İşlevsel bölgeye yönelik florometri, protein alanı hareketlerini gerçek zamanlı olarak incelemek için kullanılan bir yöntemdir. Bu tekniğin doğal hücrelerde uygulanması için modifikasyonu, artık murin izole iskelet kası liflerindeki voltaj kapılı Ca2 + kanallarından tek voltaj sensörü hareketlerinin tespit edilmesine ve izlenmesine izin vermektedir.
İşlevsel bölgeye yönelik florometri, voltaj kapılı iyon kanalları da dahil olmak üzere çok sayıda membran proteininin yapı-fonksiyon ilişkisini araştırmak için tercih edilen teknik olmuştur. Bu yaklaşım öncelikle heterolog ekspresyon sistemlerinde, membran akımlarını, kanalların aktivitesinin elektriksel tezahürünü ve floresan ölçümlerini eşzamanlı olarak ölçmek ve yerel alan yeniden düzenlemelerini raporlamak için kullanılmıştır. İşlevsel sahaya yönelik florometri, elektrofizyoloji, moleküler biyoloji, kimya ve floresanı, sırasıyla floresan ve elektrofizyoloji yoluyla gerçek zamanlı yapısal yeniden düzenlemelerin ve fonksiyonların incelenmesine izin veren tek bir geniş kapsamlı teknikte birleştirir. Tipik olarak, bu yaklaşım, bir tiol-reaktif floresan boya ile test edilebilen bir sistein içeren mühendislik voltaj kapılı bir membran kanalı gerektirir. Yakın zamana kadar, proteinlerin bölgeye yönelik floresan etiketlemesi için kullanılan tiol-reaktif kimya, yalnızca Xenopus oositlerinde ve hücre hatlarında gerçekleştirildi ve birincil uyarılamayan hücrelere yaklaşımın kapsamını kısıtladı. Bu raporda, yetişkin iskelet kası hücrelerinde fonksiyonel bölgeye yönelik florometrinin, kas lifi elektriksel depolarizasyonunun kas kasılmasının aktivasyonu ile bağlantılı olduğu süreç olan uyarılma-kasılma eşleşmesinin erken adımlarını incelemek için uygulanabilirliği açıklanmaktadır. Bu protokol, in vivo elektroporasyon kullanarak yetişkin farelerin fleksör digitorum brevis’inin kas liflerine sistein mühendisliği ile tasarlanmış voltaj kapılı Ca2+ kanallarını (CaV1.1) tasarlamak ve transfekte etmek için metodolojileri ve fonksiyonel bölgeye yönelik florometri ölçümleri için gerekli sonraki adımları açıklamaktadır. Bu yaklaşım diğer iyon kanallarını ve proteinleri incelemek için uyarlanabilir. Memeli kasının fonksiyonel bölgeye yönelik florometrisinin kullanımı, uyarılabilirliğin temel mekanizmalarını incelemek için özellikle önemlidir.
Canlı bir hücrede bilinen bir elektriksel uyarana yanıt olarak iyon kanalı konformasyonel yeniden düzenlemelerini izleme yeteneği, moleküler fizyoloji1 için değerli bir bilgi kaynağıdır. Voltaj kapılı iyon kanalları, transmembran voltajındaki değişiklikleri algılayan membran proteinleridir ve işlevleri voltaj değişimlerinden de etkilenir2. Geçen yüzyılda voltaj kelepçesi tekniklerinin geliştirilmesi, fizyologların membran depolarizasyonuna yanıt olarak voltaj kapılı iyon kanalları tarafından taşınan iyonik akımları gerçek zamanlı olarak incelemelerine izin verdi3. Voltaj kelepçesi teknolojisinin kullanımı, nöronlar ve kas gibi uyarılabilir hücrelerin elektriksel özelliklerini anlamada çok önemli olmuştur. 1970’lerde, voltaj kelepçesi arıtılması, voltaj kapılı kalsiyum (Ca V) ve sodyum (NaV) kanallarındaki geçit akımlarının (veya şarj hareketinin) algılanmasına izin verdi 4,5. Geçit akımları, hücre zarı6 boyunca elektrik alanındaki değişikliklere yanıt olarak voltaj sensörlerinin hareketinden kaynaklanan doğrusal olmayan kapasitif akımlardır. Geçit akımları, iyon kanalı açılışından önce veya ona eşlik eden moleküler yeniden düzenlemelerin elektriksel bir tezahürü olarak kabul edilir7. Bu akım ölçümleri kanalın işlevi hakkında değerli bilgiler sağlarken, hem iyonik akımlar hem de geçit akımları, voltaj kapılıkanalların 7 moleküller arası ve moleküller arası konformasyonel yeniden düzenlemelerinin dolaylı okumalarıdır.
