Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Functionele site-directed fluorometrie in inheemse cellen om de prikkelbaarheid van skeletspieren te bestuderen

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/65311
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine

Summary

Functionele site-directed fluorometrie is een methode om eiwitdomeinbewegingen in realtime te bestuderen. Modificatie van deze techniek voor de toepassing ervan in native cellen maakt nu de detectie en tracking mogelijk van bewegingen van enkele spanningssensor van spanningsafhankelijke Ca2 + -kanalen in murine geïsoleerde skeletspiervezels.

Abstract

Functionele site-directed fluorometrie is de techniek bij uitstek geweest om de structuur-functie relatie van talrijke membraaneiwitten te onderzoeken, inclusief spanningsafhankelijke ionkanalen. Deze benadering is voornamelijk gebruikt in heterologe expressiesystemen om tegelijkertijd membraanstromen, de elektrische manifestatie van de activiteit van de kanalen en fluorescentiemetingen te meten, waarbij lokale domeinherschikkingen worden gerapporteerd. Functionele site-directed fluorometrie combineert elektrofysiologie, moleculaire biologie, chemie en fluorescentie in een enkele brede techniek die de studie van real-time structurele herschikkingen en functie door middel van respectievelijk fluorescentie en elektrofysiologie mogelijk maakt. Meestal vereist deze aanpak een ontworpen spanningsomheind membraankanaal dat een cysteïne bevat die kan worden getest door een thiol-reactieve fluorescerende kleurstof. Tot voor kort werd de thiol-reactieve chemie die werd gebruikt voor de plaatsgerichte fluorescerende etikettering van eiwitten uitsluitend uitgevoerd in Xenopus-eicellen en cellijnen, waardoor de reikwijdte van de benadering tot primaire niet-prikkelbare cellen werd beperkt. Dit rapport beschrijft de toepasbaarheid van functionele site-directed fluorometrie in volwassen skeletspiercellen om de vroege stappen van excitatie-contractiekoppeling te bestuderen, het proces waarbij elektrische depolarisatie van spiervezels wordt gekoppeld aan de activering van spiercontractie. Het huidige protocol beschrijft de methodologieën voor het ontwerpen en transfecteren van cysteïne-engineered voltage-gated Ca2 + -kanalen (CaV1.1) in spiervezels van de flexor digitorum brevis van volwassen muizen met behulp van in vivo elektroporatie en de daaropvolgende stappen die nodig zijn voor functionele site-directed fluorometriemetingen. Deze aanpak kan worden aangepast om andere ionkanalen en eiwitten te bestuderen. Het gebruik van functionele plaatsgerichte fluorometrie van zoogdierspieren is met name relevant voor het bestuderen van basismechanismen van prikkelbaarheid.

Introduction

Het vermogen om conformatieherschikkingen van ionkanalen te volgen als reactie op een bekende elektrische stimulus in een levende cel is een bron van waardevolle informatie voor de moleculaire fysiologie1. Voltage-gated ionkanalen zijn membraaneiwitten die veranderingen in transmembraanspanning waarnemen, en hun functie wordt ook beïnvloed door spanningsveranderingen2. De ontwikkeling van spanningsklemtechnieken in de vorige eeuw stelde fysiologen in staat om in real-time ionische stromen te bestuderen die door spanningsafhankelijke ionkanalen werden gedragen als reactie op membraandepolarisatie3. Het gebruik van spanningsklemtechnologie is cruciaal geweest bij het begrijpen van de elektrische eigenschappen van prikkelbare cellen zoals neuronen en spieren. In de jaren 1970 maakte de verfijning van de spanningsklem de detectie mogelijk van gatingstromen (of laadbeweging) in spanningsafhankelijke calcium- (Ca V) en natriumkanalen(NaV) 4,5. Gatingstromen zijn niet-lineaire capacitieve stromen die ontstaan door de beweging van spanningssensoren als reactie op veranderingen in het elektrische veld over het celmembraan6. Gating-stromen worden beschouwd als een elektrische manifestatie van moleculaire herschikkingen die voorafgaan aan of gepaard gaan met ionkanaalopening7. Hoewel deze stroommetingen waardevolle informatie opleveren over de functie van het kanaal, zijn zowel ionische stromen als gatingstromen indirecte uitlezingen van inter- en intramoleculaire conformatieherschikkingen van spanningsafhankelijke kanalen7.

Functionele site-directed fluorometrie (FSDF; ook wel spanningsklemfluorometrie, VCF) werd ontwikkeld in de vroege jaren 19908 en bood voor het eerst de mogelijkheid om lokale conformatieveranderingen en de functie van een kanaaleiwit in realtime direct te bekijken. Met behulp van een combinatie van kanaalmutagenese, elektrofysiologie en heterologe expressiesystemen is het mogelijk om de bewegende delen van specifieke kanalen of receptoren fluorescerend te taggen en te volgen als reactie op de activerende stimulus 9,10. Deze benadering is uitgebreid gebruikt om de spanningsdetectiemechanismen in spanningsafhankelijke ionkanalen 8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 te bestuderen. Voor gezaghebbende beoordelingen, zie 10,20,21,22,23.

De Ca V- en NaV-kanalen, die cruciaal zijn voor het initiëren en voortplanten van elektrische signalen, bestaan uit een hoofd-α1-subeenheid, die een centrale porie en vier niet-identieke spanningsdetectiedomeinen2 bezit. Naast hun verschillende primaire structuur worden Ca V- en NaV-kanalen uitgedrukt als multisubunitcomplexen met hulpsubeenheden24. Spanningsafhankelijke kaliumkanalen (K V) bestaan uit vier subeenheden die eruit zien als een enkel domein van Na V of CaV25. De porievormende en spanningsgevoelige α1-subeenheid van Ca V- en NaV-kanalen wordt gevormd door een enkele polypeptide die codeert voor vier afzonderlijke domeinen van zes unieke transmembraansegmenten (S1-S6; Figuur 1A) 24,26. Het gebied bestaande uit S1 tot S4 transmembraansegmenten vormen het spanningsdetectiedomein (VSD) en S5- en S6-transmembraansegmenten vormen het poriedomein26. In elke VSD bevat de S4 α-helix positief geladen arginine of lysine (figuur 1A, B) die bewegen als reactie op membraandepolarisatie7. Enkele decennia van onderzoek en de resultaten van zeer diverse experimentele benaderingen ondersteunen het uitgangspunt dat S4-segmenten naar buiten bewegen en gatingstromen genereren, als reactie op membraandepolarisatie6.

FSDF meet de fluorescentieveranderingen van een thiol-reactieve kleurstof geconjugeerd aan een specifiek cysteïneresidu (d.w.z. de S4 α-helix) op een ionkanaal of ander eiwit, gemanipuleerd via plaatsgerichte mutagenese, omdat het kanaal functioneert als reactie op membraandepolarisatie of andere stimuli10. In feite is FSDF oorspronkelijk ontwikkeld om te onderzoeken of het S4-segment in KV-kanalen, voorgesteld als de hoofdspanningssensor van het kanaal, beweegt wanneer de gatingladingen bewegen als reactie op veranderingen in membraanpotentiaal 8,10. In het geval van voltage-gated ionkanalen kan FSDF onafhankelijke conformatieherschikkingen van de vier VSD's oplossen (waarbij één VSD op een bepaald moment wordt gevolgd), gelijktijdig met kanaalfunctiemetingen. Met behulp van deze benadering is inderdaad aangetoond dat individuele VSD's differentieel betrokken lijken te zijn bij specifieke aspecten van kanaalactivering en -inactivatie 12,27,28,29,30. Het identificeren van de bijdrage van elke VSD aan de functie van de kanalen is van groot belang en kan worden gebruikt om de werking van het kanaal verder te verduidelijken en mogelijk nieuwe doelen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen te identificeren.

