骨格筋興奮性を研究するための天然細胞における機能部位特異的蛍光測定
Summary
機能部位特異的蛍光法は、タンパク質ドメインの動きをリアルタイムで研究する方法です。天然細胞への適用のためのこの技術の修正は、マウス単離された骨格筋線維における電位依存性Ca2+ チャネルからの単一の電圧センサ運動の検出および追跡を可能にするようになった。
Abstract
機能部位特異的蛍光法は、電位依存性イオンチャネルを含む多数の膜タンパク質の構造と機能の関係を調べるために選択された技術です。このアプローチは、主に異種発現システムで使用され、膜電流、チャネルの活性の電気的発現、および蛍光測定を同時に測定し、ローカルドメインの再配列を報告しています。機能部位特異的蛍光法は、電気生理学、分子生物学、化学、および蛍光を単一の幅広い技術に組み合わせ、蛍光と電気生理学によってそれぞれリアルタイムの構造再配列と機能の研究を可能にします。通常、このアプローチには、チオール反応性蛍光色素で試験できるシステインを含む、設計された電位依存性メンブレンチャネルが必要です。最近まで、タンパク質の部位特異的蛍光標識に使用されるチオール反応性化学は、アフリカツメガエル卵母細胞および細胞株でのみ行われていたため、初代非興奮性細胞へのアプローチの範囲が制限されていました。本報告では、筋線維の電気的脱分極が筋収縮の活性化と関連しているプロセスである興奮収縮結合の初期段階を研究するために、成人骨格筋細胞における機能部位特異的蛍光測定法の適用性について説明します。本プロトコルは、in vivoエレクトロポレーションおよび機能部位特異的蛍光測定に必要なその後のステップを用いて、システイン工学的電位依存性Ca2+チャネル(CaV1.1)を成体マウスの指屈筋筋線維に設計およびトランスフェクトする方法論を説明する。このアプローチは、他のイオンチャネルやタンパク質の研究にも応用できます。哺乳類の筋肉の機能的な部位特異的蛍光法の使用は、興奮性の基本的なメカニズムの研究に特に関連しています。
Introduction
生細胞内の既知の電気刺激に応答してイオンチャネルの立体配座再配列を追跡する能力は、分子生理学にとって貴重な情報源です1。電位依存性イオンチャネルは、膜貫通電圧の変化を感知する膜タンパク質であり、その機能は電圧変化によっても影響を受けます2。前世紀の電圧クランプ技術の開発により、生理学者は、膜の脱分極に応答して電位依存性イオンチャネルによって運ばれるイオン電流をリアルタイムで研究することができました3。電圧クランプ技術の使用は、ニューロンや筋肉などの興奮性細胞の電気的特性を理解する上で非常に重要です。1970年代には、電圧クランプの改良により、電位依存性カルシウム(Ca V)およびナトリウム(NaV)チャネルのゲーティング電流(または電荷移動)の検出が可能になりました4,5。ゲーティング電流は、細胞膜6を横切る電界の変化に応答した電圧センサの動きから生じる非線形容量性電流である。ゲーティング電流は、イオンチャネルの開口部に先行または付随する分子再配列の電気的発現と見なされます7。これらの電流測定はチャネルの機能に関する貴重な情報を提供しますが、イオン電流とゲート電流はどちらも、電位依存性チャネルの分子間および分子内の立体配座再配列の間接的な読み出しです7。
機能部位特異的蛍光測定法(FSDF、電圧クランプ蛍光測定法、VCFとも呼ばれる)は、1990年代初頭に開発され8、初めて局所的な立体構造の変化とチャネルタンパク質の機能をリアルタイムで直接観察する機能を提供しました。チャネル突然変異誘発、電気生理学、および異種発現システムの組み合わせを使用して、活性化刺激に応答して特定のチャネルまたは受容体の可動部分を蛍光的にタグ付けおよび追跡することができる9、10。このアプローチは、電位依存性イオンチャネル8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19における電圧検出メカニズムの研究に広く用いられてきた。信頼できるレビューについては、10,20,21,22,23を参照してください。
電気信号の開始と伝播に重要なCa VチャネルとNaVチャネルは、中心細孔と4つの非同一電圧検出ドメイン2を有するメインα1サブユニットで構成されています。それらの別個の一次構造に加えて、CaVおよびNaVチャネルは、補助サブユニット24を有するマルチサブユニット複合体として表される。電位依存性カリウムチャネル(KV)は、NaVまたはCaV25の単一ドメインのように見える4つのサブユニットからなる。Ca、VおよびNaVチャネルの孔形成および電圧感知α1サブユニットは、6つの固有の膜貫通セグメントの4つの個別のドメインをコードする単一のポリペプチドによって形成される(S1-S6;図1A)24,26。S1〜S4膜貫通セグメントによって構成される領域は電圧検出ドメイン(VSD)を形成し、S5およびS6膜貫通セグメントは細孔ドメイン26を形成する。各VSDでは、S4 αらせんには、膜脱分極7に応答して移動する正に帯電したアルギニンまたはリジンが含まれています(図1A、B)。数十年の研究と非常に多様な実験的アプローチの結果は、S4セグメントが膜脱分極に応答して外側に移動し、ゲート電流を生成するという前提を支持しています6。
FSDFは、イオンチャネルまたは他のタンパク質上の特定のシステイン残基(すなわち、S4 αヘリックス)に結合したチオール反応性色素の蛍光変化を測定し、部位特異的突然変異誘発によって操作され、チャネルが膜脱分極または他の刺激に応答して機能するにつれて10。実際、FSDFはもともと、チャネルのメイン電圧センサーとして提案されているKVチャネルのS4セグメントが、膜電位の変化に応じてゲーティング電荷が移動するときに動くかどうかを調査するために開発されました8,10。電位依存性イオンチャネルの場合、FSDFはチャネル機能測定と同時に、4つのVSDの独立したコンフォメーション再配列(任意の時点で1つのVSDを追跡)を分解できます。実際、このアプローチを使用して、個々のVSDがチャネルの活性化と不活性化の特定の側面に異なって関与しているように見えることが示されています12、27、28、29、30。チャネルの機能に対する各VSDの寄与を特定することは関連性が高く、チャネル操作をさらに解明し、医薬品開発の新しいターゲットを特定するために使用できます。
異種発現システムにおけるFSDFの使用は、還元主義の観点からチャネル機能の理解を深めるのに非常に役立ちました10,23。多くの還元主義的アプローチと同様に、それは利点を提示しますが、制限もあります。例えば、1つの大きな制限は、異種系におけるチャネルナノ環境の部分的な再構成である。多くの場合、イオンチャネルは、それらの機能を改変する多数の付属サブユニットおよび多数の他のタンパク質と相互作用する31。原則として、異なるチャネルおよびそれらの付属品サブユニットは、複数のタンパク質コードコンストラクトまたはポリシストロニックプラスミドを使用して異種系で発現させることができるが、それらの天然環境を完全に再構成することはできない30,32。
私たちのグループは最近、筋線維の電気的脱分極が筋収縮の活性化に関連しているプロセスである興奮収縮結合(ECC)33,34の初期段階の研究のために、ネイティブの解離骨格筋線維におけるFSDFの変異体を発表しました35,36。初めて、このアプローチは、成人分化筋線維の天然環境における電位依存性L型Ca2+チャネル(CaV1.1、DHPRとしても知られる)からの個々のS4電圧センサの運動追跡を可能にした37。これは、高速刺激による自己増殖脱分極を可能にする細胞の電気的活性、in vivoエレクトロポレーションによるcDNAプラスミドの発現能力、細胞内のチャネルの自然な高発現および区画組織化、高速イメージングおよび電気生理学的記録デバイスとの互換性など、この細胞タイプの複数の特性を考慮することによって達成されました。これまで、検出装置37として高速ライン走査型共焦点顕微鏡を用いた。ここで、信号取得用のフォトダイオードを使用して、この手法のバリエーションを紹介します。このフォトダイオードベースの検出システムは、他の研究室でのこの技術の実装を容易にする可能性があります。
ここでは、CaV1.1からの個々の電圧センサーの動きの研究のためにネイティブセルでFSDFを利用するための段階的なプロトコルについて説明します。この原稿全体で例としてCaV1.1チャネルが使用されてきましたが、この手法は、他のイオンチャネル、受容体、または表面タンパク質の細胞外アクセス可能なドメインに適用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、CaV1.1チャネルからの個々の電圧センサーの動きを研究するために筋線維でFSDFを実施するための段階的なプロトコルについて説明します。この手法で組み合わされるステップ数とアプローチの多様性は複雑に見えるかもしれませんが、これらの手法のほとんどは、生物物理学者/細胞生物学者の研究室で日常的に使用されていることがよくあります。したがって、見かけの複…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
EGFP-CaV1.1(ウサギ)野生型プラスミドを共有してくださったJ. Vergara博士(カリフォルニア大学ロサンゼルス校)に感謝します。イェール大学生理学部電子工学研究所、特にトラックアンドホールド回路を備えたフォトダイオードの設計と構築についてHenrik Abildgaardに感謝します。この作業は、国立衛生研究所の助成金R01-AR075726およびR01-NS103777によってサポートされました
Materials
| Hyaluronidase | SIGMA ALDRICH | H3884-50mg | |
| 0.5 mL Eppendorf tube | Millipore Sigma | EP022363719-500EA | |
| 1 mL syringe | Millipore Sigma | Z683531-100EA | tuberculine slip tip |
| 1/2” long 29-gauge sterile insulin needle and syringe | Becton Dikinson | 324702 | |
| 35 mm non coated plastic plate | Falcon, Corning | 353001 | |
| 60 mm non coated plastic plate | Falcon, Corning | 351007 | |
| Alcoholic whip | PDI | B60307 | |
| Alexa-533 cube LP | Chroma | 49907 | Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp |
| Arc lamp | Sutter Instrumets | LB-LS 672 | |
| Artificial tears cream | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4" | VWR | 14672-200 | |
| BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide) | SIGMA ALDRICH | 203895 | |
| collagenase type I | SIGMA ALDRICH | C0130-1g | |
| Cotton tip | VWR | VWR-76048-960-BG | |
| Double electrode array (for electroporation) | BTX harvard apparatus | 45-0120 | 10mm 2 needle array tips |
| EGFP cube | Chroma | 39002AT | Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m |
| Electroporation apparatus device | BTX harvard apparatus | ECM 830 | |
| EPC10 | HEKA Elektronik GmbH (Harvard Bioscience) | 895000 | |
| FBS | Biotechne, R&D Systems | RND-S11150H | Fetal Bovine Serum – Premium, Heat Inactivated |
| glass coverslip 35 mm dish | MatTek Life Science | P35G-1.5-14-C | |
| Isoflurane | Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation | 502017-250ml | |
| Isothermal heating pad | Braintree scientific inc | 39DP | |
| Laminin | Thermo Fisher | INV-23017015 | Laminin Mouse Protein, Natural |
| Latex bulb | VWR | 82024-554 | |
| LED 530 nm | Sutter Instrumets | 5A-530 | |
| Low binding protein 0.2 μm sterile filter | Pall | FG4579 | acrodisk syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic |
| MEM | Invitrogen | INV-11380037 | |
| MTS-5-TAMRA | Biotium | 89410-784 | MTS-5-TAMRA |
| OriginPro Analysis Software | OriginLab Corporation | OriginPro 2022 (64-bit) SR1 | |
| Photodiode | Custom Made | NA | |
| PlanApo 60x oil 1.4 N.A/∞/0.17 | Olympus | BFPC2 | |
| Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis | SIGMA | 267228-1G | To manufacyte field stimulation electrode |
| Pulse Generator | WPI | Pulsemaster A300 | |
| Shutter drive controller | Uniblitz | 100-2B | |
| Shuttter | Uniblitz | VS2582T0-100 | |
| S-MEM | Invitrogen | INV-11380037 | |
| Sterile bench pad | VWR | DSI-B1623 | |
| Sterile saline | SIGMA ALDRICH | S8776 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer kit | Dow Corning | 1419447-1198 | |
| Vaporizer for Anesthesia | Parkland Scientific | V3000PK | |
| Voltage generator | Custom Made | NA |
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