Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

طريقة التربية اليدوية لصغار المرموسيت

Published: June 9, 2023 doi: 10.3791/65296
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1,2, 1,2, 1, 1,3, 1,4, 1,2,4, 1,2,4
1Department of Neurology of the Second Affiliated Hospital and Interdisciplinary Institute of Neuroscience and Technology, School of Medicine, Zhejiang University, 2Key Laboratory of Biomedical Engineering of Ministry of Education, College of Biomedical Engineering and Instrument Science, Zhejiang University, 3Rehabilitation Medicine Center, Rehabilitation & Sports Medicine Research Institute of Zhejiang Province, Department of Rehabilitation Medicine, Zhejiang Provincial People’s Hospital, Affiliated People’s Hospital, Hangzhou Medical College, 4NHC and CAMS Key Laboratory of Medical Neurobiology, MOE Frontier Science Center for Brain Science and Brain-Machine Integration, School of Brain Science and Brain Medicine, Zhejiang University

Summary

هنا ، نصف طريقة تربية يدوية لتربية المرموسيت في حاضنة. تزيد هذه الطريقة بشكل كبير من معدل بقاء الرضع المرموسيت ، مما يوفر الفرصة لدراسة تطور أطفال المرموسيت ذوي الخلفيات الوراثية المماثلة التي نشأت في بيئات مختلفة بعد الولادة.

Abstract

المرموسيت الشائع (Callithrix jacchus) هو صغير واجتماعي للغاية من العالم الجديد مع معدلات تكاثر عالية ، والذي ثبت أنه نموذج رئيسي غير بشري مقنع لأبحاث الطب الحيوي وعلم الأعصاب. بعض الإناث تلد ثلاثة توائم. ومع ذلك ، لا يمكن للوالدين تربيتهم جميعا. لإنقاذ هؤلاء الأطفال ، قمنا بتطوير طريقة تربية يدوية لتربية المرموسيت حديثي الولادة. في هذا البروتوكول ، نصف صيغة الطعام ، ووقت التغذية ، وتكوين درجة الحرارة والرطوبة ، وكذلك تكيف الرضع الذين يتم تربيتهم يدويا مع بيئة المستعمرة. تزيد طريقة التربية اليدوية هذه بشكل كبير من معدل بقاء أطفال المرموسيت (بدون تربية يدوية: 45٪ ؛ مع التربية اليدوية: 86٪) وتوفر الفرصة لدراسة نمو أطفال المرموسيت ذوي الخلفيات الوراثية المماثلة التي نشأت في بيئات مختلفة بعد الولادة. نظرا لأن الطريقة عملية وسهلة الاستخدام ، فإننا نتوقع أنه يمكن تطبيقها أيضا على المختبرات الأخرى التي تعمل مع marmosets الشائعة.

Introduction

المرموسيت الشائع (Callithrix jacchus) هو صغير وشجري من العالم الجديد نشأ من أمريكا الجنوبية والوسطى. نما استخدام المرموسيت في البحوث الطبية الحيوية بسرعة على مدى العقود الماضية بسبب العديد من المزايا الرئيسية للمارموسيت مقارنة بالرئيسيات الأخرى غير البشرية (NHPs) ، بما في ذلك حجم جسمها الأصغر ، وسهولة التعامل معها وتربيتها في الأسر ، ووقت الحمل الأقصر ، والنضج الجنسي المبكر ، وانخفاض مخاطر الحيوانية المنشأ1،2،3،4،5،6. يحتوي المرموسيت الشائع على بنية دماغية ووظيفة دماغية مماثلة للبشر ويعرض ذخيرة غنية من الأصوات والسلوك الاجتماعي للغاية مع مشاعر غنية. إنه نموذج NHP مقنع لأنواع مختلفة من دراسات علم الأعصاب ، مثل الدراسات حول المعالجة الحسية7،8،9،10،11،12،13،14 ، التواصل الصوتي 15،16،17،18،19 ، نماذج إصابة الحبل الشوكي 20، 21،22،23 ، مرض باركنسون24،25،26،27،28 ، والأمراض المرتبطة بالعمر 29. بالمقارنة مع NHPs الأخرى ، فإن marmoset المشترك لديه معدل تكاثر مرتفع نسبيا ، وهو أمر يحتمل أن يكون مفيدا للتعديل الوراثي30،31،32. يستخدم هذا الرئيسيات أيضا على نطاق واسع في علم الأدوية وتصوير الأوعية والدراسات الممرضة والمناعة33،34،35،36،37،38،39. ومع ذلك ، لا يزال المعروض من marmosets محدودا للغاية ، خاصة في الصين ، ولا يمكنه تلبية الاحتياجات المتزايدة بسرعة للبحث العلمي.

في مستعمرات المرموسيت ، يتم تغذية البالغة مرة أو مرتين في اليوم ، ويغير عدد قليل من المؤسسات النظام الغذائي للصغار40. بشكل عام ، عادة ما تمسك المرموسيت الرضيعة بقوة بجسم الأب أو الأشقاء الأكبر سنا للرعاية اليومية ويتم تسليمها إلى الأم عدة مرات يوميا للحليب. تلد بعض إناث المرموسيت ثلاثة توائم ، وفي هذه الحالة ، لا يستطيع طفل أو طفلان البقاء على قيد الحياة بسبب نقص الحليب ؛ علاوة على ذلك ، لا يعتني بعض الآباء بأطفالهم لأنهم يفتقرون إلى الخبرة في التمريض أو لأسباب أخرى غير معروفة. هذه خسارة كبيرة للعديد من المختبرات. أبلغت بعض الدراسات عن طرق إدارة التغذية لحيوانات المرموسيت البالغة في البيئاتالأسيرة 40،41،42 باستخدام الأطعمة والصيغ ذات تركيبات المغذيات الكبيرة المختلفة والفيتامينات والمعادن ، بالإضافة إلى بروتوكولات التغذية المختلفة للتخصيب (المهروسة أو الهلامية أو المنقاة أو المعلبة)2,41. أفادت إحدى الدراسات السابقة عن طريقة تربية تعاونية لثلاثة توائم من المرموسيت43 ، حيث يأخذ مقدمو الرعاية رضيعا واحدا يوميا ، ويطعمونه يدويا طوال اليوم ، ويتبادلونه بآخر من التوائم الثلاثة في اليوم التالي. على الرغم من أن هذه الطريقة تسمح للرضع بالحصول على رعاية الوالدين ، إلا أنها تتطلب مقدم رعاية متمرسا لأخذ الرضيع من جسم الوالدين كل يوم وهي كثيفة العمالة. حتى الآن ، لم تبلغ أي دراسة عن طريقة مفصلة لتربية اليدين خطوة بخطوة لمارموسيت حديثي الولادة.