Het gebruik van FSDF in heterologe expressiesystemen is zeer nuttig geweest bij het bevorderen van ons begrip van kanaalfunctie vanuit een reductionistisch perspectief10,23. Zoals veel reductionistische benaderingen biedt het voordelen, maar heeft het ook beperkingen. Een belangrijke beperking is bijvoorbeeld de gedeeltelijke reconstitutie van de kanaalnano-omgeving in het heterologe systeem. Vaak interageren ionkanalen met tal van accessoire subeenheden en tal van andere eiwitten die hun functie wijzigen31. In principe kunnen verschillende kanalen en hun accessoire subeenheden worden uitgedrukt in heterologe systemen met behulp van meerdere eiwitcoderende constructen of polycistronische plasmiden, maar hun oorspronkelijke omgeving kan niet volledig worden gereconstitueerd30,32.

Onze groep publiceerde onlangs een variant van FSDF in inheemse gedissocieerde skeletspiervezels voor de studie van vroege stappen van excitatie-contractiekoppeling (ECC)33,34, het proces waarbij elektrische depolarisatie van spiervezels wordt gekoppeld aan de activering van spiercontractie 35,36. Voor het eerst maakte deze aanpak het mogelijk om individuele S4-spanningssensoren te volgen van het spanningsafhankelijke L-type Ca2 + -kanaal (CaV1.1, ook bekend als DHPR) in de oorspronkelijke omgeving van een volwassen gedifferentieerde spiervezel37. Dit werd bereikt door rekening te houden met meerdere kenmerken van dit celtype, waaronder de elektrische activiteit van de cel die snelle stimulatie-geïnduceerde zelfgepropageerde depolarisatie mogelijk maakt, het vermogen om cDNA-plasmide tot expressie te brengen door middel van in vivo elektroporatie, de natuurlijke hoge expressie en compartimentale organisatie van de kanalen in de cel, en de compatibiliteit met snelle beeldvorming en elektrofysiologische opnameapparaten. Voorheen gebruikten we een confocale microscoop met hoge snelheid als detectieapparaat37. Nu wordt een variant van de techniek gepresenteerd met behulp van een fotodiode voor signaalacquisitie. Dit op fotodiode gebaseerde detectiesysteem zou de implementatie van deze techniek in andere laboratoria kunnen vergemakkelijken.

Hier wordt een stapsgewijs protocol beschreven om FSDF in native cellen te gebruiken voor de studie van individuele spanningssensorbewegingen van CaV1.1. Hoewel het CaV1.1-kanaal in dit manuscript als voorbeeld is gebruikt, kan deze techniek worden toegepast op extracellulair toegankelijke domeinen van andere ionkanalen, receptoren of oppervlakte-eiwitten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dit protocol is goedgekeurd door de University of Maryland Institutional Animal Care and Use Committee. Het volgende protocol is onderverdeeld in meerdere subsecties, bestaande uit (1) moleculair constructontwerp en cysteïne-reagerende kleurstofselectie, (2) in vivo elektroporatie, (3) spierdissectie en vezelisolatie, (4) beschrijving van de acquisitie-opstelling, (5) beoordeling van verbeterde groene fluorescerende eiwit (EGFP) positieve vezel elektrische activiteit en cysteïnekleuring, en (6) signaalacquisitie en -verwerking. Bovendien worden aan het begin van elke sectie enkele relevante overwegingen beschreven bij het aanbrengen van FSDF in een skeletspiervezel. Alle protocolsecties moeten worden uitgevoerd met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder een laboratoriumjas en handschoenen.

1. Moleculair constructontwerp en cysteïne-reagerende kleurstofselectie

  1. Constructontwerp is een cruciaal onderdeel van het succes van het experiment. Genereer eerst een wild-type, fluorescerend gelabeld CaV1.1 cDNA-construct en evalueer de expressie ervan in het juiste celtype. Voor spiervezels kan een sterke transfectie-efficiëntie worden bereikt door een plasmide te gebruiken dat een cytomegalovirus (CMV) -promotor draagt. In dit protocol werd een reeds gekarakteriseerd konijn EGFP-CaV1.1 plasmide gebruikt38.
    OPMERKING: Bij het ontwerpen van de cDNA-constructie om een cysteïneresidu in een spanningsomheind ionkanaal te introduceren, is de cysteïnepositie van cruciaal belang en moet deze zorgvuldig worden overwogen. De cysteïne moet toegankelijk zijn vanuit de extracellulaire ruimte om een thiol-geconjugeerde kleurstofreactie mogelijk te maken (figuur 1C,D) en moet proximaal zijn ten opzichte van het S4-gebied om de beweging ervan nauwkeurig te volgen als reactie op depolarisatie. Om kleurstoffluorescentie te kunnen doven als reactie op eiwitbeweging, moet de geïntroduceerde cysteïne-geconjugeerde fluorofoor zich op het grensvlak van twee verschillende omgevingen bevinden (bijv. Membraan en extracellulaire vloeistof; Figuur 1E). Bovendien is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de ingebrachte cysteïne de eiwitfunctie niet verstoort.
  2. Om een idee te krijgen over de juiste cysteïnelokalisatie, verzamelt u informatie over de kanaalstructuur of uit andere fluorometrie-experimenten van andere gerelateerde kanaaleiwitten. Voor het ontwerp van cysteïne-engineered Ca V 1.1-constructies, evalueert u de opgeloste cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) -structuur van het kanaal26 en vergelijkt u de cysteïne-insertie vaneerder werk van gerelateerde kanalen zoals CaV1.2 12, of andere kanalen zoals Shaker11 en NaChBac39.
  3. Zodra de juiste cysteïnepositie is gekozen, gebruikt u een commerciële site-gerichte mutagenesekit om cysteïnesubstituties te introduceren. In dit protocol werden de volgende cysteïnemodificaties onafhankelijk van elkaar ontworpen op elk cytosolisch uiteinde van het S4-spanningsgevoelige segment van CaV1.1: VSD-I (L159C), VSD-II (L522C), VSD-III (V893C), VSD-IV (S1231C) en UniProtKB: P07293 (figuur 1B).
  4. Gebruik voor skeletspiervezels 5-carboxytetramethylrhodamine-methanethiosulfonaat (MTS-5-TAMRA), dat een goede en snelle diffusie vertoont in het transversale tubulusmembraansysteem, dat een invaginatie is van het oppervlaktemembraan en de overheersende locatie van CaV1.1-kanalen. MTS-5-TAMRA vertoont een afname van de fluorescentie bij de overgang van het lipidemembraan naar een waterige omgeving (figuur 1E).
    OPMERKING: Dylight- of Alexa-maleimidederivaten kleuren het oppervlaktemembraan, maar niet het transversale tubulussysteem.

Figure 1
Figuur 1: Schematische weergave van de thiol-cysteïnereactie op het grensvlak van een transmembraan α-helix. (A) L-type CaV 1.1 membraantopologie. De plustekens vertegenwoordigen basisresiduen in de S4 α-helix en de oranje sterren geven de locatie aan waar cysteïne werd geïntroduceerd via plaatsgerichte mutagenese. (B) Sequentie-uitlijning van S4I tot S4IV van konijn CaV1.1 (UniProtKB: P07293). Positief geladen arginine- en lysineresiduen die cruciaal zijn voor spanningsdetectie zijn rood gemarkeerd, terwijl technische cysteïnesubstituties in oranje worden aangegeven. Dit paneel is aangepast van referentie37. (C) Cysteïne-thiol fluorescerende molecuulreactie. (D) Diagram ter illustratie van cysteïnemutagenese-insertie binnen een transmembraan spanningsgevoelige α-helix. Cysteïne moet in rust in het membraan worden begraven en extracellulair toegankelijk zijn na depolarisatie (ΔV; I). Het volgen van cysteïne is meestal onwaarschijnlijk als doelcysteïne al toegankelijk is vanuit de extracellulaire ruimte vóór depolarisatie (II) of als de cysteïne niet toegankelijk is vanuit de extracellulaire ruimte na depolarisatie (III). (E) Na de reactie met het thiolfluorescerende molecuul vermindert α-helixbeweging als reactie op depolarisatie de MTS-5-TAMRA fluorescentie-emissie. Het fluorometrische signaal wordt gegenereerd door de beweging van de S4-helix en de daaropvolgende kleurstofbeweging ten opzichte van het vlak van het membraan en de waterige omgeving. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. In vivo elektroporatie

OPMERKING: Elektroporatie-experimenten werden uitgevoerd zoals eerder beschreven38 met modificaties. In de volgende sectie is het protocol ontworpen voor de elektroporatie van één voetkussen van de muis. Volumes moeten worden aangepast als beide poten zijn voorbereid.