İşlevsel bölgeye yönelik florometri (FSDF; voltaj kelepçeli florometri, VCF olarak da adlandırılır) 1990’ların başında geliştirilmiştir8 ve ilk kez, yerel konformasyonel değişiklikleri ve bir kanal proteininin işlevini gerçek zamanlı olarak doğrudan görüntüleme yeteneği sağlamıştır. Kanal mutajenezisi, elektrofizyoloji ve heterolog ekspresyon sistemlerinin bir kombinasyonunu kullanarak, aktive edici uyaran 9,10’a yanıt olarak spesifik kanalların veya reseptörlerin hareketli kısımlarını floresan olarak etiketlemek ve izlemek mümkündür. Bu yaklaşım, 8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 gerilim kapılıiyon kanallarındaki voltaj algılama mekanizmalarını incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır. Yetkili incelemeler için bkz: 10,20,21,22,23.
Elektrik sinyallerinin başlatılması ve yayılması için kritik öneme sahip olan Ca V ve NaV kanalları, merkezi bir gözenek ve dört özdeş olmayan voltaj algılama alanına sahip bir ana α1 alt biriminden oluşur2. Farklı birincil yapılarına ek olarak, Ca V ve NaV kanalları, yardımcı alt birimleri24 olan çok alt birim kompleksleri olarak ifade edilir. Gerilime bağlı potasyum kanalları (K V), Na V veya CaV25’in tek bir alanına benzeyen dört alt birimden oluşur. Ca V ve NaV kanallarının gözenek oluşturan ve gerilim algılayan α1 alt birimi, altı benzersiz transmembran segmentinin dört ayrı alanı için tek bir polipeptit kodlaması ile oluşturulur (S1-S6; Şekil 1A) 24,26. S1 ila S4 transmembran segmentlerinden oluşan bölge voltaj algılama alanını (VSD) ve S5 ve S6 transmembran segmentleri gözenek alanı26’yı oluşturur. Her VSD’de, S4 α-sarmalı, membran depolarizasyonuna yanıt olarak hareket eden pozitif yüklü arginin veya lizin içerir (Şekil 1A, B)7. Birkaç on yıllık araştırma ve çok çeşitli deneysel yaklaşımlardan elde edilen sonuçlar, S4 segmentlerinin membran depolarizasyonuna yanıt olarak geçit akımları üreterek dışa doğru hareket ettiği öncülünü desteklemektedir6.
FSDF, bir iyon kanalı veya başka bir protein üzerindeki belirli bir sistein kalıntısına (yani, S4 α-sarmal) konjuge edilmiş bir tiyol-reaktif boyanın floresan değişikliklerini ölçer, çünkü kanal membran depolarizasyonuna veya diğer uyaranlara yanıt olarak işlev görür10. Aslında, FSDF başlangıçta kanalın ana voltaj sensörü olarak önerilen KV kanallarındaki S4 segmentinin, geçit yükleri membran potansiyeli 8,10’daki değişikliklere yanıt olarak hareket ettiğinde hareket edip etmediğini araştırmak için geliştirilmiştir. Gerilim kapılı iyon kanalları durumunda, FSDF, kanal fonksiyonu ölçümleriyle eşzamanlı olarak dört VSD’nin bağımsız konformasyonel yeniden düzenlemelerini (herhangi bir zamanda bir VSD’yi izleme) çözebilir. Gerçekten de, bu yaklaşımı kullanarak, bireysel VSD’lerin kanal aktivasyonu ve inaktivasyonunun belirli yönleriyle farklı şekilde ilişkili olduğu gösterilmiştir 12,27,28,29,30. Her VSD’nin kanalların işlevine katkısını belirlemek yüksek önem taşır ve kanal çalışmasını daha fazla aydınlatmak ve potansiyel olarak ilaç geliştirme için yeni hedefler belirlemek için kullanılabilir.
FSDF’nin heterolog ekspresyon sistemlerinde kullanılması, kanal fonksiyonunu indirgemeci bir perspektiften anlamamızı geliştirmede son derece yardımcı olmuştur10,23. Birçok indirgemeci yaklaşım gibi, avantajlar sunar ancak aynı zamanda sınırlamaları da vardır. Örneğin, önemli bir sınırlama, heterolog sistemdeki kanal nano ortamının kısmi olarak yeniden yapılandırılmasıdır. Çoğu zaman, iyon kanalları çok sayıda aksesuar alt birimi ve işlevlerini değiştiren çok sayıda başka protein ile etkileşime girer31. Prensip olarak, farklı kanallar ve bunların aksesuar alt birimleri, çoklu protein kodlama yapıları veya polisistronik plazmidler kullanılarak heterolog sistemlerde ifade edilebilir, ancak doğal ortamları tam olarak yeniden oluşturulamaz30,32.
Grubumuz yakın zamanda, kas lifi elektriksel depolarizasyonunun kas kasılmasının aktivasyonu ile bağlantılı olduğu süreç olan uyarma-kasılma eşleşmesinin (ECC) 33,34 erken adımlarının incelenmesi için doğal ayrışmış iskelet kası liflerinde FSDF’nin bir varyantını yayınladı 35,36. İlk kez, bu yaklaşım, yetişkin bir farklılaştırılmış kas lifi37’nin doğal ortamında voltaj kapılı L tipi Ca2 + kanalından (CaV1.1, DHPR olarak da bilinir) bireysel S4 voltaj sensörlerinin hareket takibine izin verdi. Bu, hızlı stimülasyona bağlı kendi kendine yayılan depolarizasyona izin veren hücrenin elektriksel aktivitesi, in vivo elektroporasyon yoluyla cDNA plazmidini eksprese etme yeteneği, hücre içindeki kanalların doğal yüksek ekspresyonu ve bölmeli organizasyonu ve yüksek hızlı görüntüleme ve elektrofizyolojik kayıt cihazlarıyla uyumluluğu dahil olmak üzere bu hücre tipinin çoklu özellikleri göz önünde bulundurularak gerçekleştirildi. Daha önce, algılama cihazı olarak yüksek hızlı bir çizgi taramalı konfokal mikroskop kullandık37. Şimdi, tekniğin bir varyasyonu, sinyal alımı için bir fotodiyot kullanılarak sunulmaktadır. Bu fotodiyot tabanlı algılama sistemi, bu tekniğin diğer laboratuvarlarda uygulanmasını kolaylaştırabilir.
Burada, CaV1.1’den bireysel voltaj sensörü hareketinin incelenmesi için doğal hücrelerde FSDF’yi kullanmak için adım adım bir protokol açıklanmaktadır. CaV1.1 kanalı bu makale boyunca örnek olarak kullanılmış olsa da, bu teknik diğer iyon kanallarının, reseptörlerin veya yüzey proteinlerinin hücre dışı erişilebilir alanlarına uygulanabilir.
Burada, CaV1.1 kanalından bireysel voltaj sensörü hareketlerinin incelenmesi için kas liflerinde FSDF’yi yürütmek için adım adım bir protokol açıklanmaktadır. Bu teknikte birleştirilen adımların sayısı ve yaklaşımların çeşitliliği karmaşık görünse de, bu tekniklerin çoğu genellikle biyofizikçi / hücre biyoloğu laboratuvarlarında rutin olarak kullanılmaktadır. Bu nedenle, görünen karmaşıklık, esas olarak, tüm çeşitli yaklaşımların tek bir entegre teknikte birleştir…
The authors have nothing to disclose.
Dr. J. Vergara’ya (Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles) EGFP-CaV1.1 (tavşan) vahşi tip plazmidini paylaştığı için teşekkür ederiz. Yale Fizyoloji Bölümü Elektronik Laboratuvarı’na ve özellikle Henrik Abildgaard’a iz ve tutma devreli fotodiyotun tasarımı ve yapımı için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir R01-AR075726 ve R01-NS103777
Hyaluronidase | SIGMA ALDRICH | H3884-50mg | |
0.5 mL Eppendorf tube | Millipore Sigma | EP022363719-500EA | |
1 mL syringe | Millipore Sigma | Z683531-100EA | tuberculine slip tip |
1/2” long 29-gauge sterile insulin needle and syringe | Becton Dikinson | 324702 | |
35 mm non coated plastic plate | Falcon, Corning | 353001 | |
60 mm non coated plastic plate | Falcon, Corning | 351007 | |
Alcoholic whip | PDI | B60307 | |
Alexa-533 cube LP | Chroma | 49907 | Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp |
Arc lamp | Sutter Instrumets | LB-LS 672 | |
Artificial tears cream | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4" | VWR | 14672-200 | |
BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide) | SIGMA ALDRICH | 203895 | |
collagenase type I | SIGMA ALDRICH | C0130-1g | |
Cotton tip | VWR | VWR-76048-960-BG | |
Double electrode array (for electroporation) | BTX harvard apparatus | 45-0120 | 10mm 2 needle array tips |
EGFP cube | Chroma | 39002AT | Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m |
Electroporation apparatus device | BTX harvard apparatus | ECM 830 | |
EPC10 | HEKA Elektronik GmbH (Harvard Bioscience) | 895000 | |
FBS | Biotechne, R&D Systems | RND-S11150H | Fetal Bovine Serum – Premium, Heat Inactivated |
glass coverslip 35 mm dish | MatTek Life Science | P35G-1.5-14-C | |
Isoflurane | Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation | 502017-250ml | |
Isothermal heating pad | Braintree scientific inc | 39DP | |
Laminin | Thermo Fisher | INV-23017015 | Laminin Mouse Protein, Natural |
Latex bulb | VWR | 82024-554 | |
LED 530 nm | Sutter Instrumets | 5A-530 | |
Low binding protein 0.2 μm sterile filter | Pall | FG4579 | acrodisk syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic |
MEM | Invitrogen | INV-11380037 | |
MTS-5-TAMRA | Biotium | 89410-784 | MTS-5-TAMRA |
OriginPro Analysis Software | OriginLab Corporation | OriginPro 2022 (64-bit) SR1 | |
Photodiode | Custom Made | NA | |
PlanApo 60x oil 1.4 N.A/∞/0.17 | Olympus | BFPC2 | |
Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis | SIGMA | 267228-1G | To manufacyte field stimulation electrode |
Pulse Generator | WPI | Pulsemaster A300 | |
Shutter drive controller | Uniblitz | 100-2B | |
Shuttter | Uniblitz | VS2582T0-100 | |
S-MEM | Invitrogen | INV-11380037 | |
Sterile bench pad | VWR | DSI-B1623 | |
Sterile saline | SIGMA ALDRICH | S8776 | |
Sylgard 184 Silicone Elastomer kit | Dow Corning | 1419447-1198 | |
Vaporizer for Anesthesia | Parkland Scientific | V3000PK | |
Voltage generator | Custom Made | NA |