الهدف من الدراسة الحالية هو توفير طريقة تربية يدوية للمهتمين بتنمية المرموسيت ولكن بموارد محدودة. على عكس طريقة التربية التعاونية السابقة43 ، فإن الطريقة الحالية هي بديل يسبب إزعاجا أقل لعائلة الرضيع ويسهل تعلمه. استنادا إلى القواعد الأساسية للرضاعة الطبيعية و 5 سنوات من الممارسة ، تصف هذه الورقة طريقة تربية يدوية لتربية المرموسيت التي تشمل إعداد الطعام ، وجدول زمني للتغذية ، وتكوين درجة حرارة ورطوبة حاضنة ، وكذلك تكيف الرضيعة مع بيئة المستعمرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل لجنة استخدام ورعاية بجامعة تشجيانغ واتبعت إرشادات المعاهد الوطنية للصحة (NIH).

1. السكن وتربيةالماشية 44

  1. اضبط غرفة المستعمرة على دورة نهارية / ليلية مدتها 12 ساعة: 12 ساعة ، ودرجة الحرارة عند 26-28 درجة مئوية ، والرطوبة النسبية عند 45٪ -55٪.
  2. قم بإقران المرموسيت من الذكور والإناث في عمر 2-6 سنوات ، واحتفظ بها في أقفاص (850 مم × 800 مم × 800 مم) مع مساحة كافية وهواء نقي مع نظام تهوية 24 ساعة.
  3. توفير ألواح الراحة والأراجيح والعلياء والأراجيح في الأقفاص.
  4. إطعام زوج من marmosets بالماء العذب و 30-40 غرام من الطعام مرتين في اليوم ، بما في ذلك الحبوب والبيض والبطاطا الحلوة والعسل والفواكه والخضروات وديدان الوجبة.
    ملاحظة: يجب على الأطباء البيطريين والمجربين فحص منشأة الحيوانات مرة واحدة على الأقل يوميا لضمان تشخيص أي أفراد مرضى وعلاجهم على الفور.

2. التحضير قبل ولادة الرضع marmoset

  1. رعاية المرموسيت الحوامل
    ملاحظة: تم تشخيص وقت الحمل عن طريق الجس (عادة بعد 10-20 يوما من بدء الفترة الجنينية) ، وأشرنا أيضا إلى التاريخ التناسلي للحيوانات.
    1. توفير مساحة أكبر والحد الأدنى من الاضطراب البشري لأزواج التكاثر.
    2. قم بإطعام أزواج التكاثر بأطعمة إضافية مثل ديدان الوجبة والبيض والزبادي والفواكه المجففة لضمان تغذية الإناث.
    3. اعتني بالمرموسيت الحامل وافحصها بشكل متكرر للتحضير للولادة.
      ملاحظة: تقدر فترة الحمل من marmoset ليكون 148 يوما ± 4.3 أيام45.
  2. قم بإعداد العناصر التالية: حاضنة (855 مم [عرض] × 470 مم [طول] × 440 مم [ارتفاع]) ، وسادات حفاضات يمكن التخلص منها (أحجام M / L) ، ومناديل مبللة للأطفال ، وألعاب فخمة (الشكل 1 أ) ، وبكرات ألعاب (الشكل 1 ب) ، وإطارات تسلق (الشكل 1 ب) ، وبطانيات (10 سم × 10 سم ، الشكل 1 ج) ، ومقياس إلكتروني (دقة 0.2 جم ، الشكل 1 و).
    ملاحظة: لتجنب تعليق الحيوانات ، يجب ألا تحتوي الألعاب القطيفة على هياكل حلقية.
  3. إعداد أجهزة الطعام والتغذية
    1. تحضير العناصر التالية: حليب الأطفال (مناسب لعمر 0-12 شهرا) ، معجون أرز للأطفال (مناسب لعمر 0-6 أشهر) ، غلاية مياه كهربائية ، دورق (100 مل) ، وسادة تدفئة ، طبق وزن بلاستيكي (80 مم × 80 مم × 22 مم ، الشكل 1 د) ، أنابيب طرد مركزي معقمة (50 مل) ، محاقن معقمة يمكن التخلص منها ( 1-5 مل) ، عن طريق الحقن في الوريد (لحلمات التغذية حسب الطلب) (الشكل 1E) ، ومسحات (80-100 سم).
      ملاحظة: لعمل حلمة للتغذية ، يتم إجراء قطع 1 سم من نهاية حاقن في الوريد متصل بحقنة (الشكل 1E).
  4. إعداد نموذج التسجيل
    1. قم بإعداد نموذج ، عادة ما يكون طوله عدة صفحات ، لكل مارموسيت رضيع لتسجيل المعلومات الأساسية مثل الاسم وتاريخ الميلاد ووزن الولادة والوالدين والمعلومات الأساسية الأخرى ذات الأهمية مثل محيط الرأس وطول الذيل ، ومعلومات التربية مثل تاريخ ووقت التكاثر ، وكمية (مل) من تناول الطعام ، وحالة التغوط (نعم / لا ، صلب / فضفاض) ، ودرجة حرارة الحاضنة والرطوبة.
      ملاحظة: عادة ، يتم قياس وزن الجسم وتسجيله مرتين في اليوم ، مرة قبل الوجبة الأولى ومرة قبل الوجبة الأخيرة.