  1. Aliquot 25-100 μL plasmide-oplossing bij 2-5 μg/μL in een buis van 1,5 ml op ijs.
  2. Bereid een 0,5 ml oplossing van 2 mg/ml hyaluronidase in een steriele zoutoplossing en filtreer de oplossing door een steriel filter met een laag bindend eiwit van 0,2 μm dat op een spuit van 1 ml is gemonteerd. Bewaren in een tube van 1,5 ml bij kamertemperatuur.
  3. Met behulp van een gekalibreerd anesthesieapparaat verdooft u een muis met behulp van 3% -4,5% isofluraan in O2 (1 l / min) door de muis in de anesthesiekamer te plaatsen. Bevestig adequate anesthesie van het dier door in de punt van de staart te knijpen met een pincet. Er mag geen reactie worden waargenomen wanneer optimale anesthesie is bereikt.
  4. Verwijder de muis uit de anesthesiekamer en plaats een anesthesieneusmasker over de muis. Plaats het dier op zijn rug op een isothermische verwarmingspad bedekt met een steriele bankkussen. Vervolg de anesthesie met behulp van het knaagdiermasker met 3% isofluraan in O2 (1 l/min).
  5. Om droge ogen tijdens de procedure te voorkomen, brengt u een fijne laag kunstmatige traancrème aan op de ogen van het dier met een steriele katoenen tip. Desinfecteer de poot van het dier met een steriel doekje verzadigd met ethylalcohol.
  6. Gebruik een 0,5 in lange 29 G steriele insulinenaald en zuig 20 μL hyaluronidase-oplossing op. Penetreer de huid ter hoogte van de hiel en schuif de naald onderhuids naar de basis van de tenen (figuur 2A). Injecteer de oplossing langzaam terwijl u de naald geleidelijk naar achteren beweegt. Een bolus of bult moet onder de poot worden waargenomen (figuur 2B).
    OPMERKING: Afhankelijk van de leeftijd van het dier en de grootte van de poot, is het waarschijnlijk dat de volledige hoeveelheid oplossing mogelijk niet wordt geïnjecteerd. Vaak kan een klein lek door het injectiepunt optreden.
  7. Herhaal stap 2.6 met de andere poot, indien gewenst, met een andere steriele naald na een goede pootdesinfectie, zoals in stap 2.5.
  8. Koppel de anesthesie los door het dier uit het neusmasker te verwijderen en breng de muis terug naar de kooi met toegang tot voedsel en water ad libitum. Volledig herstel van anesthesie moet binnen ~ 5 minuten worden waargenomen. Plaats de buis met de plasmide-oplossing op de bank zodat deze op kamertemperatuur kan komen.
  9. Verdoof het dier na 1 uur een tweede keer, plaats het op het verwarmingskussen en desinfecteer de poot zoals beschreven in stappen 2.3-2.5.
  10. Injecteer 10-20 μL van het cDNA-construct, met behulp van dezelfde techniek die wordt beschreven in stap 2.6. De totale hoeveelheid geïnjecteerde construct is 50-100 μg per poot. Herhaal de procedure met de contralaterale poot indien gewenst met een andere steriele spuit.
  11. Houd het dier onder narcose op het isothermische verwarmingskussen gedurende 5 minuten om de cDNA-oplossing gelijkmatig door het weefsel te laten verspreiden.
  12. Schakel het apparaat voor elektroporatieapparatuur in en sluit het aan op de dubbele elektrode-array, zoals aanbevolen door de fabrikant.
  13. Desinfecteer de dubbele elektrode-array met een doekje verzadigd met ethylalcohol. Stabiliseer de poot met één hand en steek eerst één elektrode onder de huid aan de achterkant van de hiel. Plaats vervolgens de tweede elektrode aan de basis van de tenen en zorg ervoor dat de oriëntaties van beide elektroden loodrecht op de as van de voet staan (figuur 2C). Oriënteer de sonde in een positie die de voet of het been niet beperkt in een extreme hoekoriëntatie.
    OPMERKING: Het inbrengen van elektroden kan worden vergemakkelijkt met behulp van een pincet en door de uiteinden van de elektroden regelmatig te slijpen. Afhankelijk van de leeftijd van het dier kan de grootte van de poot variëren en moet de elektrodeafstand dienovereenkomstig worden aangepast.
  14. Elektroporate de spieren door het toepassen van 20 pulsen, 20 ms in duur/elk, op 1 Hz. Voor elektrodenaalden met een onderlinge afstand van 1 cm stelt u de spanning in op ~ 100 V. Dit moet worden aangepast als de elektrodeafstand wordt gewijzigd om ~ 100 V / cm te bereiken. Lichte flexie van de cijfers moet worden waargenomen tijdens de pulsafgifte als de elektroden correct zijn geplaatst.
  15. Herhaal stap 2.13 en 2.14 indien gewenst met de contralaterale poot.
  16. Koppel de anesthesie los en plaats het dier in een kooi, geïsoleerd van zijn niet-geëlektropoeerde tegenpartner met toegang tot voedsel en water ad libitum gedurende 2 uur. Volledig herstel van anesthesie moet worden waargenomen in ~ 10 min. Plaats het dier terug in de kooi.
    OPMERKING: De expressie van cDNA-construct(en) is sterk afhankelijk van het eiwit dat gecodeerd is. Eiwitomzet, kwantiteit en kwaliteit van cDNA, plasmidepromotor en andere variabelen kunnen de constructexpressie beïnvloeden. In dit experiment vereist een optimale expressie van de α1S-subeenheid van CaV1.1 met een CMV-promotor 4 tot 6 weken, maar kan worden gedetecteerd vanaf 2 weken gedurende maximaal 12-15 maanden.

Figure 2
Figuur 2: Diagram van cDNA-injectie en elektroporatie-elektroporatie-elektrodepositionering in een muisvoetkussen voor elektroporatie. (A) Naaldpositie voor hyaluronidase en cDNA-injectie onder een voetkussen van de muis. De pijl geeft het punt van inbrenging door de huid aan. (B) Lichte verkleuring van de huid en lichte toename van de pootgrootte moeten na injectie tijdelijk worden waargenomen. (C) Positionering van de elektrode-array voor elektroporatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Spierdissectie en vezelisolatie

OPMERKING: Skeletspiervezeldissociatie werd uitgevoerd zoals eerder beschreven 37,40,41 met modificaties. In het volgende gedeelte is het protocol geschikt voor twee voetzolen van de muis.

  1. Bereid vóór de vezeldissociatie de met sylgard bedekte plaat voor door een deel van het uithardingsmiddel toe te voegen aan 10 delen elastomeer (% m / w) in een plastic petrischaal van 60 mm om een dikte van ~ 5 mm te bereiken. Laat de met elastomeer bedekte plaat een nacht uitharden voor gebruik. Dit kan meerdere keren worden hergebruikt als het goed wordt bewaard en gedesinfecteerd met 70% ethylalcohol voor en na gebruik.
  2. Bereid 4 mg collagenase type I in 2 ml spinner minimum essential eagle's medium (S-MEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS; eindconcentratie van 2 mg/ml). Breng de oplossing over op een niet-gecoate plastic plaat van 35 mm en plaats de schaal in een incubator bij 37 °C, 5% CO2.
    OPMERKING: S-MEM is een gemodificeerde MEM-formulering zonder glutamine en Ca2+. De afwezigheid van Ca2+ in deze stap vermindert vezelcontractuur tijdens enzymatische spijsvertering en trituratie.
  3. Voeg 5 ml S-MEM aangevuld met 10% FBS toe in een 60 mm niet-gecoate kunststofplaat en bewaar in de incubator bij 37 °C, 5% CO2.
  4. Euthanaseer de dieren door verstikking via CO2 gevolgd door cervicale dislocatie. Om besmetting tijdens primaire celisolatie te verminderen, dompelt u het dierlijke karkas onder in 70% ethylalcohol gedurende ~ 10 s. Verwijder en droog het karkas met absorberend papier en knip de voeten met een schaar tussen de enkel en de knie (figuur 3A).
  5. Pin een voet van het dier, met de poot naar boven gericht, met dissectiepennen op de met elastomeer bedekte plaat onder een dissectiemicroscoop bij 10x vergroting.
  6. Verwijder met een dissectieschaar en een fijn pincet de huid van de poot om de flexor digitorum brevis (FDB) spier bloot te leggen (figuur 3B). Om uitdroging van het weefsel te voorkomen, voegt u een druppel S-MEM 10% FBS toe aan de spier met behulp van een pipet van 1.000 μL.
  7. Snijd ter hoogte van de hiel de pees in en ontleed de FDB-spier zorgvuldig van hiel tot teen (figuur 3B). Vermijd zoveel mogelijk spanning op de spier tijdens het uitvoeren van de dissectie. Te veel kracht die op de weefsels wordt uitgeoefend, zal resulteren in spiervezelschade. Plaats de spier onmiddellijk in de collagenase-oplossing.
  8. Herhaal stap 3.5-3.7 met de contralaterale voet. Plaats de ontleedde spier in de collagenase-oplossing in een 37 °C, 5% CO 2-incubator gedurende2 uur 45 minuten tot 3 uur 15 minuten. Pas de incubatietijd aan afhankelijk van de enzymatische activiteit van collagenase en de leeftijd van het dier.
  9. Terwijl het spierweefsel broedt, voegt u 300 μL koude MEM zonder serum of antibiotica toe in het midden van een schaal met glazen bodem van 35 mm. Voeg 2 μL koud laminine van 1,20 mg/ml rechtstreeks toe aan de MEM. Herhaal het proces voor het gewenste aantal gerechten. Plaats de schalen in de celkweekincubator bij 37 °C, 5% CO2 gedurende ten minste 1 uur om lamininepolymerisatie mogelijk te maken.
  10. Wanneer de enzymatische vertering is voltooid, brengt u de spier over in de 60 mm celkweekschaal met S-MEM 10% FBS met behulp van een grote boring (5 mm) vuurgepolijst glazen Pasteur-pipet en een latexbol.
  11. Met behulp van een pasteurpipet met een kleinere boring (2 mm) vuurgepolijst glas en een latexbol tritueert u de spier voorzichtig onder een dissectiemicroscoop (figuur 3C). Gedissocieerde spiervezels moeten zich losmaken van het weefsel en worden vrijgegeven in de oplossing.
    OPMERKING: Als vuistregel geldt dat minder trituratie (15-30 pipetpassages) altijd de voorkeur heeft, omdat te veel langdurige trituratie de vezels kan belasten of zelfs beschadigen.
  12. Verwijder met een fijn pincet al het niet-spierweefsel, zoals zenuwen, pezen of bloedvaten (figuur 3D).
  13. Voeg 2 ml warme MEM 2% FBS toe aan elke schaal met een glazen bodem van 35 mm met laminine coating. Breng met behulp van een pipet van 200 μL en een steriele plastic pipetpunt de gedissocieerde spiervezels over naar de 35 mm met laminine beklede glazen bodemschaal (figuur 3E).
    OPMERKING: Het bereiken van een lage vezeldichtheid en het goed van elkaar scheiden van de vezels is belangrijk om overlapping van vezels te voorkomen.
  14. Plaats de schaal met glazen bodem van 35 mm in de incubator bij 37 °C, 5% CO2. Vezels kunnen worden gebruikt in een tijdsbestek van 2-20 uur.

Figure 3
Figuur 3; Spier FDB vezeldissectie en dissociatie. (A) Na voetdissectie boven de enkelarticulatie (stippellijn) wordt de huid onder de voetpoot verwijderd, waarbij de stippellijn wordt gevolgd om de FDB-spier bloot te leggen (B). De spier wordt ontleed en in collagenase-oplossing geplaatst. (C) Na incubatie wordt de spier getriatureerd om individuele spiervezels te dissociëren en te verkrijgen. (D) Fijne pincetten worden gebruikt om niet-spierweefsel en puin te verwijderen voordat spiervezels worden overgebracht naar de met laminine gecoate glazen bodemkweekschaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Beschrijving van de acquisitie-instellingen

OPMERKING: De acquisitie-opzet is vergelijkbaar met de voor42 beschreven opzet met wijzigingen (figuur 4A).

  1. Schakel alle componenten in: computer, AD / DA-converter en padklemversterker, microscoop, gemotoriseerde trap, manipulator (s), voeding voor de fotodiode, lichtbron, lichtsluiter, pulsgenerator en protocoleditor.
  2. Activeer de transistor-transistorlogica (TTL) die het OUT-signaal van de AD/DA activeert om de pulsgenerator, de lichtsluiter en de protocoleditor te bedienen.
  3. Gebruik het TTL-uitgangssignaal van de pulsgenerator en sluit aan op een AD-kanaal van de versterker om de precieze temporele triggering te controleren. Adequate controle van de triggerende consistentie moet voorafgaand aan het experiment zorgvuldig worden geëvalueerd om een adequate synchronisatie van het apparaat te garanderen.
    OPMERKING: Verwacht in het geval van CaV1.1 een maximaal signaal in minder dan 4-10 ms na stimulatie (tijd om maximale ladingsbewegingte ontwikkelen 5). Het signaal is snel en een nauwkeurige temporele resolutie is van cruciaal belang om te vergelijken met andere metingen, zoals calciumtransiënt of laadbeweging gemeten via spanningsklem.
  4. Om het excitatielicht op een specifiek gebied of een specifieke plek van de vezel te richten (figuur 4B), gebruikt u een diafragma dat zich in het excitatielichtpad bevindt. Dit maakt signaalacquisitie alleen mogelijk in een gebied waar het EGFP-CaV1.1-signaal maximaal is (figuur 4B).

Figure 4
Figuur 4: Beschrijving van het registratiesysteem. (A) Diagram dat het verband tussen de verschillende componenten van het registratiesysteem illustreert. De opstelling bestaat uit een omgekeerde microscoop met een gemotoriseerde trap, een light emitting diode (LED) lichtbron, een lichtsluiter, een op maat gemaakt fotodiode-gebaseerd lichtbewakingscircuit met een track and hold-functie43, een AD/DA-converter (van een patchklemversterker), een analoge pulsgenerator, een externe veldstimulatie-eenheid gekoppeld aan veldstimulatie-elektroden, gemotoriseerde manipulatoren en commerciële software voor de aanschaf, synchronisatie en generatie van protocollen. De elektrode voor veldstimulatie is gemaakt van twee platinadraden die aan koperen kabels zijn gelast die via een BMC-connector met de pulsgenerator zijn verbonden. Specifieke excitatie- en emissiefilters worden gebruikt om zowel EGFP- als MTS-5-TAMRA-signalen te detecteren. Om EGFP te prikkelen, wordt een xenonlamp met een 488 nm (± 20 nm) excitatiefilter (Ex) en een LP510 nm Em-filter gebruikt. Voor MTS-5-TAMRA wordt een 530 nm LED-lichtbron en een LP550 nm Em-filter gebruikt. (B) Weergave van een vezel die een EGFP-CaV1.1-cys-constructie uitdrukt met de tweeveldsstimulatie-elektroden (zwarte cirkels) goed georiënteerd (links) en onjuist (rechts) in de hoofdas van de vezels (stippellijn). De zwarte niet-gevulde cirkel vertegenwoordigt het gebied van acquisitie met een diameter die wordt geregeld door de membraanopening, geplaatst voor de lichtbron. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Beoordeling van EGFP-positieve vezel elektrische activiteit en cysteïnekleuring

OPMERKING: Skeletspiervezelveldstimulatie wordt uitgevoerd zoals beschreven vóór41 met wijzigingen. Deze aanpak wordt gebruikt om (1) gezonde, functionele en elektrisch reagerende vezels te identificeren, (2) de vezels te kleuren met de cysteïne-reactieve fluorescerende kleurstof en (3) het fluorescerende signaal op te nemen als reactie op de gepropageerde actiepotentiaal. Elke stap van deze sectie en de volgende moet worden uitgevoerd in een omgeving met weinig licht om het bleken van fluorescerende kleurstoffen te verminderen.

  1. Plaats de 35 mm glazen bodemschaal met gedissocieerde spiervezels op het podium van de microscoop. Verwijder de kweekmedia voorzichtig met een pipet van 1.000 μL en vervang deze door 2 ml ringeroplossing op kamertemperatuur (zie tabel 1 voor de samenstelling). Meerdere rondes van mediavervanging kunnen nodig zijn om de oorspronkelijke celkweekmedia die vrije cysteïnes bevatten volledig te verwijderen.
  2. Plaats met behulp van een mechanische of gemotoriseerde manipulator de twee platinadraden loodrecht op de bodem van de schaal. Zorg ervoor dat de elektrodeklemmen zijn uitgelijnd ten opzichte van de lengteas van de vezel en op een paar millimeter afstand van de uiteinden van de vezel, en dat de scheiding tussen de elektroden 5 mm is (figuur 4B). Pas de positie van de elektrode verder aan door de schotel te draaien of elke elektrode op een onafhankelijke micromanipulator te monteren (figuur 4B).
  3. Schakel het doorgelaten licht in en zoek de vezels in het gezichtsveld met behulp van een 20x-objectief. Verplaats de EGFP-filterkubus naar het lichtpad.
    OPMERKING: Met behulp van een microscoop uitgerust met epifluorescentie en een lage vergroting (2x) objectief, is het mogelijk om de constructtransfectie-efficiëntie in de hele spier vóór vezeldissociatie te beoordelen door EGFP-expressie te beoordelen (figuur 5A).
  4. Activeer met behulp van een op afstand bedienbare lichtsluiter het 488 nm excitatielicht om de EGFP-positieve vezels te identificeren. Bewaar de vezel x-y locatie op de schaal met behulp van een gemotoriseerde microscooptrap. Het EGFP-signaal is vaak heterogeen binnen de vezel (figuur 4B). Centreer de opgeslagen positie naar het helderste EGFP-signaal.
  5. Na het identificeren van EGFP-positieve vezels, keert u terug naar de eerste opgeslagen lokalisatie. Met behulp van een handmatige triggerschakelaar levert u twee sequentiële stimulatiepulsen met een duur van 1 ms en een amplitude van 20 V. Stel de polariteit van de pulsen in op afwisselend.
  6. Observeer na de stimulatie twee concentrische homogene vezelcontracties als reactie op de twee pulsen van tegengestelde polariteit. Een lokale contractie of de afwezigheid van contractie in reacties op pulsen van alternatieve polariteit duiden op lokale niet-gepropageerde passieve responsen of onexcitabiliteit41. Sluit deze vezels uit voor de rest van het experiment.
  7. Voeg 2 μL 10 mM MTS-5-TAMRA oplossing direct toe aan de schaal en meng voorzichtig met een pipet van 1.000 μL (10 μM eindconcentratie). Zorg ervoor dat u de schotel niet verplaatst, anders gaan de opgeslagen vezelposities verloren. Incubeer gedurende 4-5 minuten om diffusie van het fluorescerende thiolmolecuul in het lumen van het transversale tubulussysteem mogelijk te maken.
  8. Pas bipolaire repetitieve stimulaties toe om opeenvolgende actiepotentiaaltreinen op te roepen met een snelheid van 50 Hz gedurende 300 ms elke 1 s gedurende 5 minuten.
    OPMERKING: De pulstreinen geven toegang tot de cysteïnes die in de S4 van EGFP-CaV1.1 zijn ingebracht om te reageren met MTS-5-TAMRA. Het vermogen van de vezel om mechanisch samen te trekken als reactie op stimulatie is belangrijk voor de transversale tubuluslumeninhoud om te fietsen met de extracellulaire omgeving.
  9. Verwijder de kleuringsoplossing uit de schaal met een pipet van 1.000 μL en vervang deze door 2 ml ringeroplossing op kamertemperatuur. Twee of drie rondes kunnen nodig zijn om niet-geconjugeerde MTS-5-TAMRA volledig te verwijderen. Laat de gekleurde vezel minstens 10 minuten herstellen van het kleuringsprotocol.
  10. Beoordeel net als in stap 5.6 de vezelgezondheid en elektrische activiteit opnieuw door symmetrische vezelcontractie te observeren als reactie op wisselende polariteit. Sluit vezels die niet reageren op beide stimulaties uit van de rest van het experiment.
  11. Verplaats de MTS-5-TAMRA filterkubus naar het lichtpad. Activeer met behulp van een op afstand bedienbare lichtsluiter het excitatielicht van 533 nm om homogene MTS-5-TAMRA-kleuring op de vezels te bevestigen.
    OPMERKING: Bij kleuring met MTS-5-TAMRA reageren zowel gemanipuleerde als endogene cysteïnes met het maleimidederivaat (figuur 5B). Het is dus moeilijk om de juiste reactie met de cysteïne van belang te evalueren. CaV1.1 komt voornamelijk tot uiting in de dwarsbuis, waardoor een herkenbaar dubbelbandpatroon ontstaat. Met behulp van een confocale of epifluorescentiemicroscoop kan een x-y-beeld worden gebruikt om de juiste kleuring en transversale tubulusinvoer en diffusie van MTS-5-TAMRA te bevestigen (figuur 5C).

6. Signaalacquisitie en -verwerking

OPMERKING: Voordat fluorometrische metingen worden uitgevoerd, moet de signaalacquisitie zorgvuldig worden ontworpen om de optimale signaal/ruisverhouding te verkrijgen. Langzamere bemonsteringsfrequenties maken meer lichtdetectie mogelijk, terwijl het aantal punten dat zou worden verkregen tijdens de herschikking van de eiwitconformatie wordt verminderd. In het geval van EGFP-CaV1.1-cys treedt ladingsbeweging geïnduceerd door een actiepotentiaalgolfvorm op in ~1-10 ms37. Om meerdere punten te verkrijgen om de evolutie van de beweging in de loop van de tijd te volgen, werd de acquisitie ingesteld op 50 μs per punt.

  1. Plaats de vezel in het midden van het gezichtsveld met een goed vergrotingssysteem. Voor deze experimenten werd een 60x olie 1.4 numeriek diafragma (NA) omgekeerd objectief gebruikt. Optimaliseer de verlichting en de vezelpositie met de gemotoriseerde trap en het membraan om een cirkelvormig gebied van de diameter van de vezel te verlichten, waar het EGFP-signaal maximaal is (figuur 4B).
  2. Zodra de vezel is gepositioneerd voor acquisitie, oriënteert u de twee onafhankelijk gemonteerde veldstimulatie platinadraden aan elk uiteinde van de vezel. Lijn de draden op de hoofdas van de vezels in een rechte lijn uit en plaats ze 5 mm uit elkaar met de vezel in het midden (figuur 4B).
  3. Stel de excitatie- en emissiefilters voor acquisitie in op de juiste instellingen voor MTS-5-TAMRA. Start het experiment door het protocol uit te voeren dat in de acquisitiesoftware is geschreven. Deze stap activeert alle stroomafwaartse apparaten (d.w.z. protocoleditor, lichtsluiter, pulsgenerator).
    OPMERKING: Dit protocol staat een korte periode (d.w.z. 10 ms) van basislijnacquisitie toe vóór de levering van de veldstimulus om latere metingen van fluorescentie in rust mogelijk te maken.
  4. Initieer een enkele of een trein van actiepotentialen met een 0,5 of 1 ms, 20 V vierkante puls. Minimaliseer de totale acquisitietijd zoveel mogelijk om signaalverbleking te voorkomen.
    OPMERKING: Zelfs als opname in het midden van de vezel, kan een bewegingsgerelateerd fluorescentiesignaal optreden en kan het worden verward met het fluorescerende signaal als gevolg van eiwit-fluorofoor conformatieverandering (figuur 5D). Het contractie-geïnduceerde signaal moet worden vertraagd in vergelijking met de verwachte tijd van laadbeweging na stimulatie37.
  5. Om het signaal afkomstig van S4-bewegingen verder te onderscheiden van dat als gevolg van vezelcontractie, voegt u 1 μL 100 mM N-benzyl-p-tolueensulfonamide (BTS; 50 μM eindconcentratie) toe aan de opnameoplossing om contractiele reacties te minimaliseren en herhaalt u stap 6.4. Signalen die voor een tweede keer worden gedetecteerd na farmacologische immobilisatie van vezels komen overeen met de moleculaire beweging van de gelabelde S4-helix (figuur 5D).
    OPMERKING: Er mag geen signaal worden gedetecteerd in de controle EGFP-CaV1.1 zonder engineered cysteïne na bewegingsonderdrukking met BTS.
  6. Gebruik dezelfde instellingen om een vergelijkbaar signaal te verkrijgen op een locatie in de schotel waar geen spiervezels of puin aanwezig zijn om een waarde van achtergrondfluorescentie te verkrijgen.
  7. Importeer de bestanden die het tijdsverloop van de ruwe fluorescentie [Fr(t)] van de vezel en achtergrondfluorescentie [Fb(t)] bevatten in de data-analysesoftware. Gemiddelde van de kolom die Fb(t) bevat om een homogene Fb-waarde te verkrijgen. Trek Fb af van de Fr(t) om de absolute fluorescentiewaarden [F(t)] te verkrijgen. Strijk het resulterende signaal indien nodig glad met een afvlakfunctie.
    OPMERKING: Met dit detectiesysteem en de frequentie van acquisitie hebben we besloten om een aangrenzende middelingsfunctie te gebruiken met een venster van 50 punten voor het gladstrijken.
  8. Gemiddelde van de baseline F(t) waarden in een tijdsinterval van 10 ms vóór de stimulatie om een rustfluorescentiewaarde (F0) te verkrijgen. Trek F0 af van de afgevlakte F(t) om de absolute verandering in fluorescentie [ΔF(t)] te verkrijgen. Om vervolgens de fluorescentieverandering in de tijd uit te drukken ten opzichte van de fluorescentie in rust (ΔF/F0), deelt u ΔF(t) door F0.
  9. Om de mate van signaalbleking te evalueren, definieert u twee punten van het ΔF / F0 in de loop van de tijd signaal, voor en na de stimulatie en weg van het fluorometrische signaal. Pas een lineaire functie toe aan deze twee punten om een basislijnspoor te verkrijgen. Trek de basislijn na verloop van tijd af naar ΔF/F0 om te corrigeren voor signaalbleking.
  10. Trek van de tijdkolom de vertraging af tussen acquisitie-initiatie en het feedbacksignaal van de stimulatie, zodat t = 0 overeenkomt met het begin van de elektrische stimulus.
    OPMERKING: Om meerdere signaalvergelijkingen mogelijk te maken, is het vaak nodig om de amplitude van het signaal te normaliseren. Verschillende benaderingen kunnen worden gebruikt, afhankelijk van het doel van het experiment. In de volgende resultatensectie waren we geïnteresseerd in signaalkinetiek, dus gebruikten we een eenvoudige methode die bestond uit het normaliseren van elk signaal met de minimaal bereikte waarde (d.w.z. de negatieve piek).

Figure 5
Figuur 5: Beeldvorming van spiervezels die EGFP-CaV1.1-cys tot expressie brengen zonder en met MTS-5-TAMRA-kleuring en representatieve ruwe fluorometrische registratie. (A) Voorbeelden van verzonden (links) en fluorescerende (rechts) beelden van de ontleedde, niet gedissocieerde spier die een EGFP-CaV1.1 VSD-III-construct tot expressie brengt. Schaalbalk: 100 μm. (B) Representatief beeld van een spiervezel die een EGFP-CaV1.1 VSD-III-construct tot expressie brengt vóór (links) en na (rechts) MTS-5-TAMRA-kleuring. Endogene cysteïnes van niet-getransfecteerde vezels worden ook gekleurd door de kleurstof. Schaalbalk: 30 μm. (C) Confocale afbeelding van een EGFP-Ca V 1.1 VSD-III-constructie (links) en MTS-5-TAMRA-kleuring (rechts) tonen een klassiek dubbelbandpatroon dat kenmerkend is voor CaV1.1-lokalisatie op het transversale tubulussysteem van de spiervezel (onder). Schaalbalk: 25 μm. (D) Representatieve fluorometrische registratie als reactie op twee stimuli en gemeten met een fotodiode vóór (blauw spoor) en na (rood spoor) vezelimmobilisatie met N-benzyl-p-tolueensulfonamide (BTS). De bovenste zwarte lijn geeft het protocol aan voor vezeldepolarisatie via externe veldstimulatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Wanneer voortplantende actiepotentialen worden geactiveerd als reactie op repetitieve veldstimulatie, is het mogelijk om specifieke spanningssensorbewegingen te volgen als reactie op een specifieke frequentie van depolarisatie. Zoals weergegeven in figuur 6A, kan de beweging van VSD-II-gelabelde helices worden gevolgd als reactie op elk van de twee opeenvolgende depolarisaties toegepast op 10 Hz (d.w.z. met een afstand van 100 ms). Signaalverbleking kan worden gecorrigeerd door de basislijn af te trekken van het spoor (figuur 6B). Verdere tijdsvergroting op de eerste en tweede respons (figuur 6C) maakt nauwkeurige observatie van deze zich snel ontwikkelende VSD-II helixbewegingen mogelijk. De tijdmarkering van de veldstimulatietrigger maakt relatieve temporele uitlijning van de eerste en tweede respons mogelijk met een precisie van 10 μs. Beide signalen kunnen worden genormaliseerd door hun respectieve minimumwaarde (d.w.z. minimale piek) om een kinetische vergelijking tussen de twee responsen mogelijk te maken (figuur 6D). Uit deze opnames van relatieve fluorescentie kan worden afgeleid dat de tijd tot piek vergelijkbaar is tussen opeenvolgende depolarisaties voor deze spanningssensor.

Deze benadering kan worden gebruikt om de beweging van individuele spanningssensoren te volgen met verschillende frequenties van depolarisatie en meerdere actiepotentialen om hun activering en relatie met ladingsbeweging, calciumstroom of calciumtransiënten te bestuderen, die parallel kunnen worden bestudeerd in een andere set vezels, zoals eerder gemeld37.

Figure 6
Figuur 6: Representatieve fluorometrische registratie van EGFP-CaV1.1 VSD-II veroorzaakt door twee opeenvolgende depolarisaties bij 10 Hz. (A) ΔF/F0 fluorometrisch signaal in een vezel die EGFP-Cav1.1 VSD-II tweemaal stimuleert bij 10 Hz en een basislijncorrectiecurve (paars). De bovenste zwarte lijn geeft geïnduceerde depolarisatie aan. (B) ΔF/F0 baseline gecorrigeerd signaal van de twee onafhankelijke responsen (C). De waarden op het waarnemingspunt komen overeen met het minimale bereik op de piek. (D) Signaaluitlijning ten opzichte van depolarisatie en normalisatie door hun respectieve minimale piek toont VSD-II-domeinbeweging met vergelijkbare kinetiek voor beide stimuli. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Reagentia Eindconcentratie (mM) Molecuulgewicht g/l
NaCl 150 58.44 8.766
Kcl 4 74.55 0.298
CaCl2 2 110.9 0.222
MgCl2 1 95.22 0.095
D-glucose 5 180.2 0.901
HEPES 10 238.3 2.383
pH aangepast naar 7,4 met 1 M NaOH

Tabel 1: Gewijzigde samenstelling van de Ringer-oplossing.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier wordt een stapsgewijs protocol beschreven om FSDF in spiervezels uit te voeren voor de studie van individuele spanningssensorbewegingen van het CaV1.1-kanaal. Hoewel het aantal stappen en de diversiteit aan benaderingen die in deze techniek worden gecombineerd complex lijken, worden de meeste van deze technieken vaak routinematig gebruikt in laboratoria van biofysici / celbiologen. De schijnbare complexiteit ligt dus vooral in de combinatie van alle verschillende benaderingen in één geïntegreerde techniek. Vaak is bij het uitvoeren van een meerstappenmethode de impact van kleine wijzigingen die aan het begin zijn uitgevoerd pas later in de volgende stappen detecteerbaar. Met striktheid in de ontwikkeling van elke stap en nauwkeurige in- en uitsluitingscriteria, is het mogelijk om meerdere opnames van hetzelfde preparaat of zelfs dezelfde vezel te verkrijgen.

De hier beschreven benaderingen kunnen worden aangepast aan andere celtypen, waaronder hartcellen en neuronen. Daarnaast zouden verschillende detectiesystemen, zoals hogesnelheidscamera's, kunnen worden gebruikt. Momenteel is het gebruik van spanningsklem (patchklem of spanningsklem met twee elektroden) beperkt vanwege de extra complexiteit die inherent is aan deze technieken44. Verbeteringen aan de hier gepresenteerde methode (zoals helderdere en meer fotografische sondes) zullen het gelijktijdige gebruik van FSDF met spanningsklemmethoden vergemakkelijken.

Veldstimulatie in inheemse gedissocieerde skeletspiervezels heeft het voordeel dat het een hogere doorvoer heeft dan spanningsklem en kan worden toegepast voor de studie van andere signalen, zoals actiepotentiaalvoortplanting45 of actiepotentiaal-opgewekte calciumtransiënten41.

Het belangrijkste voordeel van deze inheemse cel FSDF in vergelijking met het heterologe expressiesysteem is het vermogen om eiwitconformatieveranderingen te detecteren als reactie op geïnduceerde depolarisatie in zijn fysiologische omgeving en door zijn endogene stimulus. Het is vooral relevant voor de studie van CaV1.1, dat fungeert als de spanningssensor voor een ander calciumkanaal, de ryanodinereceptor type 1 (RyR1), ingebracht in het afzonderlijke sarcoplasmatisch reticulummembraandomein 5,33,35. In de praktijk zou het mogelijk kunnen zijn om de gelijktijdige meting van fluorescerende signalen van een spanningssensor met calciumafgifte uit het sarcoplasmatisch reticulum te bestuderen met behulp van een geschikte calciumfluorescerende indicator. Bovendien, aangezien is aangetoond dat veel eiwitten uit de triadische omgeving CaV1.1 gating 46,47,48,49,50 kunnen beïnvloeden, is de studie van de beweging van de spanningssensor in een spiervezel van hoge fysiologische relevantie. Twee grote nadelen van de aanpak zijn: 1) kleine amplitude van de gemeten signalen, en 2) fotobleaching, waardoor het gebruik van repetitieve en/of langdurige prikkels wordt uitgesloten. Verbeteringen aan deze techniek zijn nodig en zullen het mogelijk maken om FSDF te combineren met spanningsklemexperimenten in volwassen spiervezels.

De toepassing van FSDF op andere kanalen (of receptoren) in spiervezels is haalbaar, op voorwaarde dat: (1) ze op een voldoende niveau tot expressie worden gebracht, (2) ze toegankelijk zijn (vanuit de extracellulaire of intracellulaire ruimte) en (3) de cysteïnemodificatie via mutagenese de kanaalfunctie niet schaadt. Het complementaire gebruik van FSDF in zowel heterologe als inheemse spiervezels is noodzakelijk en zal van cruciaal belang zijn voor het beantwoorden van onbeantwoorde vragen met betrekking tot spanningsafhankelijke CaV1.1-overgangen die van cruciaal belang zijn voor de spierfunctie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs melden geen belangenverstrengeling.

Acknowledgments

We danken Dr. J. Vergara (University of California, Los Angeles) voor het delen van het EGFP-CaV1.1 (konijn) wild-type plasmide. We danken het Yale Department of Physiology Electronics Laboratory en in het bijzonder Henrik Abildgaard voor het ontwerp en de bouw van de fotodiode met track and hold circuit. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health subsidies R01-AR075726 en R01-NS103777

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hyaluronidase SIGMA ALDRICH H3884-50mg
0.5 mL Eppendorf tube Millipore Sigma EP022363719-500EA
1 mL syringe Millipore Sigma Z683531-100EA tuberculine slip tip
1/2” long 29-gauge sterile insulin needle and syringe Becton Dikinson 324702
35 mm non coated plastic plate Falcon, Corning 353001
60 mm non coated plastic plate Falcon, Corning 351007
Alcoholic whip PDI B60307
Alexa-533 cube LP Chroma 49907 Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp
Arc lamp Sutter Instrumets LB-LS 672
Artificial tears cream Akorn NDC 59399-162-35
Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4" VWR 14672-200
BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide) SIGMA ALDRICH 203895
collagenase type I SIGMA ALDRICH C0130-1g
Cotton tip VWR VWR-76048-960-BG
Double electrode array  (for electroporation) BTX harvard apparatus 45-0120 10mm 2 needle array tips
EGFP cube Chroma 39002AT Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m
Electroporation apparatus device BTX harvard apparatus ECM 830
EPC10 HEKA Elektronik GmbH  (Harvard Bioscience) 895000
FBS Biotechne,  R&D Systems RND-S11150H Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated
glass coverslip 35 mm dish MatTek Life Science P35G-1.5-14-C
Isoflurane Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation 502017-250ml
Isothermal heating pad Braintree scientific inc 39DP
Laminin Thermo Fisher INV-23017015 Laminin Mouse Protein, Natural
Latex bulb VWR 82024-554
LED 530 nm Sutter Instrumets 5A-530
Low binding protein 0.2 μm sterile filter Pall FG4579 acrodisk  syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic
MEM Invitrogen INV-11380037
MTS-5-TAMRA Biotium 89410-784 MTS-5-TAMRA
OriginPro Analysis Software OriginLab Corporation OriginPro 2022 (64-bit) SR1
Photodiode Custom Made NA
PlanApo 60x oil  1.4 N.A/∞/0.17 Olympus BFPC2
Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis SIGMA 267228-1G To manufacture field stimulation electrode
Pulse Generator WPI Pulsemaster A300
Shutter drive controller Uniblitz 100-2B
Shuttter Uniblitz VS2582T0-100
S-MEM Invitrogen INV-11380037
Sterile bench pad VWR DSI-B1623
Sterile saline SIGMA ALDRICH S8776
Sylgard 184 Silicone Elastomer kit Dow Corning 1419447-1198
Vaporizer for Anesthesia Parkland Scientific V3000PK
Voltage generator Custom Made NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Catterall, W. A., Wisedchaisri, G., Zheng, N. The chemical basis for electrical signaling. Nature Chemical Biology. 13 (5), 455-463 (2017).
  2. Armstrong, C. M., Hille, B. Voltage-gated ion channels and electrical excitability. Neuron. 20 (3), 371-380 (1998).
  3. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
  4. Armstrong, C. M., Bezanilla, F. Currents related to movement of the gating particles of the sodium channels. Nature. 242 (5398), 459-461 (1973).
  5. Schneider, M. F., Chandler, W. K. Voltage dependent charge movement of skeletal muscle: a possible step in excitation-contraction coupling. Nature. 242 (5395), 244-246 (1973).
  6. Bezanilla, F. Gating currents. The Journal of General Physiology. 150 (7), 911-932 (2018).
  7. Bezanilla, F. The voltage sensor in voltage-dependent ion channels. Physiological Reviews. 80 (2), 555-592 (2000).
  8. Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science. 271 (5246), 213-216 (1996).
  9. Akabas, M. H. Cysteine modification: probing channel structure, function and conformational change. Advances in Experimental Medicine and Biology. 869, 25-54 (2015).
  10. Priest, M., Bezanilla, F. Functional site-directed fluorometry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 869, 55-76 (2015).
  11. Cha, A., Bezanilla, F. Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence. Neuron. 19 (5), 1127-1140 (1997).
  12. Pantazis, A., Savalli, N., Sigg, D., Neely, A., Olcese, R. Functional heterogeneity of the four voltage sensors of a human L-type calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (51), 18381-18386 (2014).
  13. Savalli, N., Kondratiev, A., Toro, L., Olcese, R. Voltage-dependent conformational changes in human Ca(2+)- and voltage-activated K(+) channel, revealed by voltage-clamp fluorometry. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (33), 12619-12624 (2006).
  14. Zheng, J., Zagotta, W. N. Gating rearrangements in cyclic nucleotide-gated channels revealed by patch-clamp fluorometry. Neuron. 28 (2), 369-374 (2000).
  15. Bannister, J. P. A., Chanda, B., Bezanilla, F., Papazian, D. M. Optical detection of rate-determining ion-modulated conformational changes of the ether-à-go-go K+ channel voltage sensor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (51), 18718-18723 (2005).
  16. Bruening-Wright, A., Elinder, F., Larsson, H. P. Kinetic relationship between the voltage sensor and the activation gate in spHCN channels. The Journal of General Physiology. 130 (1), 71-81 (2007).
  17. Osteen, J. D., et al. KCNE1 alters the voltage sensor movements necessary to open the KCNQ1 channel gate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (52), 22710-22715 (2010).
  18. Smith, P. L., Yellen, G. Fast and slow voltage sensor movements in HERG potassium channels. The Journal of General Physiology. 119 (3), 275-293 (2002).
  19. Gonzalez, C., Koch, H. P., Drum, B. M., Larsson, H. P. Strong cooperativity between subunits in voltage-gated proton channels. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (1), 51-56 (2010).
  20. Gandhi, C. S., Olcese, R. The voltage-clamp fluorometry technique. Methods in Molecular Biology. 491, 213-231 (2008).
  21. Horne, A. J., Fedida, D. Use of voltage clamp fluorimetry in understanding potassium channel gating: a review of Shaker fluorescence data. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 87 (6), 411-418 (2009).
  22. Zhu, W., Varga, Z., Silva, J. R. Molecular motions that shape the cardiac action potential: Insights from voltage clamp fluorometry. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 120 (1-3), 3-17 (2016).
  23. Cowgill, J., Chanda, B. The contribution of voltage clamp fluorometry to the understanding of channel and transporter mechanisms. The Journal of General Physiology. 151 (10), 1163-1172 (2019).
  24. Catterall, W. A., Lenaeus, M. J., Gamal El-Din, T. M. Structure and pharmacology of voltage-gated sodium and calcium channels. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 60, 133-154 (2020).
  25. MacKinnon, R. Determination of the subunit stoichiometry of a voltage-activated potassium channel. Nature. 350 (6315), 232-235 (1991).
  26. Wu, J., et al. Structure of the voltage-gated calcium channel Ca(v)1.1 at 3.6 Å resolution. Nature. 537 (7619), 191-196 (2016).
  27. Capes, D. L., Goldschen-Ohm, M. P., Arcisio-Miranda, M., Bezanilla, F., Chanda, B. Domain IV voltage-sensor movement is both sufficient and rate limiting for fast inactivation in sodium channels. The Journal of General Physiology. 142 (2), 101-112 (2013).
  28. Cha, A., Ruben, P. C., George, A. L., Fujimoto, E., Bezanilla, F. Voltage sensors in domains III and IV, but not I and II, are immobilized by Na+ channel fast inactivation. Neuron. 22 (1), 73-87 (1999).
  29. Muroi, Y., Arcisio-Miranda, M., Chowdhury, S., Chanda, B. Molecular determinants of coupling between the domain III voltage sensor and pore of a sodium channel. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (2), 230-237 (2010).
  30. Savalli, N., et al. The distinct role of the four voltage sensors of the skeletal CaV1.1 channel in voltage-dependent activation. The Journal of General Physiology. 153 (11), e202112915 (2021).
  31. Muller, C. S., et al. Quantitative proteomics of the Cav2 channel nano-environments in the mammalian brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (34), 14950-14957 (2010).
  32. Perni, S., Lavorato, M., Beam, K. G. De novo reconstitution reveals the proteins required for skeletal muscle voltage-induced Ca2+ release. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (52), 13822-13827 (2017).
  33. Beam, K. G., Horowicz, P. Excitation-Contraction Coupling in Skeletal Muscle. , McGraw-Hill. New York. (2004).
  34. Schneider, M. F., Hernandez-Ochoa, E. O. Muscle: Fundamental Biology and Mechanisms of Disease. , Academic Press, Elsevier. 811-822 (2012).
  35. Rios, E., Pizarro, G. Voltage sensor of excitation-contraction coupling in skeletal muscle. Physiological Reviews. 71 (3), 849-908 (1991).
  36. Hernandez-Ochoa, E. O., Schneider, M. F. Voltage sensing mechanism in skeletal muscle excitation-contraction coupling: coming of age or midlife crisis. Skeletal Muscle. 8 (1), 22 (2018).
  37. Banks, Q., et al. Voltage sensor movements of CaV1.1 during an action potential in skeletal muscle fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (40), e2026116118 (2021).
  38. DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (32), e1520 (2009).
  39. Blunck, R., Starace, D. M., Correa, A. M., Bezanilla, F. Detecting rearrangements of shaker and NaChBac in real-time with fluorescence spectroscopy in patch-clamped mammalian cells. Biophysical Journal. 86 (6), 3966-3980 (2004).
  40. Liu, Y., Carroll, S. L., Klein, M. G., Schneider, M. F. Calcium transients and calcium homeostasis in adult mouse fast-twitch skeletal muscle fibers in culture. The American Journal of Physiology. 272 (6), C1919-C1927 (1997).
  41. Hernandez-Ochoa, E. O., Vanegas, C., Iyer, S. R., Lovering, R. M., Schneider, M. F. Alternating bipolar field stimulation identifies muscle fibers with defective excitability but maintained local Ca(2+) signals and contraction. Skeletal Muscle. 6, 6 (2016).
  42. Klein, M. G., Simon, B. J., Szucs, G., Schneider, M. F. Simultaneous recording of calcium transients in skeletal muscle using high- and low-affinity calcium indicators. Biophysical Journal. 53 (6), 971-988 (1988).
  43. Irving, M., Maylie, J., Sizto, N. L., Chandler, W. K. Intrinsic optical and passive electrical properties of cut frog twitch fibers. The Journal of General Physiology. 89 (1), 1-40 (1987).
  44. Hernandez-Ochoa, E. O., Schneider, M. F. Voltage clamp methods for the study of membrane currents and SR Ca(2+) release in adult skeletal muscle fibres. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 108 (3), 98-118 (2012).
  45. Banks, Q., et al. Optical recording of action potential initiation and propagation in mouse skeletal muscle fibers. Biophysical Journal. 115 (11), 2127-2140 (2018).
  46. Bannister, R. A. Bridging the myoplasmic gap II: more recent advances in skeletal muscle excitation-contraction coupling. The Journal of Experimental Biology. 219, 175-182 (2016).
  47. Bannister, R. A., Beam, K. G. Ca(V)1.1: The atypical prototypical voltage-gated Ca2+ channel. Biochimica et Biophysica Acta. 1828 (7), 1587-1597 (2013).
  48. Beard, N. A., Wei, L., Dulhunty, A. F. Ca(2+) signaling in striated muscle: the elusive roles of triadin, junctin, and calsequestrin. European Biophysics Journal. 39 (1), 27-36 (2009).
  49. Polster, A., Perni, S., Bichraoui, H., Beam, K. G. Stac adaptor proteins regulate trafficking and function of muscle and neuronal L-type Ca2+ channels. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (2), 602-606 (2015).
  50. Perni, S. The builders of the junction: roles of Junctophilin1 and Junctophilin2 in the assembly of the sarcoplasmic reticulum-plasma membrane junctions in striated muscle. Biomolecules. 12 (1), 109 (2022).

Tags

Biologie Nummer 196
Functionele site-directed fluorometrie in inheemse cellen om de prikkelbaarheid van skeletspieren te bestuderen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bibollet, H., Bennett, D. F.,… More

Bibollet, H., Bennett, D. F., Schneider, M. F., Hernández-Ochoa, E. O. Functional Site-Directed Fluorometry in Native Cells to Study Skeletal Muscle Excitability. J. Vis. Exp. (196), e65311, doi:10.3791/65311 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter