cell fate. Cell Stem Cell. 28 (3), 394-408 (2021).
- Morgenstern, M., et al. Quantitative high-confidence human mitochondrial proteome and its dynamics in cellular context. Cell Metabolism. 33 (12), 2464-2483 (2021).
- Rath, S., et al. MitoCarta3.0: an updated mitochondrial proteome now with sub-organelle localization and pathway annotations. Nucleic Acids Research. 49, D1541-D1547 (2021).
- Pagliarini, D. J., et al. A mitochondrial protein compendium elucidates complex I disease biology. Cell. 134 (1), 112-123 (2008).
- Diaz-Vegas, A., et al. Is mitochondrial dysfunction a common root of noncommunicable chronic diseases. Endocrine Reviews. 41 (3), 005 (2020).
- Bury, A. G., Vincent, A. E., Turnbull, D. M., Actis, P., Hudson, G. Mitochondrial isolation: when size matters. Wellcome Open Research. 5, 226 (2020).
- Chen, W. W., Freinkman, E., Sabatini, D. M. Rapid immunopurification of mitochondria for metabolite profiling and absolute quantification of matrix metabolites. Nature Protocols. 12 (10), 2215-2231 (2017).
- Daniele, J. R., Heydari, K., Arriaga, E. A., Dillin, A. Identification and characterization of mitochondrial subtypes in Caenorhabditis elegans via analysis of individual mitochondria by flow cytometry. Analytical Chemistry. 88 (12), 6309-6316 (2016).
- Franko, A., et al. Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads. PLoS One. 8 (12), e82392 (2013).
- Yates, J. R., Gilchrist, A., Howell, K. E., Bergeron, J. J. M. Proteomics of organelles and large cellular structures. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (9), 702-714 (2005).
- Trouplin, V., et al.
- Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages. Journal of Visualized Experiments. (76), e50323 (2013).
- Toda, G., Yamauchi, T., Kadowaki, T., Ueki, K. Preparation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice for functional analysis. STAR Protocols. 2 (1), 100246 (2020).
- Gene Ontology Consortium. The Gene Ontology resource: enriching a GOld mine. Nucleic Acids Research. 49, D325-D334 (2021).
- Ashburner, M., et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nature Genetics. 25 (1), 25-29 (2000).
- Hartwig, S., et al. A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation. Proteomics. 9 (11), 3209-3214 (2009).
- Delamarre, L., Pack, M., Chang, H., Mellman, I., Trombetta, E. S. Differential lysosomal proteolysis in antigen-presenting cells determines antigen fate. Science. 307 (5715), 1630-1634 (2005).
- Bayraktar, E. C., et al. MITO-Tag mice enable rapid isolation and multimodal profiling of mitochondria from specific cell types in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (1), 303-312 (2019).
- Nusinow, D. P., et al. Quantitative proteomics of the cancer cell line encyclopedia. Cell. 180 (2), 387-402 (2020).
- Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
- Hornig-Do, H. T., et al. Isolation of functional pure mitochondria by superparamagnetic microbeads. Analytical Biochemistry. 389 (1), 1-5 (2009).
- Liao, P. C., Bergamini, C., Fato, R., Pon, L. A., Pallotti, F. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Methods in Cell Biology. 155, 3-31 (2020).
- Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods in Enzymology. 457, 349-372 (2009).