Figure 1
الشكل 1: صور العناصر الموجودة في الحاضنة وأدوات التغذية وملحقاتها. (أ) الألعاب القطيفية؛ (ب) أسطوانة الألعاب وإطارات التسلق ؛ (ج) بطانية؛ (د) طبق وزن بلاستيكي ؛ (ه) حاقن وحقنة في الوريد مع حلمة تغذية مصنوعة خصيصا ؛ (و) الجدول الإلكتروني؛ (ز) مقدم الرعاية مع معدات الحماية الشخصية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. إجراء تربية اليد

  1. تنظيف وتعقيم الغرفة قبل تاريخ الاستحقاق.
    1. رش حمض هيبوكلوروس أو 75 ٪ من الكحول الإيثيلي على الأرض والطاولة ، واتركه لمدة 30 ثانية ، ثم امسح الطاولة ، وامسح الأرض.
  2. اضبط درجة حرارة الحاضنة على 35 درجة مئوية والرطوبة على 40٪. عادة ، لمحاكاة متطلبات درجة الحرارة الأساسية لحيوانات المرموسيت الرضع ، كما يوضح الجدول 1 ، قبل اليوم 14 بعد الولادة (P14) ، حافظ على درجة حرارة الحاضنة عند 35 درجة مئوية ، ومن P15 فصاعدا ، اخفض درجة الحرارة بمقدار 0.5 درجة مئوية كل 3 أيام. حافظ على الرطوبة عند 40٪ -45٪ داخل الحاضنة ، وهي قريبة من رطوبة المستعمرة وتحافظ على جفاف فراء الرضع.
  3. بلاط وسادة حفاضات يمكن التخلص منها لتغطية هيكل الحاضنة.
  4. لتقليل إجهاد الرضع ، ضع بضع بطانيات وألعاب أفخم في الحاضنة قبل إدخال مارموسيت الرضع ، والتي تميل إلى تقليد المرموسيت البالغ.
    ملاحظة: يتم وضع البطانيات والألعاب القطيفة في قفص المنزل من أزواج تربية لمدة 1 يوم قبل الاستخدام.
  5. ضع المرموسيت الرضيع في الحاضنة وضعه على الألعاب القطيفة بمجرد فصله عن والديهم في قفص المنزل.
    ملاحظة: لتجنب العزلة الاجتماعية ووفقا لرعاية ، بشكل عام ، يتم اختيار طفلين معا للتربية اليدوية.
    1. ارتد معدات الحماية الشخصية المعقمة (معدات الوقاية الشخصية ، الشكل 1 ز) قبل الرضاعة.
    2. قم بتسخين بضع بطانيات إلى 35 درجة مئوية.
    3. امسك بلطف المرموسيت الرضيع ببطانيات دافئة ، واحصل على وزن كوزن عند الولادة.
    4. نقل marmoset الرضع إلى الحاضنة مع البطانيات الدافئة.
    5. قم بتدوين السجلات ، كما هو مذكور في الخطوة 2.4.
  6. امزج مكونات الطعام وأطعم المرموسيت الرضيع.
    1. قم بإذابة 5 جم من حليب الأطفال في 30 مل من الماء المغلي 50 درجة مئوية في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل.
      ملاحظة: يحتاج الرضع في مختلف الأعمار بعد الولادة إلى وصفات غذائية مختلفة. يتضمن الجدول 2 الجرعات المختلفة من حليب الأطفال ومعجون الأرز والماء في أعمار ما بعد الولادة من P1 إلى P60. الجرعة عادة ما تكون كافية لمدة 1 يوم. امزج المكونات قبل الوجبة الأولى ، وقم بتخزين بقية الطعام في ثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية. سخني الطعام إلى 30-35 درجة مئوية لكل وجبة.
    2. خذ 1 مل من الطعام مع حقنة 1 مل ، وقم بتغطية المحقنة بحلمة تغذية مصنوعة خصيصا.
      ملاحظة: حدد حقنة بالحجم المناسب ، مع الإشارة إلى الجدول 2.
    3. حافظ على درجة حرارة الطعام عند 30-35 درجة مئوية باستخدام وسادة التدفئة.
    4. قم بتدفئة اليدين قبل الرضاعة ، وأمسك برفق المرموسيت الرضيع ببطانية دافئة بيد واحدة في الحاضنة.
    5. ضع حلمة الرضاعة في فم المرموسيت الرضيع بينما يتم إمساك رأس المرموسيت الرضيع برفق بالإبهام والسبابة لليد القابضة لمقدم الرعاية ، وادفع الطعام ببطء خارج المحقنة بسرعة ثابتة.
      ملاحظة: لا تدفع الطعام أبدا أسرع من ابتلاع المرموسيت الرضيع. يمكن أن يؤدي الدفع بسرعة إلى الاختناق ، حيث يخرج الطعام من الأنف عبر الحلق. هذا يمكن أن يسبب أمراض مثل الالتهاب الرئوي ، والتي يمكن أن تؤدي إلى الموت. إذا فاض الطعام ، فإن المرموسيت الرضيع سيكافح. عندما يحدث هذا ، توقف عن التغذية وامسح الطعام عن وجه بعناية. استمر في التغذية بعد أن يبدأ المرموسيت في التصرف بشكل طبيعي.
  7. بعد أن يستهلك المرموسيت الرضيع كمية مناسبة من الطعام ، امسح فتحة الشرج بمسحة بالماء الدافئ ، والتي تنظف فتحة الشرج وتعزز التغوط.
  8. مراقبة لبضع دقائق ، والتحقق من الحركة والتغوط من.
  9. سجل وقت التغذية ، وكمية (مل) من تناول الطعام ، وحالة التغوط (نعم / لا ، صلبة / فضفاضة) ، ودرجة حرارة الحاضنة ورطوبتها.
    ملاحظة: لف المرموسيت الرضيع ببطانيات دافئة أثناء الوزن لتجنب إصابة الرضيع بالبرد أو الإصابة.
  10. حافظ على نظافة هيكل الحاضنة عن طريق التقاط البراز الصلب أو التغيير إلى وسادة حفاضات جديدة يمكن التخلص منها.
  11. قبل P50 ، قم بإطعام المرموسيت الرضيع باتباع الخطوات 3.3-3.7 ، واستخدم جرعة المكونات الغذائية ووقت التغذية والتردد الموضح في الجدول 2.
  12. من P50 فصاعدا ، عادة ما يكون المرموسيت الرضيع جاهزا للأكل الطوعي.
    1. استخدم أطباق الوزن البلاستيكية بدلا من المحاقن. تحضير الطعام عن طريق خلط مكونات الطعام مباشرة في الطبق. يرجى الرجوع إلى الجدول 2 لمعرفة المبالغ.
    2. ضع طبق الطعام في الحاضنة ، وقم بإصلاح الجزء السفلي في حالة قلبه. راقب لبضع دقائق للتأكد من أن المارموسيت الرضيع يأكل الطعام. في المرات القليلة الأولى ، قم بتوجيه لتناول الطعام طواعية عن طريق جذب إلى طبق الطعام وتوجيه فمه للمس الطعام عدة مرات.
      ملاحظة: لا تدع أنف الحيوان يلمس الطعام. عادة ، يتعلم أن يأكل طواعية في 1 يوم.

4. التأقلم قبل عودة المرموسيت الرضيع إلى المستعمرة

ملاحظة: عادة ، يتم الانتهاء من تربية اليد عندما يتعلم المارموسيت الرضيع تناول الطعام بأنفسهم. هناك عدد قليل من إجراءات التكيف التي يتعين تنفيذها قبل إعادتها إلى قفص المنزل في مستعمرة marmoset.

  1. انقل المرموسيت الرضيعة من حاضنة إلى أقفاص صغيرة (45 سم × 45 سم × 40 سم) ، والتي تشبه قفص الطيور. زجاجة ماء (50 مل) على كل قفص صغير.
  2. نقل الأقفاص الصغيرة مع marmosets الرضع إلى المستعمرة ، ووضعها بالقرب من قفص الأسرة.
  3. إطعام marmosets الرضع بشكل منفصل مع طبق وزنها البلاستيك لمدة 1 أسبوع ، وخلط الطعام وفقا للوصفات اليومية المعدة للمستعمرة بأكملها.
  4. قم بعمل سجل لوزن الجسم وحالة التغوط مرة واحدة في اليوم.

5. عودة المرموسيت الرضع إلى قفص الأسرة

ملاحظة: بعد العيش في القفص الصغير لمدة 7-10 أيام ، عادة ما تتكيف المرموسيت الرضع مع بيئة المستعمرة جيدا ولا تظهر المزيد من القلق.

  1. ضع المرموسيت الرضيع مرة أخرى في قفص الأسرة في الصباح.
  2. راقب لمدة 15 دقيقة على الأقل للتأكد من عدم وجود عض أو قتال أو مطاردة بين أفراد الأسرة والوافدين الجدد.
    ملاحظة: في حالة حدوث عض أو قتال أو مطاردة ، افصل الرضيع عن الآخرين في أسرع وقت ممكن ؛ ومحاولة إعادة الرضيع إلى عائلته مرة أخرى في يوم آخر. إذا حدث الفشل مرة أخرى ، فحدد عائلة أخرى لرعايته. المجموعات العائلية التي لديها تجربة الأبوة والأمومة الغنية هي الخيار الأول للتبني. ضع لعبة أفخم في قفص جديد لمرافقة الرضيع إذا لم تقبلها أي عائلة.
  3. توقف عن إطعام المرموسيت الرضع بشكل منفصل ، وابدأ في إطعامهم باستخدام النظام الغذائي للمستعمرة.
  4. إيلاء اهتمام وثيق لنشاط marmosets الرضع لمدة 1 أسبوع بعد عودتهم إلى قفص الأسرة.
  5. قياس أوزان الجسم من marmosets الرضع كل 2 أيام ، وجعل سجل. إذا فقدوا الوزن ، أطعمهم طعاما غذائيا إضافيا عن طريق حقنة في قفص الأسرة.
  6. توفير الرعاية اليومية للمارموسيت الرضع ، كما هو الحال بالنسبة للمارموسيت في المستعمرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وزن الجسم هو مؤشر رئيسي لنمو جسم ويستخدم كمؤشر للحالة الصحية للمارموسيت في هذا البروتوكول. في هذا العمل ، زادت أوزان أجسام التي يتم تربيتها يدويا تدريجيا مع تقدم العمر (الشكل 2 أ ، ن = 16) ، على غرار أوزان الأطفال حديثي الولادة في دراسة سابقة46. لتقليل الاضطراب الذي تتعرض له العائلات المتكاثرة في المستعمرة ، لم نزن المرموسيت الرضيعة في المستعمرة كل يوم. حصلنا على أوزان التي قام الوالدان بتربيتها بعد 1 شهر من الولادة وما بعدها ، وتمت مقارنتها بأوزان الرضع الذين تم تربيتهم يدويا في نفس الأعمار. لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في أوزان الجسم بين الرضع الذين قام الوالدان بتربيتهم والرضع الذين تم تربيتهم يدويا (P30 ، مجموعة التربية اليدوية ، 52.25 جم ± 2.10 جم ، ن = 18 ؛ مجموعة المستعمرات ، 57.34 جم ± 2.77 جم ، ن = 7 ؛ ر = −1.3417 ، ف = 0.1928 ؛ P60 ، مجموعة التربية اليدوية ، 91.76 جم ± 3.44 جم ، مجموعة المستعمرات ، 93.06 جم ± 4.68 جم ؛ ر = -0.2019 ، ف = 0.8424 ؛ اختبار t للطالب) (الشكل 2 ب).

Figure 2
الشكل 2: أوزان جسم المارموسيت الرضيع الذي يتم تربيته يدويا والأوزان التي يربيها الوالدان في المستعمرة. أ: وزن جسم كل رضيع يتم تربيته يدويا. تشير الخطوط الرمادية إلى أوزان الجسم الفردية ، ويشير المنحنى البرتقالي إلى متوسط السكان. (ب) مقارنة أوزان الجسم بين الرضع الذين يتم تربيتهم يدويا (برتقالي) والرضع الذين يربيهم الوالدان (أخضر) في P30 و P60. تمثل الدوائر الرمادية الأفراد. البيانات المعروضة كمتوسط ± SEM. تشير ns إلى عدم وجود فرق كبير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1. تكوين درجة الحرارة في حاضنة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: وصفات التغذية. تشير الأعمدة الموجودة أسفل "المكونات الغذائية" إلى وصفة الحليب لمدة 1 يوم. على سبيل المثال ، في أيام ما بعد الولادة 1-14 ، نخلط 5 غرام من مسحوق حليب الأطفال و 30 مل من الماء قبل الوجبة الأولى ونأخذ 0.5-1.5 مل من هذا الحليب في كل مرة للتغذية. جرعات "مسحوق حليب الأطفال" و "معجون الأرز" هي لأشكال مسحوق. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

المارموسيت الشائع هو نموذج NHP مفيد للغاية لأبحاث الطب الحيوي وعلم الأعصاب. ومع ذلك ، فإن موارد المرموسيت محدودة للغاية لتلبية الاحتياجات المتزايدة بسرعة. في هذا العمل ، قمنا بتطوير طريقة تربية يدوية لا تزيد من معدل بقاء أطفال المرموسيت فحسب ، بل توفر أيضا فرصة لدراسة تطورهم بعد الولادة. طريقة التربية اليدوية هذه عملية وسهلة التعلم ، وبالتالي فهي قابلة للتطبيق بسهولة على المختبرات الأخرى التي تعمل مع المرموسيت الشائع.

بعض العيوب الخلقية عادة ما تتطور في الأسابيع 2 الأولى من الحياة. حتى الآن ، حددنا العديد من حالات المرموسيت حديثي الولادة مع عيوب فطرية في الجفن والرئة والأمعاء والدماغ ، ونادرا ما يبقون على قيد الحياة حتى P14. لذلك ، تعد P1-14 فترة حرجة لفحص المرموس الصحية لحديثي الولادة التي يمكن تربيتها بطريقة التربية اليدوية. بالإضافة إلى ذلك ، إذا تم إسقاط المرموسيت الرضع من جسم والديهم بسبب الإهمال أو نقص الحليب ، فلن يتمكنوا من البقاء على قيد الحياة. وبالتالي ، فإن طريقة التربية اليدوية تساعد على إنقاذ حياتهم. في هذا العمل ، بدون تربية يدوية ، كان معدل البقاء على قيد الحياة 45٪ (ن = 13/29) ، وارتفع إلى 86٪ (ن = 25/29) بعد أن طبقنا طريقة التربية اليدوية.

هناك العديد من النقاط الحرجة التي يجب ملاحظتها. يجب على مقدمي الرعاية التحلي بالصبر أثناء الرضاعة ؛ إن دفع المحقنة بسرعة كبيرة ليس جيدا ، لأنه لا يسمح لطيور المرموسيت الرضيع بابتلاع ، مما قد يؤدي إلى الاختناق أو العلوص ، وبالتالي يضعف الجهاز التنفسي أو الجهاز الهضمي للحيوانات. يجب أن يكون مقدمو الرعاية لطيفين وهادئين أثناء الرضاعة لتقليل الضغط على الرضيعة ، لأن الإجهاد يمكن أن يؤثر بشكل كبير على ميكروبيوم الأمعاء ويرتبط بالإسهال المزمن في marmosets47,48. أثناء التربية اليدوية ، يجب على جميع الأشخاص بالقرب من المرموسيت الرضع التصرف بلطف طوال الوقت. في بعض الأحيان ، يؤدي فتح باب الحاضنة على عجل إلى إصدار أصوات عالية مفاجئة ، والتي يمكن أن تخيف الرضع وتؤدي إلى رد فعل الإجهاد.

يجب مراقبة أوزان جسم كل يوم ، لأن وزن الجسم هو مؤشر رئيسي للحالة الصحية للحيوان. يمكن اكتشاف نقص التغذية أو الإفراط في التغذية أو سوء التغذية أو عسر الهضم بسرعة عن طريق تغيير في وزن الجسم. تم الإبلاغ سابقا عن أن المرموس ذات الأوزان المنخفضة في الجسم أكثر عرضة لأمراض العظام والجهاز الهضمي المتزامنة49. بشكل عام ، ظلت أوزان جسم المرموسيت الرضع ثابتة في المرحلة P1-5 وزادت تدريجيا بمقدار 1-4 جم يوميا عند استخدام طريقة التربية اليدوية. من P5 فصاعدا ، إذا لم يلاحظ أي زيادة أو فقدان تدريجي لوزن الجسم على مدى 2 أيام ، يجب أن يكون مقدمو الرعاية في حالة تأهب والتحقق من المكونات الغذائية ، وكذلك درجة حرارة الجسم وحالة إفراز. من المفيد إضافة البروبيوتيك في هذه الحالة.

ليس من الضروري إطعام بين عشية وضحاها. حاولنا إطعام المرموسيت الرضيع كل 2 ساعة إلى 4 ساعات على مدار الساعة ووجدنا أنه لا يعزز نمو المرموسيت الرضيع (البيانات غير معروضة). يمكن أن يؤدي الافتقار إلى ممارسة الرياضة البدنية الكافية أو الإفراط في التغذية إلى حدوث متلازمات التمثيل الغذائي ، مثل السمنة ، التي تم ربطها بدسليبيدميا ، وتغيير استقلاب الجلوكوز ، ومقاومة الأنسولين في marmosets50،51،52. يجب أن يبقى الرضع دافئين أثناء الرضاعة والوزن ، خاصة في الأيام القليلة الأولى بعد الولادة. وجدنا أن أحد الرضع أصيب بالإسهال بعد أن أصيب بنزلة برد. الإسهال يضعف بسرعة حيوية ويقلل من وزن الجسم.

قوة القبضة ودرجة حرارة الجسم هي المؤشرات الرئيسية للحالة الصحية للرضع ، ويجب مراقبتها بعناية. عندما يتم إطعام المرموسيت الرضيع ، فإنه يمسك البطانية أو إصبع المغذي. عادة ما تضعف قوة القبضة عندما يصاب بالإسهال. بمجرد حدوث ذلك ، يجب على المرء إضافة البروبيوتيك بحجم حبة البازلاء إلى الطعام وإطعام الرضيع المصاب لمدة 3 أيام حتى يختفي الإسهال. إذا استمر الإسهال لأكثر من 3 أيام ، يجب إضافة مسحوق مونتموريلونيت بدلا من البروبيوتيك. في المقابل ، إذا كان الرضيع مصابا بالإمساك ، فيجب على المرء أن يمسح فتحة الشرج برفق بمسحة مغموسة في ماء دافئ لتعزيز التغوط ، ويجب استخدام اللاكتولوز إذا لزم الأمر. بالإضافة إلى ذلك ، عادة ما تكون درجة حرارة جسم المرموسيت الرضيع أعلى من درجة حرارة البشر. إذا كانت درجة حرارة أقل من المعتاد ، والتي غالبا ما ترتبط بقوة قبضة ضعيفة ، فيجب مراقبة سلوك عن كثب وتعديل التغذية وفقا لذلك.

عندما تبدأ المرموسيت الرضيعة في الصعود ، يجب تزويدها بإطارات التسلق وبكرات الألعاب في الحاضنة تحت إشراف المربي. يسمح للحيوانات بممارسة التسلق قبل وبعد كل وجبة من P25 فصاعدا. في P50 ، يمكن للرموسيت الرضيع التسلق والقفز بشكل جيد ، وهذا شرط أساسي للأكل الطوعي. يحب المرموسيت الرضع طحن أسنانهم عن طريق عض البطانيات أو الألعاب القطيفة أو وسادات الحفاضات التي تستخدم لمرة واحدة ، ولكن هذه قد تشكل حلقات صغيرة تهدد حياتهم بسبب الخنق الذاتي. وبالتالي ، يجب تنظيف القطع الممزقة والخيوط على الفور لتجنب الإصابات أو الوفيات.

في بعض الأحيان ، يمكن تعديل إجراء التغذية قليلا بسبب الاختلافات في الشهية والحيوية والظروف البيئية. إذا كان المارموسيت الرضيع قويا بدرجة كافية ، فمن المحتمل أن يبدأ في ممارسة التسلق قبل P25 ، وتعلم الأكل الطوعي قبل P50 ، وحتى العودة إلى العائلة قبل P60. وفي الوقت نفسه ، نقوم بخفض درجة الحرارة بمقدار 0.5 درجة مئوية في الحاضنة كل يوم أو كل يومين حتى يتمكن المرموسيت الرضيع من التكيف مع نفس درجة الحرارة الموجودة في المستعمرة قبل أن يعود في النهاية إلى القفص. إذا كان لدى المارموسيت الرضيع شهية ضعيفة لفترة معينة ، فيجب توفير كمية أقل من الطعام لكل وجبة ولكن بوتيرة أعلى يوميا ، ويجب أن تبقى الحاضنة أكثر دفئا من المستعمرة لفترة أطول. في الدراسة الحالية ، تم قبول 88.9٪ (ن = 16/18) من الأطفال بنجاح من قبل الوالدين ، وتم رعاية 11.1٪ (ن = 2/18) من قبل عائلات أخرى ، ولم يتم رفض أي منهم.

تكشف دراسة صغار المرموسيت ذوي الهياكل الأسرية المختلفة عن اختلافات في نموهم الاجتماعي والعقلي. في الواقع ، من المحتمل أن تؤدي التفاعلات الاجتماعية بين الآباء والأطفال وبين الأقران أثناء النمو إلى نحت وظيفة الدماغ الاجتماعية53،54،55. لذلك ، يعتمد اختيار أو حيوانين للتربية اليدوية على أهداف التجربة. عادة ما يقوم مختبرنا بتربية طفلين يدويا ، إن أمكن ، لتلبية متطلبات رعاية ومساعدة المزيد من الأطفال على البقاء على قيد الحياة. طريقة التربية التعاونية لثلاثة توائم مارموسيت43 هي أيضا اختيار جيد. قد لا تكون المرموسيت التي يتم تربيتها يدويا مع تفاعلات أبوية محدودة مناسبة لإجراء تجارب لدراسة السلوك الاجتماعي.

في الختام ، توفر طريقة التربية اليدوية في الدراسة الحالية تعليمات حول كيفية إطعام المرموسيت الرضع من P1 إلى P60. مع هذا البروتوكول ، يستغرق الأمر ~ 15 دقيقة لمربي متمرس لإطعام المرموسيت الرضيع يدويا. تعتمد العملية الناجحة على عوامل متعددة ، بما في ذلك درجة الحرارة المناسبة للطعام والبيئة ، ووقت التغذية وتقنيتها ، وإفراز بعد الوجبات. هذه الطريقة مجدية وسهلة التعلم. لقد تم تحسينه باستمرار مع 5 سنوات من الممارسة. يمكن تطبيق هذه الطريقة على المختبرات الأخرى التي تعمل مع marmosets المشتركة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

يود المؤلفون أن يشكروا Mingxuan Li على تحريره لقواعد وتلميع النسخة المبكرة من هذه المخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة تشجيانغ في الصين (LD22H090003) ؛ مؤسسة العلوم الطبيعية في الصين (32170991 و 32071097) ، STI2030 المشاريع الكبرى 2021ZD0204100 (2021ZD0204101) و 2022ZD0205000 (2022ZD0205003) ؛ ومركز العلوم الحدودية التابع لوزارة التربية والتعليم لعلوم الدماغ والتكامل بين الدماغ والآلة ، جامعة تشجيانغ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
animal incubator RCOM, Korea MX - BL600N, 855 mm (W) x 470 mm (L) x 440 mm (H)
baby milk powder Meadjohnson, America suitable for 0-12 months of age, executive standard - GB25596
baby rice paste HEINZ, China suitable for 0-6 months of age, executive standard - GB10769
baby wipes babycare, China soft
beaker ShuNiu, China 100 mL
blankets Grace, China 10 cm × 10 cm, soft
climbing frame WowWee, China firm and no small circular structures
disposable diaper pads Hi Health Pet, China either M or L size
disposable sterile syringe Cofoe, China 1 mL, 2.5 mL, 3 mL, 5 mL, 10 mL
electronic scale YouSheng, China measuring range from 0 to 6,000 g with precision of 0.2 g
intravenous injector HD, China 0.55 mm x 20 mm needle
kettle FGA, China warm-keeping kettle 1,500 mL
lactulose BELCOL, China to solve constipation
plastic weighing dish SKSLAB, China 80 mm x 80 mm x 22 mm, used as a bowl
plush toy Lebiyou, China soft
probiotic powder G-Pet, China to regulate gastrointestinal environment
sterile centrifuge tube NEST, China 50 mL
swab OYEAH, China 80 - 100 mm
toy roller WowWee, China firm and no small circular structures

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miller, C. T., et al. Marmosets: A neuroscientific model of human social behavior. Neuron. 90 (2), 219-233 (2016).
  2. Ross, C. N., Colman, R., Power, M., Tardif, S. Marmoset metabolism, nutrition, and obesity. ILAR Journal. 61 (2-3), 179-187 (2020).
  3. Kishi, N., Sato, K., Sasaki, E., Okano, H. Common marmoset as a new model animal for neuroscience research and genome editing technology. Development, Growth & Differentiation. 56 (1), 53-62 (2014).
  4. Prins, N. W., et al. Common marmoset (Callithrix jacchus) as a primate model for behavioral neuroscience studies. Journal of Neuroscience Methods. 284, 35-46 (2017).
  5. Tokuno, H., Watson, C., Roberts, A., Sasaki, E., Okano, H. Marmoset neuroscience. Neuroscience Research. 93, 1-2 (2015).
  6. Hodges, J. K., Henderson, C., Hearn, J. P. Relationship between ovarian and placental steroid production during early pregnancy in the marmoset monkey (Callithrix jacchus). Journal of Reproduction and Fertility. 69 (2), 613-621 (1983).
  7. Troilo, D., Judge, S. J. Ocular development and visual deprivation myopia in the common marmoset (Callithrix jacchus). Vision Research. 33 (10), 1311-1324 (1993).
  8. Mitchell, J. F., Leopold, D. A. The marmoset monkey as a model for visual neuroscience. Neuroscience Research. 93, 20-46 (2015).
  9. Hung, C. C., et al. Functional MRI of visual responses in the awake, behaving marmoset. NeuroImage. 120, 1-11 (2015).
  10. Gao, L., Kostlan, K., Wang, Y., Wang, X. Distinct subthreshold mechanisms underlying rate-coding principles in primate auditory cortex. Neuron. 91 (4), 905-919 (2016).
  11. Gao, L., Wang, X. Subthreshold activity underlying the diversity and selectivity of the primary auditory cortex studied by intracellular recordings in awake marmosets. Cerebral Cortex. 29 (3), 994-1005 (2019).
  12. Gao, L., Wang, X. Intracellular neuronal recording in awake nonhuman primates. Nature Protocols. 15, 3615-3631 (2020).
  13. Wang, X., et al. Corticofugal modulation of temporal and rate representations in the inferior colliculus of the awake marmoset. Cerebral Cortex. 32 (18), 4080-4097 (2022).
  14. Wang, X., et al. Selective corticofugal modulation on sound processing in auditory thalamus of awake marmosets. Cerebral Cortex. 33 (7), 3372-3386 (2022).
  15. Kajikawa, Y., et al. Coding of FM sweep trains and twitter calls in area CM of marmoset auditory cortex. Hearing Research. 239 (1-2), 107-125 (2008).
  16. Choi, D., Bruderer, A. G., Werker, J. F., et al. Sensorimotor influences on speech perception in pre-babbling infants: Replication and extension of Bruderer et al. Psychonomic Bulletin & Review. 26 (4), 1388-1399 (2019).
  17. Eliades, S. J., Miller, C. T. Marmoset vocal communication: Behavior and neurobiology. Developmental Neurobiology. 77 (3), 286-299 (2017).
  18. Roy, S., Zhao, L., Wang, X. Distinct neural activities in premotor cortex during natural vocal behaviors in a New World primate, the common marmoset (Callithrix jacchus). Journal of Neuroscience. 36 (48), 12168-12179 (2016).
  19. Simões, C. S., et al. Activation of frontal neocortical areas by vocal production in marmosets. Frontiers in Integrative Neuroscience. 4, 123 (2010).
  20. Iwanami, A., et al. Transplantation of human neural stem cells for spinal cord injury in primates. Journal of Neuroscience Research. 80 (2), 182-190 (2005).
  21. Schorscher-Petcu, A., Dupré, A., Tribollet, E. Distribution of vasopressin and oxytocin binding sites in the brain and upper spinal cord of the common marmoset. Neuroscience Letters. 461 (3), 217-222 (2009).
  22. Bowes, C., Burish, M., Cerkevich, C., Kaas, J. Patterns of cortical reorganization in the adult marmoset after a cervical spinal cord injury. Journal of Comparative Neurology. 521 (15), 3451-3463 (2013).
  23. Kondo, T., et al. Histological and electrophysiological analysis of the corticospinal pathway to forelimb motoneurons in common marmosets. Neuroscience Research. 98, 35-44 (2015).
  24. Nash, J. E., et al. Antiparkinsonian actions of ifenprodil in the MPTP-lesioned marmoset model of Parkinson's disease. Experimental Neurology. 165 (1), 136-142 (2000).
  25. van Vliet, S. A., et al. Neuroprotective effects of modafinil in a marmoset Parkinson model: Behavioral and neurochemical aspects. Behavioural Pharmacology. 17 (5-6), 453-462 (2006).
  26. van Vliet, S. A., Vanwersch, R. A., Jongsma, M. J., Olivier, B., Philippens, I. H. Therapeutic effects of Delta9-THC and modafinil in a marmoset Parkinson model. European Neuropsychopharmacology. 18 (5), 383-389 (2008).
  27. Philippens, I. H., t Hart, B. A., Torres, G. The MPTP marmoset model of parkinsonism: a multi-purpose non-human primate model for neurodegenerative diseases. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 985-990 (2010).
  28. Santana, M. B., et al. Spinal cord stimulation alleviates motor deficits in a primate model of Parkinson disease. Neuron. 84 (4), 716-722 (2014).
  29. Tardif, S. D., Mansfield, K. G., Ratnam, R., Ross, C. N., Ziegler, T. E. The marmoset as a model of aging and age-related diseases. ILAR Journal. 52 (1), 54-65 (2011).
  30. Sasaki, E., et al. Generation of transgenic non-human primates with germline transmission. Nature. 459, 523-527 (2009).
  31. Sasaki, E. Prospects for genetically modified non-human primate models, including the common marmoset. Neuroscience Research. 93, 110-115 (2015).
  32. Park, J. E., Sasaki, E. Assisted reproductive techniques and genetic manipulation in the common marmoset. ILAR Journal. 61 (2-3), 286-303 (2020).
  33. Smith, D., Trennery, P., Farningham, D., Klapwijk, J. The selection of marmoset monkeys (Callithrix jacchus) in pharmaceutical toxicology. Laboratory Animals. 35 (2), 117-130 (2001).
  34. Smith, T. E., Tomlinson, A. J., Mlotkiewicz, J. A., Abbott, D. H. Female marmoset monkeys (Callithrix jacchus) can be identified from the chemical composition of their scent marks. Chemical Senses. 26 (5), 449-458 (2001).
  35. Jagessar, S. A., et al. Induction of progressive demyelinating autoimmune encephalomyelitis in common marmoset monkeys using MOG34-56 peptide in incomplete freund adjuvant. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (4), 372-385 (2010).
  36. Kap, Y. S., Laman, J. D., 't Hart, B. A. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the common marmoset, a bridge between rodent EAE and multiple sclerosis for immunotherapy development. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 5 (2), 220-230 (2010).
  37. Carrion, R., Patterson, J. L. An animal model that reflects human disease: The common marmoset (Callithrix jacchus). Current Opinion in Virology. 2 (3), 357-362 (2012).
  38. Jagessar, S. A., et al. Overview of models, methods, and reagents developed for translational autoimmunity research in the common marmoset (Callithrix jacchus). Experimental Animals. 62 (3), 159-171 (2013).
  39. Feng, Z., et al. Biologically excretable aggregation-induced emission dots for visualizing through the marmosets intravitally: Horizons in future clinical nanomedicine. Advanced Materials. 33 (17), 2008123 (2021).
  40. Goodroe, A., et al. Current practices in nutrition management and disease incidence of common marmosets (Callithrix jacchus). Journal of Medical Primatology. 50 (3), 164-175 (2021).
  41. Power, M. L., Koutsos, L. Chapter 4 - Marmoset nutrition and dietary husbandry. The Common Marmoset in Captivity and Biomedical Research. Marini, R., Wachtman, L., Tardif, S., Mansfield, K., Fox, J. , Academic Press. Cambridge, MA. 63-76 (2019).
  42. Gore, M. A., et al. Callitrichid nutrition and food sensitivity. Journal of Medical Primatology. 30 (3), 179-184 (2001).
  43. Hearn, J. P., Burden, F. J. Collaborative' rearing of marmoset triplets. Laboratory Animals. 13 (2), 131-133 (1979).
  44. Cao, X., et al. Effect of a high estrogen level in early pregnancy on the development and behavior of marmoset offspring. ACS Omega. 7 (41), 36175-36183 (2022).
  45. Watakabe, A., et al. Application of viral vectors to the study of neural connectivities and neural circuits in the marmoset brain. Developmental Neurobiology. 77 (3), 354-372 (2017).
  46. Takahashi, D. Y., et al. The developmental dynamics of marmoset monkey vocal production. Science. 349 (6249), 734-738 (2015).
  47. Malukiewicz, J., et al. The gut microbiome of exudivorous marmosets in the wild and captivity. Scientific Reports. 12 (1), 5049 (2022).
  48. Shigeno, Y., et al. Comparison of gut microbiota composition between laboratory-bred marmosets (Callithrix jacchus) with chronic diarrhea and healthy animals using terminal restriction fragment length polymorphism analysis. Microbiology and Immunology. 62 (11), 702-710 (2018).
  49. Baxter, V. K., et al. Serum albumin and body weight as biomarkers for the antemortem identification of bone and gastrointestinal disease in the common marmoset. PLoS One. 8 (12), e82747 (2013).
  50. Tardif, S. D., et al. Characterization of obese phenotypes in a small nonhuman primate, the common marmoset (Callithrix jacchus). Obesity. 17 (8), 1499-1505 (2009).
  51. Wachtman, L. M., et al. Differential contribution of dietary fat and monosaccharide to metabolic syndrome in the common marmoset (Callithrix jacchus). Obesity. 19 (6), 1145-1156 (2011).
  52. Power, M. L., Ross, C. N., Schulkin, J., Ziegler, T. E., Tardif, S. D. Metabolic consequences of the early onset of obesity in common marmoset monkeys. Obesity. 21 (12), E592-E598 (2013).
  53. Shimizu, K., et al. Peer-social response in 4 juvenile marmosets represented the emotional development traits depending on family structure. Neuroscience Research. 65, S244 (2009).
  54. Schultz-Darken, N., Braun, K. M., Emborg, M. E. Neurobehavioral development of common marmoset monkeys. Developmental Psychobiology. 58 (2), 141-158 (2016).
  55. Gultekin, Y. B., Hage, S. R. Limiting parental feedback disrupts vocal development in marmoset monkeys. Nature Communications. 8, 14046 (2017).

Tags

طريقة التربية اليدوية ، مارموسيت الرضع ، المرموسيت الشائع ، نموذج الرئيسيات غير البشرية ، البحوث الطبية الحيوية ، أبحاث علم الأعصاب ، الرضع الذين يتم تربيتهم يدويا ، معدل البقاء على قيد الحياة ، تركيبة الطعام ، وقت التغذية ، تكوين درجة الحرارة ، تكوين الرطوبة ، تكيف بيئة المستعمرة ، الخلفيات الوراثية ، بيئات ما بعد الولادة
طريقة التربية اليدوية لصغار المرموسيت
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sun, H., Li, R., Lin, Y., Cao, X.,… More

Sun, H., Li, R., Lin, Y., Cao, X., Fan, L., Sun, G., Xie, M., Zhu, L., Yu, C., Cai, R., Lyu, C., Wang, X., Zhang, Y., Bai, S., Qi, R., Tang, B., Jia, G., Li, X., Gao, L. Hand-Rearing Method for Infant Marmosets. J. Vis. Exp. (196), e65296, doi:10.3791/65296 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter